高分辨率呼吸测定法评估透化细胞与完整细胞中的线粒体功能

本实验的总体目标是利用高分辨率呼吸测定法来测定线粒体的耗氧量。该方法有助于解答与线粒体功能障碍相关的综合征及疾病中的关键问题，例如：脓毒症、多种神经系统疾病以及衰老相关疾病。该技术的主要优势在于具有更高的灵敏度，并能够使用少量生物样本（如完整或透化细胞）进行底物耦合抑制剂滴定实验。

演示该实验步骤的是来自我实验室的技术员 Sandra Nansoz。在开始实验之前，先对极谱式氧传感器进行空气校准，然后将细胞重悬于呼吸缓冲液中，使其浓度为每毫升含1×10⁶个细胞，并将氧电极仪一个腔室中的呼吸介质更换为2.1毫升的细胞悬液。用塞子封闭腔室，并将腔室内的磁力搅拌子转速设定为每分钟700转。

然后记录细胞呼吸 5 到 10 分钟，直至获得稳定的氧气通量信号。接着使用注射器通过钛质进样口向氧电极室注入 2 微升鱼藤酮，并继续记录细胞呼吸 5 到 10 分钟。当氧气通量信号再次稳定后，依次注入 20 微升 1 摩尔的琥珀酸和 10 微升 0.5 摩尔的 ADP。

然后注入两微升浓度为二毫摩尔的皂苷（digitonin），每次注射后记录二至五分钟的细胞呼吸；随后逐步注射二至四微升浓度为二毫摩尔的皂苷，直至氧通量信号达到最大水平，且进一步注射皂苷不再增加呼吸速率。为评估线粒体外膜完整性，按照上述方法准备氧电极室，加入两微升浓度为八毫摩尔的皂苷以使细胞通透化。五分钟后，加入二十微升浓度为一摩尔的琥珀酸（succinate），记录五到十分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。

然后注入10微升0.5摩尔的ADP以刺激复合体II，并诱导耗氧量增加。当获得稳定的氧通量信号后，依次注入5微升4毫摩尔的细胞色素c，以及1微升4毫克/毫升的寡霉素。为测定肝细胞肝癌细胞的ADP刺激性呼吸，按照上述方法准备一个氧电极 chamber，并向氧电极室中注入2微升8毫摩尔的皂苷，使细胞透化5分钟，随后注入12.5微升0.8摩尔的苹果酸和10微升2摩尔的谷氨酸。

当氧通量达到稳定后，加入10微升0.5摩尔的ADP以增加耗氧量，随后加入2微升0.2毫摩尔的鱼藤酮和20微升1摩尔的琥珀酸。接着，加入2微升5毫摩尔的抗霉素并记录细胞呼吸。当信号下降并稳定后，加入2.5微升0.8毫摩尔的抗坏血酸，紧接着立即加入2.5微升0.2毫摩尔的TMPD，并持续记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升并稳定。

然后向氧电极室中加入10 µL 1摩尔的叠氮化钠，记录细胞耗氧直至氧通量信号下降并稳定。为测定完整细胞的耗氧量，按上述方法准备氧电极室，依次加入1 µL 4 mg/mL的抗霉素A，随后加入1 µL和3 µL的0.2 mmol/L FCCP。接着，通过每次加入1至3 µL浓度为0.2至1 mmol/L的FCCP，以0.1至0.3 µmol/L的增量逐步滴定FCCP，直至氧通量信号达到最大值且不再上升，随后开始下降。

然后，加入2 µL的0.2毫摩尔鱼藤酮和2 µL的5毫摩尔抗霉素A，记录呼吸情况，直至氧通量信号下降并稳定。在无皂苷素存在时，细胞呼吸非常微弱，完整且未透化的细胞在存在线粒体底物和ADP的情况下呼吸不受刺激。然而，随着皂苷素的逐步加入，细胞质膜逐渐透化，线粒体呼吸随之增强，直至完全透化，此时琥珀酸和ADP进入细胞。

然而，如果使用过量的皂苷（digitonin），可能会破坏线粒体外膜的完整性，导致依赖复合物的状态三呼吸下降。在经皂苷处理的细胞中，细胞色素 c 并不能增强依赖复合物的状态三呼吸，这表明细胞色素 c 未从线粒体外膜丢失，线粒体完整性得以保持；尽管在使用极高剂量皂苷处理的细胞中，细胞色素 c 可增强其呼吸作用。在皂苷透化后添加外源性线粒体复合物底物，可提高线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的最大呼吸速率。

呼吸水平降低可能是由于氧电极室被前次实验的线粒体抑制剂污染所致。在存在抗霉素A及依次加入FCCP的情况下，可观察到细胞的最大非耦联呼吸速率。一旦掌握，若操作得当，这些技术中的任何一项均可在不到一小时内完成。

在进行该实验操作时，必须牢记每次实验后需对氧电极室和塞子进行充分清洗。在完成本实验后，还可进一步开展其他检测方法，例如细胞ATP含量测定、胞质活性各组分分析以及线粒体底物水平检测等，以回答更多相关问题，例如呼吸速率的变化究竟是由于线粒体底物缺乏，还是ATP合酶活性降低所致。该技术建立之后，为生物能量学领域的研究人员探索线粒体功能开辟了道路，广泛应用于获得性与遗传性线粒体疾病、氧化应激、皮肤灌注损伤以及衰老等研究领域，适用于完整细胞、透化细胞或肌纤维以及分离线粒体的实验体系。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用高分辨率呼吸测定法在透化细胞和完整细胞中辅助线粒体功能。请务必注意，使用抗霉素A、鱼藤酮、叠氮化钠、FCCP和寡霉素时可能具有极高危险性，因此在进行该实验操作时，必须采取佩戴手套和实验服等防护措施。