Name: 高分辨率呼吸测量，以评估线粒体功能的通透和完整细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习高分辨率呼吸测量法评估通透和完整细胞的线粒体功能。该技术可检测脓毒症、神经系统疾病及衰老相关疾病中的线粒体功能障碍，具有高灵敏度和微量样本优势。

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本研究由瑞士国家科学基金会（项目编号 n&#186; 32003B_127619)

1. 细胞培养
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2、95%空气的培养箱中，使用含10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在25 cm2细胞培养瓶中培养人肝癌HepG2细胞6（接种密度：每25 cm2细胞培养瓶接种1 × 106个细胞，37 °C培养箱中培养时间：48小时，汇合时细胞密度：每25 cm2细胞培养瓶4-5 × 106个细胞）。</li>
	<li>当细胞融合度达到90%至95%时进行实验。</li>
</ol>
2. 极谱氧传感器的高分辨率呼吸测定校准
<ol>
	<li>用移液器将 2.1 ml 呼吸缓冲液加入氧电极测量室中，并在 37 °C 下使用测量室内磁力搅拌子持续搅拌（700 rpm）1 小时，直至极谱氧传感器获得稳定的氧通量信号。 
	注意：每个氧电极测量室内的极谱氧电极用于测定氧浓度，并计算各测量室内的氧消耗量（通量）。氧浓度和氧消耗速率（通量）通过数据采集与分析软件在计算机上实时在线显示。</li>
	<li>根据制造商的操作规程对极谱氧传感器进行空气校准14。 
	注意：呼吸介质中极谱氧传感器的校准以及实验温度下介质在空气饱和时的氧浓度测定，每天早晨仅需进行一次。此后可将介质从测量室中移除，并将细胞重悬于新鲜呼吸介质后加入氧电极测量室，测定呼吸速率。首次实验完成后，可清洗测量室，并在同一测量室中进行后续多组实验，无需再次校准。</li>
</ol>
3. 贴壁细胞的胰蛋白酶消化及细胞计数
<ol>
	<li>实验当天，吸除25 cm2细胞培养瓶中的DMEM培养基。</li>
	<li>用5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养瓶中的细胞单层。</li>
	<li>将0.5 ml浓度为25 mg/ml的胰蛋白酶溶液（预先在37 °C水浴中预热至37 °C）加入培养瓶的细胞单层中，并于37 °C培养箱（5% CO2，95%空气）中孵育5分钟。</li>
	<li>向培养瓶中已脱落的细胞加入5 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，并通过移液吹打使细胞重悬。</li>
	<li>将重悬的细胞转移至15 ml离心管中，在室温下以350 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 ml呼吸缓冲液13（表1）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用细胞计数仪对细胞进行计数，并用呼吸缓冲液将细胞重悬至终浓度为1 × 106 个细胞/ml。由于细胞呼吸速率将根据细胞数量进行标准化处理，因此应使用准确且精确的细胞计数仪进行计数。</li>
</ol>
4. 高分辨率呼吸测定法
<ol>
	<li>在完成空气校准后（每日仅需执行一次，参见步骤 2.1–2.2），从氧测定仪的检测室中吸出呼吸介质，并向检测室内加入 2.1 ml 来自步骤 3.7 的细胞悬液（1 × 106 个细胞/ml）。</li>
	<li>插入密封塞，关闭氧测定仪检测室。</li>
	<li>使用检测室内自带的磁力搅拌子在 37 °C 下持续搅拌细胞（700 rpm），并记录 5–10 分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。 
	注意：氧浓度和氧通量信号将通过数据采集与分析软件在计算机上实时在线显示14。</li>
	<li>随后，通过密封塞上的钛注射口，按照以下方案注入线粒体呼吸所需的底物和抑制剂。</li>
</ol>
5. 通过呼吸测定法对完整细胞进行皂苷素滴定
<ol>
	<li>按照方案中第4.1至4.3步所述步骤，准备含有细胞悬液（1 × 106/ml）的氧电极室。</li>
	<li>使用注射器通过氧电极塞上的钛注射口向含有细胞悬液的氧电极室中注入2 µl的0.2 mM鱼藤酮（0.2 µM）'CAUTION'，记录5-10分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。 
	注意：后续所有步骤中的注射均通过塞子上的钛注射口使用注射器完成。添加鱼藤酮为可选步骤（可防止逆向电子传递），在进行皂苷素滴定实验时可省略，见第6.3步。</li>
