密度梯度离心法分离小鼠原发胶质细胞的研究
February 16th, 2018
本文提出了一种从小鼠脑中分离原发胶质细胞的方法。这种技术有助于促进目前对神经系统状况的理解。将密度梯度离心和磁分离相结合, 产生高纯样品的充分屈服。此外, 我们概述了小胶质细胞的表征步骤。
该协议的总体目标是从啮齿动物中分离出高纯度的小胶质细胞种群。这种方法可以帮助回答神经信息领域的关键问题，例如识别干细胞对小胶质细胞的免疫调节特性或进行药物筛选测定。该技术的主要优点是无需长时间培养即可分离高纯度的小胶质细胞群。
要开始此过程，请将剪刀的尖端插入椎管的开口，然后在耳道上做横向切口。然后，轻轻地将组织滑向喙部，露出颅骨。接下来，沿着矢状缝线朝前囟切开一个切口。
然后，将剪刀的尖端插入前堛并做横向切口。然后，轻轻剥开头骨，露出大脑。使用弯曲的镊子将其取出并转移到 5 毫升的无菌容器中。
每次洗涤用 5 毫升冰冷的洗涤介质洗涤 2 到 3 次，以去除血液。在层流罩中，将 5 毫升容器的内容物放入放在冰上的小培养皿中。使用无菌手术刀刀片或无菌剪刀，去除小脑和嗅球。
然后，进行中线切割以分隔两个半球。随后，将脑膜层识别为一层非常薄的细胞，在大脑表面带有红色调，有可见的血管。用细镊子小心地剥去脑膜层，注意不要损坏皮质。
如果脑膜层破裂，请继续剥去撕裂的碎片，直到完全去除。然后，将半球转移到冰上的新小培养皿中，并用洗涤培养基填充。用无菌手术刀刀片将大脑切成小块。
然后，将 100 μL 木瓜蛋白酶和 150 μL DNase1 加入培养基中，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。消化后，使用 P1000 移液器研磨组织。如果组织碎片太大而无法进入移液器，请考虑使用一把无菌剪刀加宽移液器吸头。
在此过程中，注意不要将气泡引入培养基中，因为这可能会降低细胞活力。在层流罩中，准备一个带有 50 微米细胞过滤器的 100 毫升锥形管。将消化培养基和脑碎片倒入过滤器上。
使用无菌 3 毫升注射器的柱塞以研磨动作推入脑块，直到不再可见组织。在整个过程中，使用洗涤介质持续清洗过滤器。这将冲刷过滤器中捕获的任何细胞。
然后，将单细胞悬液在 4 摄氏度下以 500 G 离心 5 分钟。然后，通过将密度梯度培养基的 9：1 比例添加到 10X 无菌 HBSS 中来制备等渗原液 Percoll。在 DMEM 中制备 30% SIP 的梯度，在 one-X HBSS 中制备 70% SIP。
例如，要制备 10 毫升 30% SIP，请将 3 毫升 SIP 添加到 7 毫升 DMEM 中。接下来，从锥形管中吸出上清液，并在 DMEM 中用 8 毫升 30% SIP 重新悬浮细胞沉淀。将全体积转移到新的 15 mL 锥形管中。
之后，通过用 70% SIP 填充移液管来覆盖 70% SIP 溶液，并小心地将移液管推至锥形管的底部。一旦吸头接近底部，轻轻地将内容物推入移液管。随后，在室温下以 650 G 离心 SIP 层（包括细胞），制动零点和加速 4 次 25 分钟。
70%Percoll 层必须非常小心地进行底层覆盖。该界面的破坏会严重影响小胶质细胞在细胞层中的捕获，并严重降低产量。然后，从试管顶部吸出 4 毫升带有细胞碎片的培养基，以简化下一步中单核细胞的去除。
接下来，小心地将移液器吸头降低到界面，并将单核细胞与 30/70 密度梯度培养基界面分离。从混浊界面收集大约 3 毫升，并将其转移到新的 15 毫升锥形管中。在此之后，用 9 毫升 HBSS 稀释混合物以帮助去除密度梯度介质。
将含有单核细胞的稀释密度梯度培养基界面以 500 G 离心 5 分钟。吸出上清液并用 1 毫升生长培养基重新悬浮。随后，用台盼蓝对重悬的细胞进行染色，并使用血细胞计数器进行细胞计数。
在此步骤中，将收集的单核细胞在 4 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟以去除生长培养基，因为这会干扰磁性分离。使用之前获得的相同细胞计数，在含有 2%FBS 和 1 毫摩尔 EDTA 的 PBS 中，以 10 倍/mL 的浓度重悬于体积范围内的 0.1 至 2.5 mL。接下来，将 PBS 中全体积的有核细胞加入新鲜的 5 毫升聚苯乙烯圆底管中。
