鼠小胶质细胞的分离培养促进无血清培养基动态分支形态学的研究

该细胞培养方案的总体目标是从发育中的或成年啮齿动物中产生高纯度的小胶质细胞培养物，这些培养物可以在不暴露于血清的情况下维持。该程序可以帮助回答神经科学中与小胶质细胞形态、纤维酮症和小胶质细胞与其他 CNS 细胞类型的相互作用有关的关键问题。该方案的主要优点是可以从任何年龄的啮齿动物组织中快速分离出小胶质细胞，并在不暴露于血清的情况下进行培养。

要取出大脑，请用解剖剪刀从动物两侧的脊髓上剪下枕骨髁，注意不要损伤大脑。然后，沿着颅骨顶部切开皮肤，沿着顶骨和额骨向鼻骨切开一侧。用镊子小心地拉回颅骨顶部，快速取出大脑，并将其放入冰上预冷的 DPBS 中。

对所有剩余的动物重复该过程。将大脑收集在冷的 DPBS 中后，用冷手术刀刀片在冰上的培养皿中将每个大脑切成一立方毫米的块，然后转移到含有 5 到 7 毫升冰冷的 dounc 缓冲液的冰冷 dounce 匀浆器中。接下来，使用松散的 dounce 匀浆器通过 10 到 20 次轻柔且不完整的笔触分离组织。

注意不要直接压碎均质器底部的组织。相反，将组织推动通过活塞侧面和均质器之间的空间。重要的是通过多轮敲击缓慢匀浆组织以保持小胶质细胞的活力。

之后，小心地拆下活塞以防止引入气泡。让解离不良的组织块沉降到均质器底部，并将上清液转移到新的冷却 50 ml 锥形管中。随后，用新鲜的 douncing 缓冲液替换去除的体积，并重复解离程序总共三到四轮，或直到所有组织都解离。

在此过程中，将冰冷的 douncing 缓冲液添加到含有细胞悬液的 50 毫升锥形管中，并将总体积调节至 33.5 毫升。接下来，向细胞悬液中加入 10 ml MSB，并倒置试管数次，充分混合。这将导致 23% 的最终浓度为 43.5 mL。

之后，在 4 摄氏度下以 500 x g 的离心速度离心细胞 15 分钟，并缓慢制动。然后，用移液管去除顶层髓鞘和碎片以及上清液。移除顶层时要小心，以确保尽可能多地去除顶层。

之后，将细胞沉淀重悬于 12 mL 淘选缓冲液中。轻轻研磨细胞悬液以打碎任何剩余的细胞团块。在此步骤中，将细胞悬液通过 70 微米的细胞过滤器，以去除大碎片或细胞团块。

用 DPBS 冲洗 OX42 涂层的淘金盘 3 次。不要让板在两次洗涤之间完全干燥。倒出最后的 DPBS 洗涤液，将过滤后的细胞悬液涂抹到淘洗皿中。

轻轻旋转板以分布细胞。然后，将板在室温下在平坦的表面上孵育 20 分钟，让细胞粘附。孵育时间不要超过 20 分钟，否则细胞将变得非常难以从培养皿中恢复。

然后，用 DPBS 冲洗淘选皿 10 次以去除非贴壁细胞。小胶质细胞将牢固地附着在板上，因此每次冲洗时旋转板以确保去除其他非贴壁细胞。倒出最后一次 DPBS 洗涤液，用 15 毫升 DPBS 和 200 微升胰蛋白酶代替。

要用胰蛋白酶消化细胞，请在 10 摄氏度下孵育培养皿小于或等于 37 分钟。胰蛋白酶消化 10 分钟后，小胶质细胞仍会粘附在平板上。倒出混合物，用 DPBS 轻轻洗涤板两次以去除胰蛋白酶。

然后，换成 12 毫升冰镇的 MGM。随后，将淘金皿放在冰上两分钟，以帮助削弱细胞和基质的相互作用，并确保淘金皿是平整的，以防止淘金皿的区域变干。之后，用 10 毫升移液器和移液器控制器高速用力移液，以从淘选皿中回收细胞。

用移液管中的液体流画一个 16 x 16 的网格，以尝试去除所有细胞。在整体细胞回收率和培养物的健康状况之间找到平衡非常重要。将细胞上清液重复移液到淘选培养皿上会导致培养物的活力降低。

在显微镜下以 20 倍放大倍率检查细胞，以确保它们已从板中分离。标记培养皿顶部卡住细胞的位置，并在这些区域重复移液。收集细胞悬液，并在每个 15 mL 锥形管中分配 3 至 4 mL 上清液。

4 摄氏度下以 500 x g 的速度旋转 15 分钟，并缓慢制动。15 分钟后，吸出上清液，留下 0.5 mL MGM 和细胞沉淀。然后，将每个沉淀重悬于剩余的 MGM 中，并从所有试管中拉出细胞。

之后，用血细胞计数器计数细胞。现在，将 15 微升胶原蛋白 IV 包被直接铺在 24 孔阴离子阳离子包被组织培养板的中心，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。用血细胞计数器计数细胞后，在 MGM 中将其稀释至 2.3 x 10 至每毫升 5 个。

吸出胶原蛋白 IV 点，并立即将 15 μL 细胞悬液接种到该点，以在每个点的三个细胞中产生 3.5 x 10 的胶原蛋白。接下来，在 37 摄氏度下孵育 5 到 10 分钟，让细胞粘附。然后，向孔中轻轻加入 500 微升 CO2 平衡 TIC。

如果在盖玻片上铺板，请先在无菌玻璃盖玻片上涂上 10 μg/mL PDL 的水中，在室温下放置 1 小时。然后，用水清洗 3 次，在紫外线下在通风橱中晾干，然后再在盖玻片上进行点镀。为了证明高纯度小胶质细胞的成功分离和培养，我们从 P21 大鼠中分离出小胶质细胞，并将这些细胞在补充有 10% FCS 的 TIC 或 TIC 中培养 8 天。

然后固定细胞并用小胶质细胞标志物和增殖标志物染色。在 TIC 中培养的细胞显示出分枝形态、低水平增殖和小胶质细胞标志物的表达。相比之下，在补充 10% FCS 的 TIC 中培养的细胞也对小胶质细胞标志物进行染色，但显示出高水平的增殖和变形虫形态，这些特性在活化的小胶质细胞中很常见。

除了对细胞标志物进行染色外，对新鲜分离的细胞进行 RNA-Seq 还可以为评估细胞的 RNA 谱提供强大而灵敏的工具，并有助于了解培养物的起始纯度。除了 CD11b 阳性小胶质细胞外，CD11b 显微淘选通常还会导致小比例的 CD11b 阳性中性粒细胞和单核细胞残留。这些细胞将在几天后在 TIC 中死亡，但会使早期时间点的分析复杂化。

这是 TIC 中 14 DIV 后 P21 大鼠小胶质细胞的延时视频。两周后，无血清培养物显示动态监测行为，在整个培养皿中快速延伸和回缩过程。这是 P21 大鼠小胶质细胞在暴露于胎牛血清前后 5 次 DIV 后 TIC 的延时电影。

血清暴露后形态学变化迅速。一旦掌握，如果执行得当，该协议可以在 4 到 5 小时内完成。在此程序之后，可以进行其他检测来监测吞噬作用、趋化性、存活、细胞因子释放、对刺激的转录反应，以回答有关小胶质细胞功能的其他问题。

观看此视频后，您应该对如何从成年啮齿动物组织中快速分离小胶质细胞并在无血清条件下培养它们有很好的了解。