	<li>向氧电极室中注入20 µl的1 M琥珀酸（10 mM），记录5-10分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。</li>
	<li>向氧电极室中注入10 µl的0.5 M ADP（2.5 mM），记录5-10分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。</li>
	<li>向氧电极室中注入2 µl的2 mM皂苷素（2 µM），记录2-5分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧信号。</li>
	<li>再次向氧电极室中注入2 µl的2 mM皂苷素，记录2-5分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧信号。 
	注意：逐步向细胞中添加皂苷素将引起细胞耗氧量增加，氧通量信号随之上升。</li>
	<li>继续以每步2-4 µl的2 mM皂苷素（每步2-4 µM）逐步注入氧电极室。每步之后记录2-5分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。 
	注意：当氧通量信号达到最大水平且进一步注入皂苷素不再增加呼吸速率时，停止注射。读者应使用自身实验室的试剂确定最佳皂苷素浓度，并将所得的最佳浓度用于后续实验方案的第6.2和7.2步。</li>
</ol>
6. 线粒体外膜完整性的评估：细胞色素C
<ol>
	<li>按照方案中 4.1 至 4.3 步骤所述方法，准备含有细胞悬液（1 × 106/ml）的氧电极室。</li>
	<li>向含有细胞悬液（1 × 106/ml）的氧电极室中注入 2 µl 的 8 mM 皂苷（终浓度 8 µM），使细胞通透化，孵育 5 分钟。</li>
	<li>向氧电极室中注入 20 µl 的 1 M 丙二酸（终浓度 10 mM），记录细胞呼吸 5–10 分钟，直至获得稳定的氧通量信号。</li>
	<li>向氧电极室中注入 10 µl 的 0.5 M ADP（终浓度 2.5 mM），记录细胞呼吸 5–10 分钟，直至获得稳定的氧通量信号。 
	注意：向细胞中添加 ADP 将刺激复合体 I 活性，导致耗氧量增加，氧通量信号随之上升并趋于稳定。</li>
	<li>向氧电极室中注入 5 µl 的 4 mM 细胞色素 c（终浓度 10 µM），记录细胞呼吸 5–10 分钟，直至获得稳定的氧通量信号。</li>
	<li>最后向氧电极室中注入 1 µl 的 4 mg/ml 寡霉素（终浓度 2 µg/ml），持续记录细胞呼吸，直至氧通量信号达到稳定。</li>
</ol>
7. 通透化 HepG2 细胞的最大 ADP 刺激呼吸（状态 3）
<ol>
	<li>按照方案中 4.1 至 4.3 步骤所述方法，准备含有细胞悬液（1 × 106/ml）的氧电极室。</li>
	<li>向含有细胞悬液的氧电极室中加入 2 µl 的 8 mM 皂苷（终浓度 8 µM），使细胞通透化，孵育 5 分钟。</li>
	<li>向氧电极室中加入 12.5 µl 的 0.8 M 苹果酸（终浓度 5 mM）和 10 µl 的 2 M 谷氨酸（终浓度 10 mM），记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。</li>
	<li>向氧电极室中加入 10 µl 的 0.5 M ADP（终浓度 2.5 mM），记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升并趋于稳定。 
	注意：向细胞中加入 ADP 将引起耗氧量增加，氧通量信号随之上升。</li>
	<li>向氧电极室中加入 2 µl 的 0.2 mM 鱼藤酮（终浓度 0.2 µM）'CAUTION'，记录细胞呼吸，直至氧通量信号下降并趋于稳定。</li>
	<li>随后，向氧电极室中加入 20 µl 的 1 M 琥珀酸（终浓度 10 mM），记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升并趋于稳定。</li>
	<li>然后，向氧电极室中加入 2 µl 的 5 mM 抗霉素 A（终浓度 5 µM）'CAUTION'，记录细胞呼吸，直至氧通量信号下降并趋于稳定。</li>
	<li>接着，向氧电极室中加入 2.5 µl 的 0.8 mM 抗坏血酸（终浓度 1 mM），立即再加入 2.5 µl 的 0.2 mM TMPD（终浓度 0.25 mM），记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升并趋于稳定。</li>
	<li>最后，向氧电极室中加入 10 µl 的 1 M 叠氮化钠（终浓度 5 mM）'CAUTION'，记录细胞呼吸，直至氧通量信号下降并趋于稳定。</li>
</ol>
