Name: 膜蛋白对洗涤剂敏感相互作用的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习检测膜蛋白对洗涤剂敏感相互作用的方法，以sortilin与GLUT4的结合为例。该技术利用组氨酸标签和myc标签肽，为生物化学研究提供快速可靠的蛋白质相互作用检测方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）向 K.V.K. 提供的研究基金 DK52057 和 DK107498 资助。X.P. 由美国国立卫生研究院（NIH）的机构培训基金 2T32DK007201 资助。

1. 肽的处理
<ol>
	<li>多肽的设计与订购
	<ol>
		<li>选择所需多肽的序列，并在其N端或C端添加标签，例如myc表位（EQKLISEED）。</li>
		<li>使用多肽溶解度计算器 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php 预测多肽在水中的溶解度。如果溶解度较低，可尝试添加另一个水溶性标签以改变电荷平衡。 
		注意：我们使用的多肽对应于GLUT4的第一个腔内环（fll），并在N端带有myc表位（粗体）（Myc-fll-GLUT4）：EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA，该序列预测在水中具有&#34;良好&#34;的溶解度。</li>
		<li>订购纯度至少为75%的定制多肽，此纯度已足够用于检测，并向供应商索取溶解度测试报告。为防止多肽溶解过程中出现意外问题，应将订购的多肽分装为至少两份独立样品。 
		注意：Myc-fll-GLUT4被分为两份独立样品订购，其在超纯水中的报告溶解度为≤10 mg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多肽的溶解 
	注意：超纯水是最佳溶剂。如果多肽似乎不溶于水，请参考 http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html 获取操作说明。
	<ol>
		<li>用超纯水或所选缓冲液配制多肽的100倍工作液，浓度为100 μg/mL。</li>
		<li>将溶液分装为每份50 - 100 µL，并于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞处理
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>使用野生型（WT）细胞作为阴性对照，以及表达带有六个组氨酸标签（HisP）的目标蛋白的细胞。 
		注意：我们使用了稳定转染 Sortilin-myc/His 的 3T3-L1 前脂肪细胞5.</li>
		<li>在37 °C、10% CO₂条件下，将细胞培养于添加有10%胎牛血清、谷氨酰胺（2 mM）和青霉素/链霉素（5 μg/mL）的高糖 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中2.</li>
		<li>将四皿10 cm培养皿中的细胞置于培养箱中，其中两皿转染HisP，另两皿转染对照质粒（WT）。转染48 h后，细胞应达到80–90%汇合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解物的制备
	<ol>
		<li>配制裂解缓冲液（10 mM Hepes、30 mM NaCl、5% 甘油、10 mM 咪唑、0.5% Triton X-100 以及不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物，用于 His 标签蛋白的分离，pH 7.4），并于 4 °C 保存：</li>
		<li>用 10 mL 4 °C 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 3 次。</li>
		<li>将培养皿置于冰上，向每皿中加入 500 µL 裂解缓冲液。使用细胞刮刀收集细胞裂解物。</li>
		<li>将每块培养皿中的细胞裂解液分别放入不同的1.5 mL离心管中。将离心管标记为WT-pH6、WT-pH8、HisP-pH6、HisP-pH8。</li>
		<li>使用26G针头的注射器将细胞裂解液反复抽吸5次，以完成裂解。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 16,000 x g 离心 10 分钟，处理细胞裂解液。</li>
		<li>将上清液转移至新标记的相同标签试管中。</li>
		<li>使用BCA蛋白检测试剂盒或其他试剂盒分析蛋白浓度。</li>
		<li>使用裂解缓冲液调节四种裂解物的蛋白浓度至相等。</li>
		<li>分离一小份（约 取每种裂解液20 µL，于-20 °C保存，以备对照实验和/或问题排查使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. His标签蛋白与HisPur钴珠的结合
<ol>
	<li>使用市售的洗涤缓冲液或自行配制（50 mM Na2HPO4/NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 8），并置于 4 °C 保存。</li>
	<li>用 HCl 滴定 pH 8 的洗涤缓冲液至 pH 6，配制 pH 6 的洗涤缓冲液，并置于 4 °C 保存。</li>
	<li>轻轻摇动钴珠试剂瓶，使其形成均匀的悬浮液。</li>
	<li>将 40 µL 钴珠悬浮液分别加入四个已标记的 1.5 mL 离心管中（见步骤 2.2.4）。</li>
	<li>向每管中加入 1 mL 裂解缓冲液，在 1000 × g 条件下离心 5 秒，吸除上清液，并向沉淀的珠子中加入 40 μL 裂解缓冲液。</li>
