膜蛋白对洗涤剂敏感相互作用的检测
2018年3月7日
我们描述了一个协议, 以检测在膜蛋白之间的洗涤剂敏感的相互作用, 使用结合的排序受体, sortilin, 到第一个腔内循环的葡萄糖转运蛋白, GLUT4, 作为一个例子。
该程序的总体目标是检测膜蛋白或其他蛋白质之间的去污剂敏感相互作用。该程序要求一种蛋白质被组氨酸标记并在细胞中过表达，而另一种蛋白质是 myc 标记的肽。这种方法可以帮助回答生物化学领域中重要的蛋白质相互作用研究的问题。
该技术的主要优点是能够以洗涤剂敏感的方式检测膜蛋白之间的相互作用。该过程既快速又简单。虽然这种方法可以深入了解膜蛋白相互作用，但它也可以用于研究弱蛋白质相互作用。
当我们想检查膜蛋白、Saltilin 和 GLUT4 之间的相互作用时，我们首先想到了这种方法，但尝试从哺乳动物裂解中共免疫沉淀它们仍然未成功。要订购肽，请选择对相互作用至关重要的肽的靶序列，并在序列的末端或 C 端添加 myc 表位。肽到达后，在超纯水中每毫升肽的工作溶液中加入 100 微克。
将三个 3T3-L1 前脂肪细胞接种在四个 10 厘米的培养皿中，并保存在培养箱中。接下来，用 6X histodyn 标记的靶蛋白转染两个培养皿，并在另外两个培养皿中用两个对照质粒标记为 HISP，并标记为 WT。转染后，将细胞在培养箱中放置 48 小时，以达到 80% 至 90% 的汇合度。要制备细胞裂解液，请用 10 mL 冷却 4 摄氏度的 1X 缓冲盐水在冰上洗涤细胞 3 次。
然后，向每个中加入 500 微升裂解缓冲液。然后，使用细胞刮刀将细胞从培养皿中分离出来，以制备裂解物。将从每个培养皿制备的细胞裂解物转移到四个单独的 1.5 毫米管中，并标记所有管。
然后，将细胞裂解物通过带有 26 号针头的注射器上下移动 5 次，以进行全细胞裂解。然后，在 4 摄氏度下以 16000xg 离心细胞裂解物 10 分钟。将上清液转移到四个相同标记的新管中。
对于未来的故障排除和对照实验，分装 20 μL 细胞裂解物并将其储存在 20 摄氏度下。为了以后使用，用盐酸在 PH8 处滴定洗涤缓冲液以获得 PH6 并将缓冲液储存在 4 摄氏度。接下来，要制备钴珠的均匀悬浮液，请小心地旋转瓶子。
然后，将 40 微升钴珠悬浮液转移到所有单独标记的四个试管中。加入钴珠后，向试管中加入 1 毫升裂解缓冲液。然后，将试管以 1000xg 离心 5 秒钟。
弃去上清液，用移液管将 40 μL 裂解缓冲液移液到沉淀的珠子中。然后，将细胞裂解物转移到相应的试管中，并在 4 摄氏度下在试管旋转器上孵育 90 分钟。90 分钟后，将样品以 1000xg 离心 5 秒。
然后，收集标记为 Flowthrough-1 的上清液并储存在 20 摄氏度。接下来，将 500 微升含 PH8 的洗涤缓冲液添加到各个试管中，然后轻轻地重新悬浮珠子。将试管以 1000xg 离心 5 秒钟，然后排出上清液。
然后，根据标签，向试管中加入含 PH8 或 6 的洗涤缓冲液，并充分重新悬浮珠子。将试管以 1000xg 离心 5 秒钟，然后排出上清液。制备每毫升 1 微克的肽和含有 PH6 或 8 的水缓冲液的工作溶液。
然后将 100 微升肽溶液添加到对应于相似 PH 值的洗涤珠中。然后，将微珠在 4 摄氏度下在试管旋转器上孵育 30 分钟。然后，取四根微柱，标记它们，并将柱放入标有 Flowthrough-2 的收集管中。孵育结束后，将孵育混合物添加到柱中。
让溶液通过重力并从流动中收集样品。将色谱柱放入新的收集管中并储存在 20 摄氏度。然后，通过重力流通过 500 μL 含 PH6 或 8 的洗涤缓冲液通过各个色谱柱，并丢弃流出液。
重复此步骤四次。将试管以 1000xg 离心 5 秒钟。将色谱柱放入标有 Elution 的新收集管中。
重要的是要非常小心和均匀地清洗所有试管中的珠子，以去除未结合的肽。向洗涤的磁珠中加入 40 μL 含 β 巯基乙醇的 tricine 样品缓冲液。让它在室温下静置 20 分钟。
将色谱柱以 8000xg 离心 2 分钟。丢弃收集管，将收集管在 100 摄氏度下加热 10 分钟。然后，以 1000xg 离心 5 秒钟。
或者，向洗涤过的微珠中加入 40 μL 洗脱咪唑缓冲液，并在室温下孵育 20 分钟。孵育结束后，将试管以 8000xg 离心 2 分钟。弃去色谱柱，加入 40 μL tricine 样品。
将收集管在 100 摄氏度下加热 10 分钟，然后以 1000xg 离心 5 秒。使用市售的 10-20%tricine 梯度凝胶。使用 Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液，然后将洗脱的样品和总裂解物各上样 20 μL，然后开始运行电泳装置。
电泳结束后，使用补充有 20% 甲醇的转印缓冲液将材料从凝胶转移到 0.45 μm 硝酸纤维素膜上。封闭膜后，水平切割。接下来，用抗 His P 抗体探测膜的上部，用抗 myc 探测膜的下半部。
为了研究 GLUT4 中钴珠上固定的 Sortilin 之间的相互作用，进行了免疫印迹分析。获得野生型和 Sortilin-myc/His 标签转染的 3T3-L1 细胞的细胞裂解物和洗脱液，然后加载到 SDS 页面上。用抗 myc 抗体探测印迹。
印迹显示来自转染洗脱液的 110 千克多肽 Sortili-myc/His 标记和 5 千克素 myc 第一管腔环-GLUT4。接下来，为了研究 PH 的重要性以及固定在钴珠上的 Sortilin 与 GLUT4 之间的相互作用，进行了免疫印迹分析。在该测定中，Myc 第一管腔环 GLUT4 与 PH6 和 8 处固定有 Sortilin-myc/His 标签蛋白的珠子一起孵育。
印迹显示 Sortilin-myc/His 和 myc 第一管腔环 GLUT4 在 PH6 和 8 处均来自从 Sortilin-myc/His 标记的转染 3T3-L1 细胞获得的洗脱液中产生的明显相互作用。一旦掌握，这项技术可以在 3 到 4 小时内完成，直到样本准备好进行蛋白质血液分析。在尝试此程序时，重要的是要记住设计可溶的肽，最好是在水中。
为了增强您的结果，可以进行其他方法，例如交联后的免疫沉淀。观看此视频后，您应该对如何检测去污剂敏感程序中的膜蛋白、蛋白质相互作用有很好的了解。它还允许探索蛋白质片段之间的相互作用。
柔和的节奏爵士乐。
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概述
本文介绍了一种检测膜蛋白之间洗涤剂敏感性相互作用的协议，以分泌酶类的分类受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的结合为例。该方法旨在促进在生物化学相关环境中研究蛋白质相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 膜蛋白相互作用
- 蛋白质标记技术
背景
- 理解蛋白质相互作用在生物化学中至关重要。
- 膜蛋白通常需要特定条件来研究其相互作用。
- 洗涤剂敏感的方法为这些相互作用的动力学提供了洞察。
- 组氨酸和myc标记是常用的蛋白质检测技术。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来检测膜蛋白之间的相互作用。
- 强调使用洗涤剂敏感技术的优势。
- 为该领域的研究人员提供快速简便的协议。
使用的方法
- 在细胞中过表达组氨酸标记的蛋白质。
- 使用myc标记的肽进行相互作用研究。
- 应用洗涤剂敏感的检测方法来检测蛋白质相互作用。
- 分析sortilin和GLUT4之间的结合相互作用。
主要结果
- 该协议成功检测到膜蛋白之间的相互作用。
- 洗涤剂敏感性允许研究弱蛋白质相互作用。
- 结果证明了标记方法的有效性。
- 该程序对研究人员来说是高效且可重复的。
结论
- 该方法为膜蛋白相互作用提供了宝贵的洞察。
- 它可以应用于各种蛋白质相互作用研究。
- 未来的研究可以在此技术基础上进行更深入的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins addresses a critical gap in early discovery, where conventional co-immunoprecipitation fails to capture weak or transient luminal contacts. This assay enables biopharma teams to validate protein-protein interactions under native-like conditions, supporting mechanistic de-risking and target confidence at the portfolio triage stage. The method's adaptability to other membrane protein systems enhances its strategic value for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of weak or transient membrane protein interactions that are detergent-sensitive.