8. 完整细胞的耗氧量
<ol>
	<li>按照方案中第4.1至4.3步所述步骤，准备含有细胞悬液（1 × 106/ml）的氧电极室。</li>
	<li>向含有细胞悬液的氧电极室中注入1 µl的4 mg/ml寡霉素（终浓度为2 µg/ml），并记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。</li>
	<li>随后，向氧电极室中注入1 µl的0.2 mM FCCP（终浓度为0.1 µM）“注意”，并记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升并稳定。</li>
	<li>向氧电极室中注入3 µl的0.2 mM FCCP（终浓度为0.4 µM），并记录细胞呼吸，直至氧通量信号进一步上升并稳定。</li>
	<li>通过每次注入1–3 µl的0.2–1 mM FCCP（终浓度为0.1–2 µM），以0.1–0.3 µM为梯度逐步滴定FCCP，直至氧通量信号达到最大值，不再升高并开始下降。 
	注意：当氧信号达到最大值并开始下降时，停止添加FCCP。</li>
	<li>然后，向氧电极室中注入2 µl的0.2 mM鱼藤酮（终浓度为0.2 µM）和2 µl的5 mM抗霉素A（终浓度为5 µM），记录呼吸直至氧通量信号下降并稳定。</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitochondrial+and+cellular+respiration+by+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
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<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
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<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binding+to+enzymes+and+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binding to enzymes and membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).</li>
<li>Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+conformations+of+physiological+membrane-bound+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c.</a> Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).</li>
<li>Gorbenko, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+cytochrome+c+complexes+with+phospholipids+as+revealed+by+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer.</a> Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Mitochondr+Physiol+Network+17.18%22">Mitochondr Physiol Network 17.18</a>. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案的目的是利用高分辨率呼吸测定法测量线粒体呼吸链复合物（I-IV）的呼吸速率、线粒体电子传递系统最大容量以及线粒体外膜完整性。
本实验方案中存在若干关键步骤。首先，细胞耗氧率通常需根据细胞数量进行标准化（pmol/[sec × 细胞数量]）。因此，在监测细胞耗氧之前，使用一种能够准确且可靠地测定细胞数量的设备至关重要。在本方案中，采用了自动细胞计数仪（方案步骤3.7及材料表）。第二个关键步骤，尤其是在透化细胞实验中，是选择用于重悬透化细胞的呼吸缓冲液（方案步骤3.6）。由于细胞透化可能导致细胞内离子流失，因此在透化过程中所使用的介质必须与细胞内环境相容。因此，呼吸缓冲液的组成和渗透压应同时反映细胞内和细胞外环境（表1）13。此外，为了实现最佳且有效的细胞透化，必须针对每种细胞类型以及每种细胞密度滴定皂苷毒毛旋花素（digitonin）的浓度，以确定其最佳且最低的有效浓度。若digitonin浓度过低，则细胞无法被充分透化；相反，若细胞暴露于过量的digitonin中，则会损伤线粒体外膜。因此，另一...