	<li>将细胞裂解液分别加入对应的离心管中。</li>
	<li>将离心管置于 4 °C、20 rpm 的旋转仪上孵育 90 分钟。</li>
	<li>在 1000 × g 条件下离心 5 秒，收集上清液，并将上清液置于 4 °C 保存。</li>
	<li>向对应的离心管中加入 500 µL pH 8 或 pH 6 的洗涤缓冲液，轻轻重悬珠子。</li>
	<li>在 1000 × g 条件下离心 5 秒，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 3.9 和 3.10 共四次。</li>
</ol>
4. 肽与珠上固定的 His 标签蛋白的结合
<ol>
	<li>使用该多肽的100倍工作液（步骤1.2.1），在pH 6或pH 8洗涤缓冲液中分别配制1倍工作液（每种各取两份100 µL，浓度为1 µg/mL）。</li>
	<li>向已洗涤的磁珠中加入100 μL相应pH的1x肽溶液。</li>
	<li>将珠子在 4 °C 下于 20 rpm 的试管旋转仪中孵育 30 分钟。</li>
	<li>将离心管在1,000 × g下离心5秒，收集上清液并于-20 °C保存。</li>
	<li>重复步骤 3.9 和 3.10，共四次。 
	注意：为了降低可能的背景信号，以下步骤可替代步骤 4.4 &amp;#38; 4.5.</li>
	<li>取四个带有30 μm孔径的微型柱，按2.2.4步骤进行标记，并将微型柱放入收集管中。</li>
	<li>完成步骤4.3后，将孵育混合物转移至柱中，依靠重力使溶液流过。收集的流穿液置于-20 °C保存。</li>
	<li>通过重力作用将 500 µL pH 6 或 pH 8 的洗涤缓冲液分别流经相应的层析柱。弃去流出液。</li>
	<li>重复步骤 4.8 四次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将柱子在1,000 × g离心15秒。</li>
</ol>
5. 钴珠洗脱
<ol>
	<li>使用商用Tricine上样缓冲液（200 mM Tris-HCl，40%甘油，2% SDS，0.04%考马斯亮蓝，pH 6.8），并加入β-巯基乙醇至终浓度为2%。</li>
	<li>向洗涤后的磁珠中加入40 µL含β-巯基乙醇的Tricine上样缓冲液，涡旋混匀样品。</li>
	<li>将样品在100 °C加热10分钟，再次涡旋混匀，然后以1,000 × g离心5秒。 
	注意：为减少洗脱过程中可能的非特异性结合，以下步骤可替代步骤5.1–5.3。</li>
	<li>向洗涤后的磁珠中加入40 μL洗脱咪唑缓冲液（50 mM Na2HPO4/NaH2PO4，300 mM NaCl，0.25 M 咪唑），涡旋混匀后室温孵育20分钟。</li>
	<li>以3,000 × g离心30秒，收集上清液（洗脱样品）并转移至新的标记管中。</li>
	<li>向每管中加入40 μL Tricine上样缓冲液，100 °C加热10分钟，涡旋混匀后以1,000 × g离心5秒。 
	注意：若使用微量离心柱，将洗脱缓冲液加入洗涤后的磁珠中，孵育20分钟&#160;，然后以8,000 × g离心2分钟收集洗脱液。 
	注意：样品可在–20 °C保存，直至进行电泳分析。</li>
</ol>
6. 电泳与蛋白质印迹
注意：样品已准备好进行 SDS-PAGE 分离及后续的蛋白质印迹（Western blotting）。请遵循凝胶电泳方案（https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot），并作如下修改。
<ol>
	<li>使用市售的 10 - 20% Tricine 梯度凝胶。</li>
	<li>在凝胶上分别上样 20 µL 洗脱样品和 20 µL 裂解液（步骤 2.2.10）。为便于故障排查，建议同时上样 20 µL 未结合组分（步骤 3.8）和 10 ng 肽；上样前，向这些样品中加入等体积的 Tricine 上样缓冲液。</li>
	<li>使用市售的 Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液（100 mM Tris，100 mM Tricine，0.1% SDS，pH 8.3）进行电泳。</li>
	<li>使用含有 20% 甲醇的转移缓冲液（25 mM Tris 碱，192 mM 甘氨酸，pH 8.4），将凝胶中的蛋白转移至 0.45 µm 硝酸纤维素膜上。</li>
	<li>用 3% 牛血清白蛋白（BSA）在室温下封闭膜 1 小时。以预染蛋白分子量标记物为参考，将膜水平切割，用抗 HisP 抗体孵育上半部分，用抗 myc 表位抗体孵育下半部分，以鉴定带 myc 标签的肽。 
	注意：在本实验特定情况下，无需切割膜，因为 HisP 和 Myc-fll-GLUT4 均可用抗 myc 抗体检测。</li>
</ol>
7. 结果分析
<ol>
	<li>使用成像系统或ImageJ软件定量所有Western印迹信号的强度。</li>
	<li>在两种pH值下，将Myc标签肽段的信号相对于HisP的信号进行归一化处理。</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Sortilin 是一种在进化上保守的多配体蛋白受体，参与细胞膜上的信号传导以及细胞内分选过程6,7。然而，寻找 sortilin 的真实配体（其中一些是腔内蛋白或整合膜蛋白）存在困难，因为 sortilin 与其某些结合伙伴的相互作用似乎对去垢剂敏感。因此，研究蛋白-蛋白相互作用的一种简便且广泛应用的方法——共免疫沉淀——难以直接应用。一些研究团队曾使用共免疫沉淀来证明 sortilin 与其潜在配体之间的相互作用8,9。然而，这些实验是在 0.1% Triton 或 0.6% CHAPS 条件下进行的，这引发了对膜蛋白是否被充分溶解的质疑。
其他研究人员通过表面等离子共振技术研究了sortilin与其配体之间的相互作用10,11。...

