膜蛋白的绿色荧光蛋白为基础的表达筛选大肠杆菌
2015年1月6日
简化的方法来筛选重组膜蛋白的基础上融合绿色荧光蛋白大肠杆菌表达呈现。
该程序的总体目标是鉴定 SIA 大肠杆菌中表达的膜蛋白，用于结构和功能分析。首先，收获细菌，通过 SDS 页面分析，以便通过 Ingel 荧光可视化正确折叠的 GFP 蛋白。在第二步中，扩大经测定表达目标膜蛋白的大肠杆菌的生产，并在诱导蛋白质表达后从细胞制备总膜组分。
最后，总膜组分溶解在四种不同的去污剂中，并且去污剂的单分散性。溶解。通过尺寸排阻色谱分析 GFP 蛋白。最终，可以通过荧光监测蛋白质，并绘制 Eluciian 谱图，以评估样品中的聚集单分散性和游离 GFP。
由于溶解度低，用于结构和功能研究的重组膜蛋白的生产在技术上仍然具有挑战性，并且一旦提取到去污剂中，它们就会遗传不稳定性。经验表明，筛选来自不同物种的膜蛋白的多个变体（例如直系同源物）可以提高膜蛋白表达的成功率。融合成绿色荧光蛋白，用于报告真实的折叠。
我们基于 GFP 的方案用于膜蛋白和大肠杆菌表达筛选的第一步是使用来自全细胞的去污剂裂解物的 ingel 荧光来识别膜蛋白构建体，以便根据筛选中的表达水平进行进一步分析，然后使用荧光检测与尺寸排阻色谱联用来评估选择膜蛋白和不同去污剂的行为。这提供了有关去污剂蛋白复合物的单分散性的信息。为了分析 IPTG 诱导的细菌表达，首先将 1 毫升 IPTG 处理的 e coline 副本从过夜培养 24 个深孔块转移到 96 个深孔块中，密封块，然后在室温下以 6， 000 倍 G 离心细胞 10 分钟。
然后，倒置块以倒出介质，轻轻敲击纸巾以排出任何剩余的液体。再次密封板，并在至少 20 分钟后将细胞储存在零下 80 摄氏度。在室温下解冻沉淀 20 分钟，然后使用多通道移液器将细胞完全重悬于 200 μL 裂解缓冲液中。
用 20 μL DLPI 溶液处理细胞，以 1000 RPM 和 4 摄氏度振荡 10 分钟。然后向每个孔中加入 25 μL 10% doda 多面，并在振荡下将细胞再孵育 60 分钟。DDM 处理离心后，深孔封闭，然后将 10 μL 澄清的裂解物转移到微量滴定板中，并加入 10 μL SDS 页面凝胶上样缓冲液。
现在，每孔向凝胶中加入 10 μL 裂解物缓冲溶液，并在隔膜到达底部时，在冷藏室中以 100 至 120 伏的恒定电压运行凝胶 2 至 2.5 小时。将凝胶放在带有蓝光滤光片的成像仪上，以检测融合蛋白以扩大细胞培养物。转化 Eloqua 大肠杆菌后，将一个菌落采摘到 10 毫升能量肉汤中，在 37 摄氏度下过夜生长。
第二天早上，将 5 毫升过夜培养物稀释到 500 毫升能量肉汤中，并在 250 RPM 和 37 摄氏度下振荡继续培养培养物。当 595 纳米处的 OD 约为 0.5 时，通过添加 IPTG 至终浓度为 1 毫摩尔来诱导表达，然后将培养物放回摇床中过夜，这次是在 20 摄氏度下。第二天早上，通过离心收获细胞，并将沉淀储存在零下 80 摄氏度。
准备细胞膜。将第三个室温沉淀重悬于每克细胞沉淀 5 mL PBS 中，根据需要增加体积，直到粘度降低至稀稠度。然后向细胞中加入氯化镁至终浓度为 1 毫摩尔 DNA，终浓度为 10 μg/mL，每 20 g 细胞沉淀添加 1 片预包装蛋白酶抑制剂片剂。
接下来，使用冷却的细胞破碎机在 30 KPSI 的压力下打开细胞，然后在 30， 000 倍 G 和 4 摄氏度下沉淀未破碎的细胞和碎片 15 分钟。将旋腹液转移到超速离心管中，并通过在 200， 000 倍 G 和 4 摄氏度下旋转旋序物 1 小时来收集总膜分数。然后使用细胞匀浆器将膜沉淀重新悬浮在 10 毫升冰冷的 PBS 中，以溶解要使用的每种去污剂的膜。
将 900 μL 膜悬液分装到 1.5 mL聚乙烯离心管中。然后将 100 微升每种新鲜制备的洗涤剂加入适当的 1.5 毫升试管中，并在 4 摄氏度下与温和的植被一起孵育混合物。一小时后，用台式超速离心机沉淀去污剂和可溶性组分，确保试管至少半满并保留仰卧剂用于荧光检测尺寸排阻色谱或 FEC 分析。
接下来，使用具有较宽分级范围的 Equator 体积排阻柱，并以 0.3 mL/min 的速率运行流速缓冲液。然后以相同的流速将 100 微升溶解的膜样品注入色谱柱上，并使用荧光光学监测 Eluciian 曲线。最后，将 Elucian 体积和荧光强度数据导入电子表格程序中进行图形显示，并通过 ingel 荧光分析剩余的溶解膜材料。
如前所述，所述蛋白质家族对于细菌细胞分裂至关重要。在这些图像中，显示了 24 个 OUTTA 47 所述构建体的凝胶荧光可视化代表。条带的强度表示表达水平。
例如，泳道场景 4 中的融合蛋白在两个菌株中都表达良好。然而，额外的较低分子量条带表明蛋白质在许多泳道中部分降解。有一个条带的大小仅对应于 GFP。
例如，G 4 和 H 4 在 C 41 DE 三个 P 位于 S 菌株中被完全分解为游离 GFP。而在 LEMO 21 DE three 中，这些图表中有一些完整的蛋白质。通过荧光检测尺寸排阻对在初步筛选中表现良好的两种构建体进行分析，表明蛋白质的行为如何根据测试的四种去污剂中的哪一种而有所不同。