线粒体在细胞能量代谢中发挥着重要作用，尤其是通过利用氧气生成三磷酸腺苷（ATP）。线粒体还参与细胞死亡过程，并与多种人类疾病相关。线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）将电子传递链上的电子传递、氧气消耗与ATP合成过程耦合在一起。线粒体三羧酸（TCA）循环参与将蛋白质、碳水化合物和脂肪转化为富含能量的化合物，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）。NADH和FADH2中的电子随后被转移至位于线粒体内膜上的呼吸链电子传递蛋白复合物（I至IV）。此外，还有另外两条氧化还原途径可将电子传递至电子传递链：i）位于线粒体内膜基质侧的线粒体电子转移黄素蛋白（ETF），其提供来自脂肪酸β-氧化的电子；ii）线粒体甘油磷酸脱氢酶，该酶将甘油磷酸氧化为二羟丙酮磷酸，并将电子输入线粒体电子传递链。复合物IV（最终的电子受体）将电子传递给一个氧分子，将氧气转化为两分子水。电子从呼吸链复合物I向复合物IV的传递过程与质子从线粒体基质向膜间隙的转移相偶联，从而在线粒体内膜两侧建立起电化学梯度。随后，线粒体复合物V（ATP合酶）将氢离子重新转运回线粒体基质，并合成ATP分子。OXPHOS功能可通过多种技术在体内（in vivo）和体外（vitro）进行评估，并可获得不同的线粒体呼吸状态。在分离的线粒体中，可测定以下呼吸状态：i）基础线粒体呼吸（状态1）；ii）加入线粒体呼吸链复合物特异性底物后的耗氧量（状态2）；iii）加入饱和浓度的二磷酸腺苷（ADP）后达到的最大线粒体耗氧量（状态3）；以及iv）ADP消耗完毕（转化为ATP）后的静息呼吸状态（状态4）。在完整细胞中，可测定以下呼吸状态：i）在内源性底物和ADP存在下的基础细胞耗氧量；ii）在寡霉素存在下的基础细胞耗氧量（寡霉素非敏感性呼吸）以及寡霉素敏感性呼吸（ATP周转）；iii）FCCP解偶联呼吸；以及iv）加入抗霉素A和鱼藤酮后的非线粒体呼吸。在通透化细胞中，可加入电子传递链复合物的特异性底物和ADP，从而测定依赖于各复合物的最大呼吸速率，例如复合物I、复合物II和复合物IV依赖性呼吸速率。
细胞呼吸的测量可提供关于线粒体呼吸链复合物I-IV特异性呼吸能力、线粒体完整性和能量代谢的重要信息1,2,3。一种能够高精度、高分辨率和高灵敏度测量线粒体耗氧量的设备是高分辨率氧电极仪4。该高分辨率氧电极仪包含两个带有注射口的腔室，每个腔室均配备一个极谱式氧传感器。细胞或分离的线粒体悬浮液在呼吸测量仪中持续搅拌。为评估线粒体功能，可按照标准操作流程加入用于检测线粒体复合物活性的底物和抑制剂。通过向氧电极仪的腔室内注射方式滴定底物和抑制剂，利用软件计算耗氧速率，并以每秒每细胞数量的皮摩尔数（pmol/s/细胞数）表示。相较于传统和常规的极谱式氧电极设备，高分辨率呼吸测定法具有多项优势，包括更高的灵敏度，以及能够使用少量生物样本（如完整细胞或通透化细胞）进行检测。此外，每台仪器包含两个腔室，可同时记录呼吸速率，便于比较氧浓度变化。高分辨率氧电极仪还具有较传统极谱式氧电极设备更小的腔室氧泄漏优势。另一种近年来开发用于测量细胞耗氧量的设备是96孔细胞外通量分析仪5。该细胞外通量分析仪采用荧光传感器而非极谱式传感器。与高分辨率氧电极仪相比，细胞外通量分析仪的优势包括：i）设备高度自动化；ii）可在24孔和96孔板中进行耗氧量测量，适用于高通量筛选，因而所需生物样本量更少；iii）还可同时检测细胞糖酵解通量。然而，与高分辨率氧电极仪相比，细胞外通量分析仪的劣势在于：i）设备本身及耗材（如不可重复使用的荧光检测板）成本较高；ii）每次检测/每孔最多只能注射四种化合物，因此该系统不适用于底物-解偶联剂-抑制剂滴定实验方案。