- Supports functional target validation by confirming direct binding events in a controlled biochemical context.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing true biological interactions from artifacts of harsh extraction conditions.
- Improves predictive confidence for advancing targets into downstream screening or validation workflows.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein interaction systems for downstream quantitative assays and screening platforms.
- Standardizes detection of protein-protein interactions using tagged constructs and reproducible Western blot readouts.
- Enables reproducible and scalable workflows for evaluating compound effects on membrane protein complexes.
- Supports reliable assay development for membrane protein interaction studies where detergent sensitivity is a concern.
Translational & Preclinical Research
- Provides mechanistic insight into disease-relevant membrane protein interactions when aligned with translational biomarker strategies.
- Ensures continuity from discovery-stage validation to preclinical model selection by confirming interaction specificity.
- Reduces risk of late-stage attrition due to undetected weak or context-dependent protein interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This assay fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling teams to validate membrane protein interactions before committing resources to large-scale screening or preclinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming direct protein-protein contacts under native-like conditions.
- Screening: Provides a reproducible, quantitative readout for interaction strength and specificity using Western blot analysis.
- Analytics: Delivers measurable outputs (e.g., band intensity, presence/absence) to compare interaction conditions such as pH sensitivity.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when membrane protein interactions are implicated in disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for diverse membrane protein systems beyond the initial sortilin-GLUT4 example.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane protein target validation.
- Operational Value: Delivers a standardized, rapid, and reproducible protocol for interaction detection.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by de-risking targets early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of membrane protein targets with validated interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein tagging, cell culture, and Western blot analysis.
- Needs access to mammalian expression systems, peptide synthesis, and analytical instrumentation for immunoblotting.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer conditions and tagging strategies for reproducibility.
- Adaptable to various membrane protein systems but may require optimization for peptide solubility and tag placement.
- Limited to interactions detectable under the chosen biochemical conditions; may not capture all physiologically relevant contacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Handling of the Peptide and Cells
3:02
Binding of His-tagged Proteins to the HisPur Cobalt Beads
4:39
Binding of the Peptide to the His-tagged Protein Immobilized on the Beads
5:59
Elution from Cobalt Beads
7:07
Electrophoresis, Western Blotting, and Analysis of Results
7:58
Results: Use of Immunoblot Assay to Study the Interaction between Sortilin Immobilized on Cobalt Beads and myc-tagged Peptide
9:18
Conclusion
