在天然化合物存在下测定完整β细胞线粒体功能的高分辨率呼吸
2018年1月23日
该协议的目的是测量葡萄糖介导的变化对线粒体呼吸的影响, 在天然化合物的存在, 在完整的832/13 β细胞使用高分辨率呼吸。
这种方法的总体目标是在胰岛素刺激条件下直接评估胰腺 β 细胞的呼吸功能。这也可以用来观察不同化合物对 β 细胞呼吸功能的影响。这种方法可以帮助回答胰腺 β 细胞生理学领域的关键问题，例如某种化合物是否通过呼吸变化影响胰腺 β 细胞功能。
该技术的主要优点是，在基础和胰岛素刺激条件下，它可用于直接评估胰腺 β 细胞的呼吸功能。这种方法的视觉演示至关重要，因为细胞制备和机器使用步骤很难学习，因为细胞制备和呼吸测量需要精度。首先，在补充的 RPMI 1640 中培养 INS-1 衍生的 832/13 β 细胞。
加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，从 T75 培养瓶中取出细胞。然后，通过添加 8 mL 完整 RPMI 1640 培养基来中和胰蛋白酶。在 900 微升 PBS 中稀释 100 微升细胞体积，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
然后，将细胞以每毫升 100 万个细胞的密度接种在 10 cm 培养皿中。在开始呼吸实验之前，在 37 摄氏度和 5% CO 2 的加湿培养箱中培养细胞。在 37 摄氏度和 5% CO2 的加湿培养箱中接种和培养 832/13 细胞 24 小时后更换培养基。
然后，用载体对照或可可衍生的表儿茶素单体处理细胞，最终浓度为 100 纳摩尔。添加培养物处理后，在 37 摄氏度和 5% CO2 的加湿培养箱中再培养 24 小时。然后，在 1x 低葡萄糖分泌测定缓冲液或 SAB 中洗涤细胞 5 分钟。
吸出缓冲液，将细胞在 1x 低葡萄糖 SAB 中孵育 3 小时，每小时更换一次缓冲液。孵育后，用 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶从培养皿中取出细胞。将用载体对照处理的培养皿中的胰蛋白酶中的细胞与 4 毫升 SAB 混合在 15 毫升锥形管中。
同样，将用目标化合物处理的培养皿与缓冲液混合。在 900 微升 PBS 中稀释 100 微升细胞体积，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。在 900 微升 PBS 中稀释 100 微升细胞体积，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
数据表明，每毫升 100 万个细胞的浓度是最有效的。按照文本方案中详述制备高分辨率呼吸计后，向每个氧合仪室中加入 2.4 毫升 1x 低葡萄糖 SAB 缓冲液。使用腔室中的磁力搅拌棒以 750 rpm 和 37 摄氏度的速度连续搅拌缓冲液，数据记录间隔为 2.0 秒。
为此，请选择 F7 按钮，然后打开标记为 systems 的选项卡。将柱塞完全推入，然后将它们缩回到扳手充气设置。让机器平衡至少 1 小时，直到获得稳定的氧通量。
接下来，在实验期间将机器设置为 37 摄氏度。按下 F7 按钮并打开标有 Oxygen O2 的选项卡，将极化电压设置为 800 毫伏，增益为 2。平衡 SAB 缓冲液的氧浓度至少 30 分钟，直到氧浓度变化稳定。
然后，通过按下 Shift 键，左键单击鼠标并在所选区域上拖动鼠标，选择氧浓度变化稳定的区域，以建立氧浓度变化的后台测量。单击与所选区域关联的字母，并将其更改为与两个腔室中的每一个对应的每条迹线的 R1。双击屏幕左下角和右下角的 O2 校准框。
单击空气校准的 Select Mark（选择标记）按钮作为 R1，然后选择两个腔室的 Calibrate and copy to clipboard（校准并复制到剪贴板）。接下来，在每个腔室中加载 2.4 毫升样品，在 1x 低葡萄糖 SAB 中加载一个装有对照载体处理细胞的腔室和一个带有化合物处理细胞的腔室。将柱塞完全推入并吸出残留体积。
在整个实验过程中，以 750 rpm 和 37 摄氏度的速度连续搅拌细胞，以进行所有后续步骤。通过单击 F4 并在加载样品时将标记标记为单元格来制作标记。测量样品 30 分钟。
信号稳定后，选择与低葡萄糖条件相对应的氧浓度变化区域。然后，使用注射器通过钛装载口将 12.5 微升 45% 无菌葡萄糖溶液添加到每个腔室中。添加处理剂时，做一个标有葡萄糖的标记。
让信号稳定并记录细胞呼吸，直到获得稳定的氧通量。此时，选择氧浓度变化的区域来表示 16.7 毫摩尔葡萄糖读数，这与刺激条件相对应。达到信号稳定后，通过上样口向每个腔室中加入 1 微升 5 毫摩尔寡霉素 A。
添加处理时，标记 OligoA。让信号稳定并记录细胞呼吸，直到获得稳定的氧通量。一旦获得稳定的氧通量，选择曲线的这个区域。
寡霉素 A 抑制 ATP 合酶，因此唯一发生的氧通量是通过电子泄漏而不是氧化磷酸化。接下来，以 1 微升的增量添加 1 毫摩尔的 FCCP，直到建立最大呼吸速率。这表示最大非耦合呼吸。
3 到 4 微升的 FCCP 足以诱导 INS-1 衍生的 832/13 β 细胞的最大解偶联呼吸。添加处理时，标记 FCCP。让信号稳定并记录细胞呼吸，直到获得稳定的氧通量。
然后，选择曲线的此区域。FCCP 是一种解偶联剂，可以测量解耦的呼吸。达到信号稳定后，通过加载端口向每个腔室中加入 1 微升 5 毫摩尔抗霉素 A。
添加处理时，制作标记为 AntiA 的标记，然后重复曲线选择程序。按下呼吸计分析程序的 F3 按钮，输入检测中使用的每毫升细胞数。将单位更改为每毫升细胞数，输入细胞浓度并将培养基更改为 SAB。
通过选择并输入氧气校准表，选择背景读数以标准化数据。从 2.5 毫摩尔葡萄糖、16.7 毫摩尔葡萄糖、寡霉素 A、FCCP 和抗霉素 A 中选择读数。在呼吸计分析程序中，输入蛋白质浓度并为呼吸测量期间的每次处理选择合适的平均值。然后，单击 F2 并单击 复制到剪贴板 功能。