在本研究中，我们采用高分辨率呼吸测定法来测定线粒体呼吸。在进行细胞耗氧实验时，需对细胞进行透化处理，以允许外源性ADP和可氧化的线粒体底物进入细胞，从而向呼吸链复合物提供电子。该方法能够分别解析各个线粒体复合物的呼吸能力，相较于完整细胞具有明显优势（许多底物无法穿透细胞膜）。然而，细胞膜的透化会破坏细胞质与细胞外空间及培养基之间的屏障（导致胞质溶质被洗脱），从而使细胞内环境与细胞外培养基达到平衡。与完整细胞相比，透化细胞的一个缺点是：若在细胞透化过程中使用过量的去垢剂，可能会损伤线粒体外膜。在完整细胞中，可测定基础呼吸、偶联呼吸和解偶联呼吸。该方法在不添加外源性底物和ADP的条件下评估完整细胞的耗氧量，能够再现细胞整体环境下的呼吸功能，同时提供线粒体电子传递最大能力的信息6,7。与透化细胞相比，完整细胞的一个优势在于细胞内环境未被破坏，线粒体仍与细胞内的全部组分保持接触。为了透化细胞质膜，通常使用如皂苷（digitonin）等去垢剂8。然而，若使用过量的皂苷，线粒体外膜的完整性可能受到损害。为确认透化细胞中线粒体外膜完整性未受影响，需进行皂苷滴定实验，以确定实现细胞透化的最佳浓度。在这些实验中，将细胞重悬于呼吸缓冲液中，在线粒体底物和ADP存在的情况下，通过呼吸测定法逐步滴定皂苷浓度，并测定呼吸速率。完整且未透化的细胞在加入线粒体底物和ADP后呼吸不会被激活。然而，随着逐步增加皂苷浓度，细胞质膜将逐渐被透化，从而确定最佳皂苷浓度。该过程表现为呼吸速率随透化程度增加而逐步上升，直至完全透化。线粒体质量及外膜完整性可通过添加外源性细胞色素c进行验证2,9。细胞色素c是线粒体电子传递链中一种分子量为12 kDa的电子传递蛋白10,11,12，定位于线粒体膜间隙，参与耗氧过程，负责将电子从复合物III传递至复合物IV。一旦线粒体外膜受损，细胞色素c便会释放，导致线粒体耗氧量下降。当加入外源性细胞色素c后，若线粒体呼吸出现增强，则提示线粒体外膜完整性已被破坏。
在透化细胞中，线粒体复合物活性的底物和抑制剂根据不同的方案加入3,9。例如，为了研究由线粒体复合物驱动的呼吸速率，可采用以下方案。细胞透化后，首先通过底物苹果酸和谷氨酸刺激复合物I，这两种底物可生成NADH作为呼吸链的底物，并引发复合物I的活化。随后加入ADP以转化为ATP（状态3，复合物I依赖性活跃呼吸）。当信号达到稳定后，加入鱼藤酮（线粒体复合物I抑制剂）以抑制复合物I。接着加入琥珀酸以生成FADH2，并激活复合物II（状态3，复合物II依赖性活跃呼吸）。为了测量复合物IV依赖性呼吸，首先加入抗霉素A（线粒体复合物III抑制剂）以抑制复合物III依赖性呼吸。然后通过加入抗坏血酸和四甲基对苯二胺（TMPD）来刺激复合物IV依赖性呼吸。TMPD可在呼吸缓冲液中自发氧化，因此最大复合物IV依赖性呼吸速率（状态3）通过计算加入叠氮化钠（线粒体复合物IV抑制剂）前后呼吸速率的差值得出。呼吸实验可在氧电极的两个腔室中平行进行——其中一个作为对照（未刺激细胞），另一个含有被刺激的细胞。显然，在将细胞置于氧电极腔室测量耗氧量之前，可对其进行多种预处理，例如使用影响线粒体功能的药物。该方案允许对各个线粒体呼吸链复合物进行功能性检测。此外，还可以通过使用外源性脂肪酸（如棕榈酸盐）来测定透化细胞的最大ADP刺激呼吸速率（状态3）。在此方案中，高浓度的棕榈酸钠储备液与超纯无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）按6:1的摩尔比结合（棕榈酸:BSA）。随后，先用洋地黄皂苷对细胞进行透化处理，然后依次加入肉碱和棕榈酸以评估线粒体呼吸，再加入ADP（状态3，最大呼吸）。