高分辨率呼​​吸测量，以评估线粒体功能的通透和完整细胞

该程序的总体目标是使用高分辨率呼吸测定法来确定线粒体耗氧量。这种方法可以帮助回答与线粒体功能障碍相关的综合征和疾病中的关键问题，例如;败血症、各种神经系统疾病和与年龄相关的疾病。该技术的主要优点是具有更高的灵敏度，并且能够对少量生物样品（如完整或透化细胞）进行偶联抑制剂滴定实验

演示该程序的是我实验室的技术人员 Sandra Nansoz。在开始程序之前，对极谱法氧传感器进行空气校准，然后将细胞重悬于呼吸缓冲液中，浓度为每毫升 1 倍 10 至 6 个细胞，并用 2.1 毫升细胞悬液替换氧样仪一个腔室中的呼吸培养基。用塞子关闭腔室，并将腔室中的磁力搅拌棒设置为每分钟 700 转。

然后记录细胞呼吸 5 到 10 分钟，直到获得稳定的氧通量信号。接下来，使用注射器通过钛注射口将两微升鱼藤酮注射到氧合仪室中，并记录细胞呼吸再 5 到 10 分钟。当获得稳定的氧通量信号时，注射 20 微升 1 摩尔琥珀酸盐，然后注射 10 微升 0.5 摩尔 ADP。

然后注射两体积的两微升 2 毫摩尔洋地黄皂苷，并在每次注射后记录细胞呼吸 2 至 5 分钟，然后逐步注射 2 至 4 微升 2 毫摩尔洋地黄皂苷，直到氧通量信号达到最大水平，进一步注射洋地黄皂苷不会增加呼吸速率。为了评估线粒体外膜的完整性，如前所述，准备一个氧合室，并注射两微升 8 毫摩尔洋地黄皂苷以透化细胞。5 分钟后，注射 20 微升 1 摩尔琥珀酸盐，并记录细胞呼吸 5 至 10 分钟，直到获得稳定的氧通量信号。

然后注射 10 微升 0.5 摩尔 ADP 以刺激复合物 2，并诱导耗氧量增加。当获得稳定的通量信号时，注射 5 微升 4 毫摩尔细胞色素 c，然后注射 1 微升每毫升 4 毫克的利加霉素。为了测量肝细胞癌细胞的 ADP 刺激的呼吸，如刚才所示，准备一个 oygraph 室，并将 2 微升 8 毫摩尔洋地黄皂苷注入氧室以透化细胞 5 分钟，然后注射 12.5 微升 0.8 摩尔 mallade 和 10 微升 2 摩尔谷氨酸。

当氧通量达到稳定时，注射 10 微升 0.5 摩尔 ADP 以增加耗氧量，然后注射 2 微升 0.2 毫摩尔鱼藤酮和 20 微升 1 摩尔琥珀酸盐。接下来，注射 2 微升 5 毫摩尔抗霉素并记录细胞呼吸。当信号减弱并稳定时，注射 2.5 微升 0.8 毫摩尔抗坏血酸，然后立即注射 2.5 微升 0.2 毫摩尔 TMPD，记录细胞呼吸，直到氧通量信号增加并稳定。

然后将 10 微升一摩尔叠氮酸钠注入氧合仪室中，并记录细胞抽吸，直到氧通量信号减弱并稳定。为了测量完整细胞的耗氧量，如刚才所示，准备一个氧合仪室，并注射 1 微升 4 毫克/毫升 aligimicyn，然后注射 1 微升和 3 微升 0.2 毫摩尔 FCCP。接下来，通过注射 1 至 3 微升 0.2 至 1 毫摩尔的 FCCP，以 0.1 至 0.3 微摩尔的步骤滴定 FCCP，直到氧通量信号达到最大水平且不再增加，然后开始下降。

然后，注射 2 微升 0.2 毫摩尔鱼藤酮和 2 微升 5 毫摩尔抗霉素 A，并记录呼吸，直到氧通量信号减弱并稳定。在没有洋地黄皂苷的情况下，细胞呼吸非常低，并且在线粒体底物和 ADP 存在下不会刺激完整、非透化细胞的呼吸。然而，在逐步添加洋地黄皂苷后，细胞质膜变得透化，线粒体呼吸增加，直到完全透化，此时琥珀酸和 ADP 进入细胞。

然而，如果使用过量的洋地黄皂苷，线粒体外膜的完整性可能会受到损害，从而导致复合体到依赖状态 3 呼吸的减少。在洋地黄皂苷处理的细胞中，细胞色素 c 不会增强复合物至依赖状态 3 呼吸，表明线粒体外膜没有细胞色素 c 的损失，并且线粒体完整性得以保留，即使细胞色素 c 可以增强用非常高剂量的洋地黄皂苷处理的细胞的呼吸。洋地黄皂苷通透后线粒体复合物活性的外源底物的添加诱导线粒体呼吸链复合物增加 1、2 和 4 最大呼吸频率。

呼吸水平降低的产生可能是由于先前实验中的线粒体抑制剂污染了氧合仪室。在阿利吉霉素存在和 FCCP 的连续添加下，观察到细胞的最大解偶联呼吸频率。一旦掌握，如果执行得当，这些技术中的任何一种都可以在不到一小时的时间内完成。

在尝试此程序时，在每次实验后广泛记住洗涤氧合仪室和塞子非常重要。按照此程序，可以执行其他方法，例如测量细胞 ATP 含量，每种方法都以细胞活性、线粒体底物水平表示，以回答其他问题，例如呼吸频率的变化是由于缺乏线粒体底物还是由于 ATP 细胞活性降低。开发后，这项技术为生物学领域的研究人员探索线粒体功能铺平了道路，例如获得性和遗传性线粒体疾病、氧化应激、皮肤灌注损伤和完整或透化细胞或纤维以及分离的线粒体的衰老。

观看此视频后，您应该对如何使用高分辨率呼吸测定法在透化和完整细胞中辅助线粒体功能有很好的了解。不要忘记，使用抗霉素 a、鱼藤酮、碘酸钠、FCCP 和阿利可霉素可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验室外套。