这将导出数据以供其他分析程序使用。使用 O2 斜率负值进行计算。编译 3 到 5 次独立运行的载体处理的对照和天然化合物处理的细胞的数据，以确定对 INS-1 衍生的 832/13 β 细胞完整细胞呼吸的影响。
完整的 INS-1 来源的 832/13 β 细胞表现出葡萄糖诱导的氧利用率增加。使用适当数量的细胞至关重要。本实验中收集的结果表明，每毫升 100 万个细胞是最佳量。
用姜黄素处理的 INS-1 衍生的 832/13 β 细胞显示整体呼吸没有变化。相反，用单体可可表儿茶素处理的 INS-1 衍生的 832/13 β 细胞在 2.5 毫摩尔葡萄糖和 16.7 毫摩尔葡萄糖时呼吸增加。在泄漏状态（基础、非磷酸化呼吸状态）以及电子传递系统呼吸或 ETS 状态（最大呼吸）期间也观察到呼吸增加。
看完这个视频，你应该对如何在胰岛素刺激条件下直接评估胰腺 β 细胞的呼吸功能有一个很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住用低葡萄糖 SAB 缓冲液预处理细胞，并获得准确的细胞计数以进行检测。
通常，刚接触这种方法的人将难以获得正确数量的细胞以进行有效测量。细胞过多时，信号难以评估，而细胞太少时，信号不够高，无法持续测量。这项技术的影响延伸到糖尿病的治疗或诊断以及受胰腺 β 细胞功能变化影响的任何病症，因为线粒体呼吸是胰岛素分泌工作方式的关键组成部分。
在此程序之后，可以执行其他方法，例如葡萄糖刺激的胰岛素分泌，以回答其他问题，例如，这些化合物对胰岛素分泌有什么影响？虽然这种方法可以深入了解 β 细胞功能，但它也可以应用于其他系统，例如肌肉、肝脏、脂肪和其他线粒体呼吸分析。
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概述
本协议旨在评估胰腺β细胞的呼吸功能，特别是在胰岛素刺激条件下。它使用高分辨率呼吸测定法评估各种化合物对完整832/13β细胞线粒体呼吸的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生理学
- 代谢研究
背景
- 理解胰腺β细胞功能对糖尿病研究至关重要。
- 呼吸功能是细胞健康和代谢的关键指标。
- 天然化合物可能影响β细胞的呼吸和功能。
- 高分辨率呼吸测定法可精确测量线粒体活动。
研究目的
- 测量葡萄糖介导的线粒体呼吸变化。
- 评估天然化合物对β细胞功能的影响。
- 提供有关胰腺β细胞生理学的见解。
使用的方法
- 在补充的RPMI 1640中培养INS-1衍生的832/13β细胞。
- 利用高分辨率呼吸测定法测量呼吸。
- 在基础和胰岛素刺激条件下评估呼吸功能。
- 通过视觉演示帮助细胞制备和仪器使用。
主要结果
- 直接评估胰腺β细胞的呼吸功能。
- 观察化合物对呼吸的影响。
- 洞察β细胞对葡萄糖的生理反应。
- 确定影响β细胞代谢的关键因素。
结论
- 该方法对理解β细胞生理学至关重要。
- 高分辨率呼吸测定法提供有关线粒体功能的宝贵数据。
- 进一步的研究可以探索天然化合物的治疗潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial respiration in intact pancreatic beta cells provides critical mechanistic insights into glucose-stimulated insulin secretion, a core pathway in diabetes pathophysiology. This approach enables de-risking of natural compound effects on beta cell bioenergetics, supporting target validation and lead identification in metabolic disease programs. By quantifying oxygen flux under defined glucose and compound conditions, the method delivers predictive confidence for prioritizing modulators of beta cell function in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to changes in mitochondrial respiration, a key driver of insulin secretion.
- Operational Value: Enables functional validation of targets in a physiologically relevant, intact cell system under basal and stimulatory glucose conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that enhance or inhibit basal, leak, or maximal respiration states in beta cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative oxygen consumption data that can be normalized to cell count for reproducible compound screening.
- <Scalability: Supports testing of natural compounds like epicatechin and curcumin across glucose concentrations to define structure-activity relationships.