接着加入寡霉素以模拟状态4（状态4o），并计算呼吸控制比（RCR值），即状态3/状态4o。β-氧化促进乙酰辅酶A（进入三羧酸循环）的生成以及FADH2和NADH的产生，这些电子通过电子转移黄素蛋白和β-羟酰辅酶A脱氢酶传递至电子传递链。线粒体处于脂肪酸代谢的核心位置，研究人员在研究脂肪酸氧化时可采用上述描述的棕榈酸-BSA方案。在完整细胞中，线粒体复合物活性的激活剂和抑制剂则按照另一种方案加入6,9。在这些实验中，首先测量无外源底物存在时非透化细胞的耗氧量（磷酸化呼吸速率）。然后，在加入寡霉素（线粒体ATP合酶抑制剂）后测量非磷酸化呼吸速率。随后以不同浓度加入质子载体羰基氰化对三氟甲氧基苯腙（FCCP），并测定线粒体最大解偶联呼吸速率。FCCP等质子载体可增加线粒体内膜对质子的通透性，使质子被动移动从而消散化学渗透梯度。质子通透性的增加导致氧化磷酸化解偶联（无ATP生成），并引起耗氧量上升。最后加入鱼藤酮和抗霉素A以抑制线粒体呼吸，并从所有其他呼吸速率中扣除非线粒体呼吸速率。
耗氧速率可以表示为 IO2 [pmol × sec-1 × 10-6 细胞]（每百万细胞的氧气流量），其计算方法是将密闭氧室中的体积特异性氧通量 JV,O2 [pmol × sec-1 × ml-1] 除以细胞室中的细胞浓度（单位体积内的细胞数量 [106 细胞∙ml-1]）15。细胞质量特异性氧通量 JO2 [pmol × sec-1 × mg-1] 是指每个细胞的氧流量 IO2 [pmol × sec-1 × 10-6 细胞] 除以每个细胞的质量 [mg∙106 细胞]；或者将体积特异性通量 JV,O2 [pmol × sec-1 × ml-1] 除以单位体积的质量 [mg∙ml-1]。JO2 表示每单位细胞蛋白、干重或细胞体积的氧通量。
在本研究中，我们采用高分辨率呼吸测定法，描述了以下实验方案：i) 确定完全通透细胞质膜所需的最适皂苷素（digitonin）浓度（皂苷素滴定实验）；ii) 利用外源性细胞色素c检测线粒体外膜完整性；iii) 在添加外源性ADP及线粒体呼吸链底物的条件下，测定经皂苷素通透处理的HepG2细胞中线粒体呼吸链复合物I、II和IV的最大呼吸速率；以及iv) 在不添加外源性底物和ADP的情况下，测定完整细胞的基础呼吸、偶联呼吸及最大解偶联呼吸（最大电子传递能力），以重现整合细胞内的呼吸功能。

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>自动细胞计数仪器</td></tr><tr><td>细胞色素c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>化学试剂，溶于DMSO</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td>培养基</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>乳酸钾</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>O2k-Core: Oxygraph-2k&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>高分辨率呼吸测量仪</td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T 4674</td><td>化学试剂</td></tr></tbody></table>

高分辨率呼吸测定法评估透化细胞与完整细胞中的线粒体功能