然后，每 1 mL 样品添加 50 μL CD11b PE 标记试剂。在室温下避光孵育 15 分钟。之后，每 1 mL 样品添加 70 μL 精选鸡尾酒。
在室温下避光孵育 15 分钟。随后，通过上下移液五次以上来混合磁性颗粒。向样品中加入每毫升 50 μL，并在室温下避光孵育 10 分钟。
如果细胞混合物的总体积小于 2.5 毫升，则用含有 2% FBS 和 1 毫摩尔 EDTA 的 PBS 加满至此体积，然后轻轻移液 2 至 3 次混合。然后，将试管放入磁力架中，在室温下孵育 5 分钟。在一个连续的动作中，将包含试管的磁体完全倒置 2 到 3 秒，以倒出上清液。
将磁铁放回直立位置，然后从磁铁上取下管子。之后，通过重复这些程序从柱中洗出剩余的细胞。将细胞重悬于所需的生长培养基中。
冲洗收集容器的侧面，从试管侧面收集细胞并最大限度地提高产量。从该图中可以看出，分离的原代小胶质细胞保留了其球形细胞体和独特的分枝结构。以下是分离的小胶质细胞的代表性事实图。
膜联蛋白 V 和碘化丙啶的联合染色允许在用 LPS 刺激后对凋亡、坏死或活细胞进行分类。相对于对照，hAEC 条件培养基显着降低了小胶质细胞凋亡，表明对这种细胞类型存在一种保护形式。一旦掌握，如果作正确，这项技术可以在 6 到 8 小时内完成。
在执行这种方法时，在 Percoll 分层时要非常小心，因为此步骤对产量的影响最大。遵循该技术后，其他程序（如吞噬功能测定或与神经元共培养）可用于回答有关所选细胞类型对原代小胶质细胞的免疫调节特性的其他问题。开发后，这项技术为该领域的研究人员发现如何在围产期脑损伤中调节原代小胶质细胞铺平了道路。
该技术的意义延伸到围产期脑损伤的治疗和诊断，因为它允许表征已知参与导致运动和认知功能障碍的神经信息的原代免疫细胞类型。虽然这种方法可以提供对运动障碍（如脑瘫）的见解，但它也可以应用于小胶质细胞在发病机制中起作用的其他疾病，如阿尔茨海默病。当我们想要一种快速表征小胶质细胞的技术，以规避长时间培养后潜在的表观遗传变化时，我们首先想到了这种方法。
观看本视频后，您应该对如何分离高纯度的小胶质细胞群进行下游表征有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种从小鼠脑中分离原代小胶质细胞的详细协议，该协议提高了我们对神经系统状况的理解。该方法结合了密度梯度离心和磁分离，以高效获得高纯度的小胶质细胞样本。还概述了细胞特性分析的关键步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 小胶质细胞在神经系统中扮演着关键角色，它们的分离对研究其功能至关重要。
- 该协议有助于解答有关小胶质细胞行为及其与其他细胞类型相互作用的重要问题。
- 高纯度的小胶质细胞对于神经系统研究中准确的实验结果至关重要。
- 该协议最大限度地减少了延长培养时间的需求，促进了新鲜分离细胞的即时使用。
研究目的
- 开发一种从啮齿动物脑中分离纯净小胶质细胞的稳健协议。
- 增进对小胶质细胞在神经炎症和其他神经系统疾病中作用的理解。
- 为药物筛选和免疫调节研究等下游应用提供支持。
使用的方法
- 体外脑组织分离，随后进行机械和酶解消化。
- 生物模型包括用于小胶质细胞分离的小鼠脑。
- 方法包括密度梯度离心和磁分离。
- 关键步骤涉及细心的组织处理和特定的孵育条件，以确保高细胞活力。
- 整个协议中强调了用于分离和表征细胞的高精度技术。
主要结果
- 该协议成功地获得了高纯度的小胶质细胞群，准备用于分析。
- 分离的小胶质细胞可用于各种分析，提供其功能特性和反应的见解。
- 该方法允许快速获取新鲜分离的细胞，这对于即时的实验需求至关重要。
- 该协议的稳健性得到了强调，确保在不同实验中重复和可靠的结果。
结论
- 这项研究使研究人员能够轻松分离小胶质细胞，从而促进对其在健康和疾病中作用的更深入理解。
- 所描述的技术为进一步探索神经炎症过程和相关治疗奠定了基础。
- 从该方法获得的见解可以推进对小胶质细胞功能及其在神经系统研究中的影响的知识。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