GLUT4 是一种葡萄糖转运蛋白，主要在脂肪细胞和骨骼肌细胞中表达，在其中介导胰岛素对餐后血糖清除的作用。1作为一种非常稳定的蛋白质，GLUT4在翻译后水平受到调控。在缺乏胰岛素的情况下，GLUT4主要被排除在质膜之外（因此葡萄糖的基础通透性较低），并主要定位于细胞内小的胰岛素响应性囊泡（IRVs）以及反式高尔基网络（TGN），后者很可能是IRV的供体区室。在给予胰岛素后，IRVs与质膜融合，将GLUT4运送至其功能位点，从而增加质膜对葡萄糖的通透性，使葡萄糖从血液进入脂肪细胞和骨骼肌细胞的摄取量升高10至40倍。胰岛素撤除后，GLUT4被内吞至早期内体/分选内体，随后被回收至TGN，在此IRVs重新形成。GLUT4转运途径中的这两个分选步骤， 即 从外周早期内体向核周反式高尔基网络（TGN）的逆向运输，以及在TGN供体膜上胰岛素响应性囊泡（IRVs）的形成，依赖于Vps10p家族成员sortilin的介导。sortilin是一种I型跨膜蛋白和分选受体。根据一种模型，sortilin作为跨膜支架蛋白发挥作用：它在早期内体和TGN腔内结合GLUT4，并在供体膜的胞质侧招募retromer或网格蛋白适配蛋白复合物。 通过 其C末端2,3这有助于将GLUT4分布到囊泡载体中，从而介导GLUT4在细胞内区室间的转位。
sortilin 的细胞质尾区与retromer及多种衔接蛋白之间的相互作用已有充分报道。然而，sortilin 与 GLUT4（及其若干其他蛋白配体）之间的结合一直难以证实。特别是，尝试通过共免疫沉淀检测 sortilin 与 GLUT4 的相互作用均未成功，这可能是由于这两种蛋白之间的相互作用对去垢剂敏感所致。此外，作为典型的转运蛋白，GLUT4 含有12个跨膜结构域和6个腔内环，其中任意组合均可能构成 sortilin 的结合位点。与此同时，大量间接证据（如在细胞内显著共定位、使用膜通透性交联剂 DSP 进行交联、以及酵母双杂交系统中的相互作用）表明，sortilin 能够与 GLUT4 结合。进一步地，我们先前结合丙氨酸扫描突变技术，利用酵母双杂交方法确定，sortilin 的 Vps10p 结构域主要与 GLUT4 的第一个腔内环结合。然而，此类相互作用在哺乳动物细胞中的直接证据一直缺失。在此，我们通过钴树脂从转染的 3T3-L1 细胞中分离出带有 His 标签的 sortilin，并证明其可在 pH 6 和 pH 8 条件下与化学合成的 GLUT4 第一腔内环肽段发生相互作用，这两种 pH 条件分别模拟了早期内体腔内的酸性环境和反式高尔基网络（TGN）膜腔内的中性环境。在对照实验中，将未转染细胞制备的提取物加样至相同树脂时，未检测到任何肽段结合信号。