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

高分辨率氧电极仪是一种用于在封闭式系统中以极高分辨率和灵敏度测量生物样品（完整细胞、通透化细胞、组织或分离的线粒体）细胞耗氧量的装置。该高分辨率氧电极仪配备两个检测腔室，利用极谱式氧传感器测定每个腔室中的氧浓度，并计算耗氧量。耗氧速率通过软件计算，表示为每秒每细胞数量的皮摩尔数（pmol/s/细胞数）。每个高分辨率氧电极仪腔室均配有带注射口的密封塞，因此非常适用于底物-解偶联剂-抑制剂滴定实验，或用于确定细胞膜通透化所需有效及最佳浓度的去垢剂滴定方案。该技术可应用于多种细胞类型的呼吸作用测定，同时可提供有关线粒体质量与完整性以及线粒体呼吸电子传递系统最大呼吸能力的信息。

细胞透化最适皂苷浓度的确定：皂苷滴定实验
Digitonin 滴定用于确定 HepG2 细胞透化处理的最佳浓度。在这些实验中，在存在鱼藤酮、琥珀酸（线粒体复合体 II 底物）和饱和量 ADP（以诱导复合体 II 依赖性状态 3）的条件下，对完整细胞进行 Digitonin 梯度滴定，并在基线水平及每次滴定后测定呼吸速率（图 1A 和 图 1B）。实验结果显示，在无 Digitonin 时，细胞呼吸速率极低，且完整、未透化细胞在存在线粒体底物和 ADP 的情况下呼吸未被激活。然而，随着 Digitonin 的逐步加入，细胞质膜被透化，琥珀酸和 ADP 进入细胞后，线粒体呼吸（复合体 II 依赖性状态 3）随之增加，直至完全透化。结果表明，Digitonin 浓度为 8–12 µM 时，可实现 HepG2 细胞 ADP 刺激呼吸的最佳透化效果。然而，若使用过量 Digitonin，可能导致线粒体...

高分辨率呼吸测定法用于测定线粒体的耗氧量。该方法是一种简单直接的技术，可用于测定线粒体呼吸链复合物（I-IV）的呼吸速率、线粒体电子传递系统最大容量以及线粒体外膜的完整性。

高分辨率氧电极仪是一种用于在封闭式反应室系统中以极高分辨率和灵敏度测量细胞耗氧量的设备……

本实验的总体目标是利用高分辨率呼吸测定法来测定线粒体的耗氧量。该方法有助于解答与线粒体功能障碍相关的综合征及疾病中的关键问题，例如：脓毒症、多种神经系统疾病以及衰老相关疾病。该技术的主要优势在于具有更高的灵敏度，并能够使用少量生物样本（如完整或透化细胞）进行底物耦合抑制剂滴定实验。演示该实验步骤的是来自我实验室的技术员 Sandra Nansoz。在开始实验之前，先对极谱式氧传感器进行空气校准，然后将细胞重悬于呼吸缓冲液中，使其浓度为每毫升含1×10⁶个细胞，并将氧电极仪一个腔室中的呼吸介质更换为2.1毫升的细胞悬液。用塞子封闭腔室，并将腔室内的磁力搅拌子转速设定为每分钟700转。然后记录细胞呼吸 5 到 10 分钟，直至获得稳定的氧气通量信号。接着使用注射器通过钛质进样口向氧电极室注入 2 微升鱼藤酮，并继续记录细胞呼吸 5 到 10 分钟。当氧气通量信号再次稳定后，依次注入 20 微升 1 摩尔的琥珀酸和 10 微升 0.5 摩尔的 ADP。然后注入两微升浓度为二毫摩尔的皂苷（digitonin），每次注射后记录二至五分钟的细胞呼吸；随后逐步注射二至四微升浓度为二毫摩尔的皂苷，直至氧通量信号达到最大水平，且进一步注射皂苷不再增加呼吸速率。为评估线粒体外膜完整性，按照上述方法准备氧电极室，加入两微升浓度为八毫摩尔的皂苷以使细胞通透化。五分钟后，加入二十微升浓度为一摩尔的琥珀酸（succinate），记录五到十分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。