通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

本实验方案的总体目标是从啮齿类动物中分离出高纯度的小胶质细胞群体。该方法有助于解答神经免疫学领域的关键问题，例如鉴定干细胞对小胶质细胞的免疫调节特性，或进行药物筛选实验。该技术的主要优势在于无需长时间培养，即可获得高纯度的小胶质细胞群体。

开始此操作时，将剪刀尖端插入脊髓腔的开口处，并向耳道方向进行横向剪切。然后，轻柔地将组织向吻端滑动，以暴露颅骨。接着，沿矢状缝向囟门方向做切口。

然后，将剪刀尖插入前囟，进行横向剪开。随后，轻轻剥离颅骨以暴露脑组织。使用弯头镊子取出脑组织，并转移至一个5毫升的无菌容器中。

用五毫升冰浴洗涤液清洗两到三次，每次清洗以去除血液。在超净工作台中，将五毫升容器中的内容物置于盛有冰块的小型培养皿中。使用无菌手术刀片或无菌剪刀，分离小脑和嗅球。

然后，沿中线切开以分离两个半球。接着，识别脑表面带有红色调且可见血管的脑膜层，该层为一层极薄的细胞。用精细镊子小心剥离脑膜层，注意不要损伤皮层。

如果脑膜层破裂，继续剥离撕裂的碎片，直至完全去除。然后将脑半球转移至冰上新的小型培养皿中，并加入洗涤液。用无菌手术刀片将脑组织切成小块。

随后，向培养基中加入 100 µL 木瓜蛋白酶（papain）和 150 µL DNase1，在 37°C 下孵育 30 分钟。消化完成后，使用 P1000 移液器吹打组织。如果组织块过大无法进入移液头，可考虑使用无菌剪刀扩大移液头尖端。

在此过程中，注意避免将气泡引入培养基中，因为这可能会降低细胞活力。在超净工作台中，准备一个装有100微米细胞滤筛的50毫升锥形管。将消化液和脑组织碎片倒入滤筛中。

使用无菌的三毫升注射器的推杆，以研磨动作推压脑组织碎片，直至肉眼不可见任何组织。在此过程中，持续用洗涤液冲洗滤膜，以确保滤网中截留的细胞被充分洗脱。

随后，在 4 摄氏度条件下，以 500 G 离心单细胞悬液 5 分钟。然后，通过将密度梯度介质与 10 倍浓度无菌 HBSS 按 9:1 的比例混合，制备储备等渗 Percoll 液。分别用 DMEM 配制 30%SIP 梯度液，用 1 倍浓度 HBSS 配制 70%SIP 梯度液。

例如，配制 10 毫升 30%SIP 时，将 3 毫升 SIP 加入 7 毫升 DMEM 中。接着，吸除锥形管中的上清液，并用 8 毫升 DMEM 中的 30%SIP 重悬细胞沉淀。将全部体积转移至新的 15 毫升锥形管中。

随后，用移液管吸取70% SIP溶液，将其缓缓插入锥形管底部，使70% SIP溶液位于原有溶液下方。当移液管尖端接近管底时，轻柔地将其中内容物推出。接着，将含有细胞的SIP各层在室温下以650 ×g离心25分钟，离心条件设置为刹车档位为零、加速度档位为四。

必须非常小心地在70%Percoll层下方进行铺层。此界面的破坏会严重影响小胶质细胞在细胞层中的捕获，并显著降低得率。然后，从管子顶部吸出4 mL含有细胞碎片的培养基，以便在下一步中更方便地去除单个核细胞。

接下来，小心地将移液管枪头移向界面，从30/70密度梯度培养基界面处分离单个核细胞。从浑浊的界面处收集约三毫升液体，并转移至一个新的15毫升锥形管中。随后，加入九毫升HBSS稀释该混合液，以有助于去除密度梯度培养基。

将含有单个核细胞的稀释密度梯度介质界面在500 G条件下离心五分钟。吸除上清液，并用一毫升培养基重新悬浮细胞。随后，用台盼蓝对重悬细胞进行染色，并使用血细胞计数板进行细胞计数。

在此步骤中，将收集的单个核细胞在4°C条件下以300 ×g离心10分钟，以去除会干扰磁性分离的生长培养基。根据之前获得的细胞计数，将细胞重悬于含有2% FBS和1 mmol/L EDTA的PBS中，浓度为每毫升1×10⁸个有核细胞，体积范围为0.1至2.5 mL。接着，将PBS中的全部有核细胞悬液加入一个新的5 mL聚苯乙烯圆底试管中。

然后，每1毫升样品中加入50 µL CD11b PE标记试剂，在室温下避光孵育15分钟。之后，每1毫升样品中加入70 µL分选混合液。

避光、室温孵育15分钟。随后，通过移液吹打混合磁性颗粒，至少5次以上。向样品中加入每毫升50 µL的试剂，避光、室温孵育10分钟。

如果细胞混合物的总体积小于2.5毫升，请用含有2% FBS和1毫摩尔EDTA的PBS补足至该体积，并轻轻吹打混匀2到3次。然后将试管放入磁架中，在室温下孵育5分钟。以连续动作将装有试管的磁架完全倒置2到3秒，以倒掉上清液。

将磁铁恢复至直立位置，从磁铁上取下管子。随后，通过重复上述步骤，用缓冲液冲洗柱子中的剩余细胞。将细胞重悬于所需培养基中。

冲洗收集容器的管壁，以回收附着在管壁上的细胞，最大限度地提高得率。从本图中可以看出，分离得到的原代小胶质细胞保持了其球形的细胞体和明显的分支状结构。以下是分离小胶质细胞的代表性流式图。

联合使用annexin V和碘化丙啶染色可对经LPS刺激后的细胞进行分类，区分凋亡、坏死或活细胞。与对照组相比，hAEC条件培养基显著降低了小胶质细胞的凋亡，提示其对该细胞类型具有一定的保护作用。一旦掌握该技术，若操作正确，可在六至八小时内完成。

进行该方法时，需特别注意Percoll的分层操作，因为此步骤对得率影响最大。采用该技术后，还可结合其他实验方法，如吞噬功能检测或与神经元共培养，以进一步探究所选细胞类型对原代小胶质细胞免疫调节特性的相关问题。该技术建立后，为研究人员探索原代小胶质细胞在围产期脑损伤中的调控机制开辟了道路。

该技术的应用前景涉及围产期脑损伤的治疗与诊断，因为它能够对一种主要的免疫细胞类型进行表征，这种细胞已知参与导致运动和认知功能障碍的神经炎症过程。尽管该方法可为脑性瘫痪等运动障碍疾病提供研究依据，但它也可应用于小胶质细胞参与发病机制的其他疾病，例如阿尔茨海默病。我们最初构想该方法，是出于对快速表征小胶质细胞技术的需求，以避免细胞在长期培养中可能发生的表观遗传学改变。

观看本视频后，您应能充分掌握如何分离高纯度的小胶质细胞群体，用于后续表征分析。