<table><tbody><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>用于组氨酸标签蛋白的纯化</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1 mL 胰岛素注射器 U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>用于组氨酸标签蛋白纯化</td></tr><tr><td>HisPur 钴树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Tricine 样品缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0739</td><td>含 SDS，需添加 β-巯基乙醇</td></tr><tr><td>洗脱&amp;nbsp;缓冲液</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-236</td><td>用于组氨酸标签蛋白纯化，含 250 mM 咪唑</td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine 预制胶 10-20%&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>用于肽段和小分子蛋白的分离</td></tr><tr><td>Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>转膜缓冲液</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>添加 20% 甲醇</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜&amp;nbsp; 0.45 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>抗 Myc 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2272</td><td>兔源</td></tr><tr><td>多肽</td><td>Genscipt</td><td></td><td>定制订购</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 双色标准蛋白</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

膜蛋白间去垢剂敏感性相互作用的检测

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

研究蛋白质-蛋白质相互作用的能力是理解细胞内调控网络的关键。然而，在许多情况下，检测蛋白质-蛋白质相互作用面临显著的实验挑战。特别是分选受体与其蛋白货物在膜区室腔内的相互作用通常对去垢剂敏感，导致这些蛋白无法通过共免疫沉淀进行检测。分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的结合即为膜蛋白之间微弱腔内相互作用的一个实例。本文中，我们描述了一种快速、简便且经济的检测方法，用于验证sortilin与GLUT4之间的相互作用。为此，我们设计并化学合成了对应于GLUT4腔内区潜在sortilin结合表位的myc标签肽段。将带有六个组氨酸标签的sortilin在哺乳动物细胞中表达，并利用钴珠从细胞裂解液中分离获得。将珠上固定的sortilin与肽段溶液在不同pH条件下孵育，随后通过蛋白质印迹分析洗脱物。该方法可轻松适用于研究其他对去垢剂敏感的蛋白质-蛋白质相互作用。

使用稳定转染了Sortilin-myc/His5的3T3 L1细胞以及野生型3T3 L1细胞（作为阴性对照）制备裂解液。将两种裂解液分别在pH 6或pH 8条件下与钴珠孵育，并充分洗涤。随后，将结合有固定化蛋白的珠子与Myc-fll-Glut4溶液孵育。经过仔细洗涤后，用0.25 M咪唑洗脱与珠子结合的蛋白。样品连同原始裂解液一同在10-20% Tricine梯度凝胶中进行SDS-PAGE电泳，随后使用抗Myc抗体进行Western blot检测，以同时检测Sortilin-myc/His（110 kD）和Myc-fll-GLUT4（5 kD）（图1）。
将 Myc-fll-GLUT4（10 ng）加样至凝胶的第一泳道作为参照。由于该肽的纯度仅为 75%，可见存在污染条带（上方条带）。来自野生型（WT）和表达 Sortilin-myc/His 的...