然后注入10微升0.5摩尔的ADP以刺激复合体II，并诱导耗氧量增加。当获得稳定的氧通量信号后，依次注入5微升4毫摩尔的细胞色素c，以及1微升4毫克/毫升的寡霉素。为测定肝细胞肝癌细胞的ADP刺激性呼吸，按照上述方法准备一个氧电极 chamber，并向氧电极室中注入2微升8毫摩尔的皂苷，使细胞透化5分钟，随后注入12.5微升0.8摩尔的苹果酸和10微升2摩尔的谷氨酸。当氧通量达到稳定后，加入10微升0.5摩尔的ADP以增加耗氧量，随后加入2微升0.2毫摩尔的鱼藤酮和20微升1摩尔的琥珀酸。接着，加入2微升5毫摩尔的抗霉素并记录细胞呼吸。当信号下降并稳定后，加入2.5微升0.8毫摩尔的抗坏血酸，紧接着立即加入2.5微升0.2毫摩尔的TMPD，并持续记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升并稳定。然后向氧电极室中加入10 µL 1摩尔的叠氮化钠，记录细胞耗氧直至氧通量信号下降并稳定。为测定完整细胞的耗氧量，按上述方法准备氧电极室，依次加入1 µL 4 mg/mL的抗霉素A，随后加入1 µL和3 µL的0.2 mmol/L FCCP。接着，通过每次加入1至3 µL浓度为0.2至1 mmol/L的FCCP，以0.1至0.3 µmol/L的增量逐步滴定FCCP，直至氧通量信号达到最大值且不再上升，随后开始下降。然后，加入2 µL的0.2毫摩尔鱼藤酮和2 µL的5毫摩尔抗霉素A，记录呼吸情况，直至氧通量信号下降并稳定。在无皂苷素存在时，细胞呼吸非常微弱，完整且未透化的细胞在存在线粒体底物和ADP的情况下呼吸不受刺激。然而，随着皂苷素的逐步加入，细胞质膜逐渐透化，线粒体呼吸随之增强，直至完全透化，此时琥珀酸和ADP进入细胞。然而，如果使用过量的皂苷（digitonin），可能会破坏线粒体外膜的完整性，导致依赖复合物的状态三呼吸下降。在经皂苷处理的细胞中，细胞色素 c 并不能增强依赖复合物的状态三呼吸，这表明细胞色素 c 未从线粒体外膜丢失，线粒体完整性得以保持；尽管在使用极高剂量皂苷处理的细胞中，细胞色素 c 可增强其呼吸作用。在皂苷透化后添加外源性线粒体复合物底物，可提高线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的最大呼吸速率。呼吸水平降低可能是由于氧电极室被前次实验的线粒体抑制剂污染所致。在存在抗霉素A及依次加入FCCP的情况下，可观察到细胞的最大非耦联呼吸速率。一旦掌握，若操作得当，这些技术中的任何一项均可在不到一小时内完成。在进行该实验操作时，必须牢记每次实验后需对氧电极室和塞子进行充分清洗。在完成本实验后，还可进一步开展其他检测方法，例如细胞ATP含量测定、胞质活性各组分分析以及线粒体底物水平检测等，以回答更多相关问题，例如呼吸速率的变化究竟是由于线粒体底物缺乏，还是ATP合酶活性降低所致。该技术建立之后，为生物能量学领域的研究人员探索线粒体功能开辟了道路，广泛应用于获得性与遗传性线粒体疾病、氧化应激、皮肤灌注损伤以及衰老等研究领域，适用于完整细胞、透化细胞或肌纤维以及分离线粒体的实验体系。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用高分辨率呼吸测定法在透化细胞和完整细胞中辅助线粒体功能。请务必注意，使用抗霉素A、鱼藤酮、叠氮化钠、FCCP和寡霉素时可能具有极高危险性，因此在进行该实验操作时，必须采取佩戴手套和实验服等防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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