- Platform Reuse: Establishes a respirometry-based workflow applicable to other mitochondrial-dependent systems such as hepatocytes or myocytes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects mitochondrial function to insulin secretion, offering a translational biomarker for beta cell health in diabetes models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether compounds affect beta cell function via respiratory changes, reducing ambiguity in mechanism of action.
- <Preclinical Continuity: Provides mechanistic readouts that can inform follow-up assays like glucose-stimulated insulin secretion for integrated functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for metabolic disease programs focused on beta cell preservation or enhancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how compounds alter mitochondrial respiration in intact beta cells under insulin-stimulatory conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative oxygen flux outputs that enable comparison of compound effects across glucose levels.
- Analytics: Provides normalized respiration metrics (basal, leak, ETS states) that allow teams to rank compounds by bioenergetic impact.
- Translational Research: Links mitochondrial measurements to functional outcomes like insulin secretion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized respirometry platform for evaluating mitochondrial modulators across multiple cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving mechanistic ambiguity around compound effects on beta cell respiration.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantification of mitochondrial function using high-resolution respirometry with defined calibration and normalization steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked respirometry data that reduces late-stage failure risk in metabolic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on basal, ATP-linked, and maximal respiration in beta cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, trypsinization, and hemocytometer-based counting to ensure consistent cell density (1x10⁶ cells/mL).
- Dependent on high-resolution respirometer instrumentation with precise temperature, stir speed, and oxygen calibration controls.
- Necessitates cross-team standardization of SAB buffer preparation, glucose titration, and inhibitor injection protocols (Oligomycin A, FCCP, Antimycin A).
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to other cell types, including optimization of cell density and substrate/inhibitor concentrations.
- Limited by the need for meticulous cell preparation and machine equilibration, as signal stability is critical for accurate respiration measurement.