我们以分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的第一个腔内环之间的结合为例，介绍了一种利用去垢剂敏感性检测膜蛋白间相互作用的实验方案。

我们探索蛋白质-蛋白质相互作用的能力是理解细胞内调控连接的关键。然而，蛋白质-蛋白质相互作用的检测……

本实验的总体目标是检测膜蛋白或其他蛋白质之间对去垢剂敏感的相互作用。该实验要求一种蛋白带有组氨酸标签并在细胞中过表达，而另一种为带有myc标签的肽段。该方法有助于回答生物化学领域中关于重要蛋白质相互作用研究的相关问题。该技术的主要优势在于能够以去垢剂敏感的方式检测膜蛋白之间的相互作用。该操作步骤快速且简便。尽管该方法可为膜蛋白相互作用提供见解，也可用于研究弱蛋白相互作用。我们最初想到这种方法，是由于希望检测膜蛋白Saltilin与GLUT4之间的相互作用，但多次尝试从哺乳动物裂解液中进行共免疫沉淀均未成功。要订购该肽段，请选择对相互作用至关重要的肽段目标序列，并在该序列的末端或C端添加一个myc表位。肽段到货后，用超纯水配制每毫升含100微克的肽段工作溶液。在四个10厘米的培养皿中接种3T3-L1前脂肪细胞，并置于培养箱中培养。随后，将其中两个培养皿用带有6X组蛋白标签的目标蛋白质粒转染，并标记为HISP；另两个培养皿用两种对照质粒转染，并标记为WT。转染后，将细胞在培养箱中继续培养48小时，使其融合度达到80%至90%。为制备细胞裂解液，先将细胞置于冰上，用10毫升预冷至4摄氏度的1X磷酸盐缓冲液洗涤三次。然后，向每个样品中加入 500 µL 裂解缓冲液。接着，使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，以制备裂解液。将每个培养皿中制备的细胞裂解液分别转移至四个独立的 1.5 mm 离心管中，并标记所有离心管。然后，使用26号针头的注射器将细胞裂解液反复抽吸5次，以实现完全的细胞裂解。接着，在4°C条件下，以16000×g离心10分钟。将上清液转移至4个标记相同的新的离心管中。为便于后续故障排查和对照实验，取 20 微升细胞裂解液分装，并于 -20 摄氏度保存。如需后续使用，用盐酸将洗涤缓冲液的 pH 值从 8 滴定至 6，并将缓冲液储存在 4 摄氏度。接下来，为制备均一的钴珠悬浮液，请轻轻旋转瓶子。然后，将40微升钴珠悬浮液转移至所有分别标记的四个试管中。加入钴珠后，向各试管中加入1毫升裂解缓冲液。随后，以1000×g离心5秒。弃去上清液，用移液器向沉淀的磁珠中加入40微升裂解缓冲液。然后，将细胞裂解物转移至相应的离心管中，在4摄氏度下使用管式旋转仪孵育90分钟。90分钟后，在1000×g离心5秒。然后，收集标记为“Flowthrough-1”的上清液，并在20摄氏度下保存。接着，向各管中加入500微升pH8的洗涤缓冲液，轻轻重悬磁珠。以1000×g离心5秒，弃去上清液。然后，根据标签向各管中加入 pH 8 的洗涤缓冲液（pH 8 或 6），充分重悬珠子。以 1000×g 离心 5 秒，弃去上清液。用 pH 6 或 8 的水缓冲液配制 1 微克/毫升的肽工作溶液。然后，向已洗涤的微珠中加入100 µL肽溶液，微珠应与相应pH的溶液对应。接着，将微珠置于4°C下，在试管旋转仪上孵育30分钟。随后，取四个微柱，标记后放入已标记为“穿流-2”的收集管中。孵育结束后，将孵育混合物加入微柱中。让溶液依靠重力作用流过，并收集流出液。将层析柱放入新的收集管中，于20摄氏度保存。随后，通过重力流将500微升pH为6或8的洗涤缓冲液分别加入各层析柱中，弃去流出液。重复此步骤四次。以1000×g离心5秒。将柱置于新收集管中，收集管标记为洗脱。必须非常小心且均匀地清洗所有试管中的珠子，以去除未结合的肽。向清洗后的珠子中加入 40 微升含 β-巯基乙醇的三羟甲基甘氨酸样品缓冲液，在室温下静置 20 分钟。将离心柱在8000×g下离心两分钟。弃去离心柱，将收集管在100摄氏度下加热10分钟。然后，在1000×g下离心五秒钟。或者，向洗涤后的磁珠中加入40 µL洗脱咪唑缓冲液，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，以8000×g离心2分钟。弃去柱子，加入40 µL三羟甲基甘氨酸（tricine）上样缓冲液。将收集管在 100 摄氏度加热 10 分钟，然后在 1000×g 离心 5 秒。使用市售的 10–20% tricine 梯度凝胶。使用 Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液，每孔上样 20 µL 洗脱样品和总裂解液，然后启动电泳装置进行电泳。电泳结束后，使用含有20%甲醇的转移缓冲液将凝胶中的物质转移到0.45微米的硝酸纤维素膜上。封闭膜后，将其水平切开。接着，用Anti-His P抗体孵育膜的上半部分，用anti-myc抗体孵育膜的下半部分。为了研究固定在钴珠上的Sortilin与GLUT4之间的相互作用，进行了免疫印迹分析。收集野生型和转染了Sortilin-myc/His标签的3T3-L1细胞的细胞裂解液和洗脱液，随后上样至SDS-PAGE凝胶。使用抗myc抗体对印迹膜进行杂交检测。该印迹显示了转染上清液中110千道尔顿的Sortilin-myc/His标签蛋白以及5千道尔顿的myc标记腔内第一环GLUT4。接下来，为了研究pH值的重要性以及固定在钴珠上的Sortilin与GLUT4之间的相互作用，进行了免疫印迹分析。在该实验中，将myc标记腔内第一环GLUT4分别在pH 6和pH 8条件下与固定了Sortilin-myc/His标签蛋白的珠子共同孵育。该印迹结果显示，在 pH6 和 pH8 条件下，从表达 Sortilin-myc/His 标签的转染 3T3-L1 细胞所获得的洗脱液中，Sortilin-myc/His 与 myc 标记的 GLUT4 腔内第一环之间均存在明显的相互作用。一旦掌握该技术，从开始到样品准备好进行 Western 印迹分析可在三至四小时内完成。在进行该实验操作时，需注意设计出可溶性的肽段，最好能溶于水。为了加强您的实验结果，可以进行其他方法，例如交联后的免疫共沉淀。观看本视频后，您应能够充分理解如何在对去垢剂敏感的实验步骤中检测膜蛋白及蛋白质相互作用。该方法还可用于探索蛋白质片段之间的相互作用。轻柔的节奏爵士乐。

detection-detergent-sensitive-interactions-between-membrane

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

膜蛋白对洗涤剂敏感相互作用的检测

在本视频中，我们演示了一种荧光检测尺寸排阻色谱技术，用于在去垢剂溶解后筛选大肠杆菌（Escherichia...

荧光检测尺寸排阻色谱法：一种用于鉴定去垢剂溶解后荧光标记膜蛋白完整性的技术

本文描述了一种用于鉴定膜蛋白在体（in...

膜蛋白-SPINE：一种用于鉴定膜蛋白蛋白质相互作用的生化工具 体内

介绍了一种基于绿色荧光蛋白融合技术，用于在大肠杆菌（Escherichia...

基于绿色荧光蛋白的膜蛋白表达筛选 大肠杆菌

许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。...

通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

本方案演示了如何利用去垢剂反差匹配的小角中子散射技术，获得溶液中去垢剂增溶的膜蛋白的低分辨率ab...

小角中子散射实验中用于膜蛋白结构分析的对比度匹配去垢剂 从头算 建模

本文介绍一种用于质谱分析样品制备的膜上消化技术方案。该技术有助于便捷地分析蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用膜上消化技术评估蛋白质-蛋白质相互作用

微量热泳技术能够以较低的材料消耗快速获得结合常数。目前市面上有标记型和无标记型微量热泳技术可供选择；然而，无标记型热泳技术在相互作用检测的多样性方面不及使用荧光标记的技术。本文提供了一种基于标记型热泳的检测方案。...

使用微尺度热泳技术测量蛋白质-脂质相互作用

我们介绍一种将膜蛋白纯化和重组到肽盘中的过程结合在一起的单步层析方法。利用生物素化支架，通过生物膜层干涉技术直接进行表面固定并测量蛋白质-配体相互作用。...

PeptiQuick：一步法将膜蛋白整合至生物素化肽碟用于简化蛋白结合检测

本文介绍了一种利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术测定膜蛋白寡聚状态的实验方案。...

用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

学习检测膜蛋白对洗涤剂敏感相互作用的方法，以sortilin与GLUT4的结合为例。该技术利用组氨酸标签和myc标签肽，为生物化学研究提供快速可靠的蛋白质相互作用检测方案。

膜蛋白间去垢剂敏感性相互作用的检测

探索更多视频