例如，这种蛋白质在 Dool Multiside 中仅产生一个对称峰，凋落物聚集，使其成为后续纯化的首选去污剂。相比之下，另一种融合蛋白在所有测试的去污剂中表现出相似的特征。该方案可以很容易地扩展为包括，例如，在不同表达条件下生长的不同大肠杆菌菌株，以及初级和二级筛选中的额外威慑剂。
总之，该方案的主要目的是能够在表达和去污方面筛选大量膜蛋白，以确定进一步分析的候选者。
概述
本研究提出了一种利用绿色荧光蛋白（GFP）融合简化方法，用于在大肠杆菌中筛选重组膜蛋白表达。该方法旨在促进膜蛋白的结构和功能分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质工程
背景
- 膜蛋白对各种细胞功能至关重要。
- 由于低溶解性，它们通常难以表达和纯化。
- 与GFP融合可以帮助监测蛋白质表达和折叠。
- 筛选多种蛋白质变体可以提高表达成功率。
研究目的
- 开发一种有效筛选膜蛋白表达的协议。
- 利用GFP评估膜蛋白的折叠和溶解性。
- 分析膜蛋白在不同洗涤剂中的行为。
使用的方法
- 收获大肠杆菌并通过SDS-PAGE分析裂解液。
- 扩大膜蛋白表达的培养物。
- 在各种洗涤剂中溶解膜蛋白部分。
- 使用尺寸排阻色谱法评估蛋白质复合物。
主要结果
- 成功识别膜蛋白，使用凝胶内荧光。
- 评估蛋白质在不同洗涤剂环境中的行为。
- 洞察溶解蛋白质的聚集和单色性。
- 展示蛋白质变体对表达成功的重要性。
结论
- 基于GFP的筛选方法对膜蛋白分析有效。
- 该方法可以提高功能性膜蛋白的产量。
- 进一步优化洗涤剂条件可能会提高溶解性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient identification of membrane protein constructs with robust expression and stability is a critical inflection point in early drug discovery and structural biology pipelines. The GFP-based screening workflow enables rapid triage of multiple variants, reducing resource expenditure on unstable or poorly expressed targets. This approach enhances predictive confidence for downstream investment in membrane protein targets relevant to pharmaceutical R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-throughput interrogation of membrane protein expression and folding across diverse orthologs.
- Supports biological de-risking by identifying constructs with minimal degradation and authentic folding.
- Facilitates prioritization of membrane protein targets for further mechanistic and structural studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated membrane protein constructs for downstream functional and structural assays.
- Standardizes assessment of protein integrity and expression using quantitative GFP fluorescence readouts.
- Enables reproducible screening of detergent compatibility to optimize assay conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns membrane protein candidate selection with requirements for structural elucidation and functional validation.
- Provides continuity from early expression screening to preclinical model development for membrane targets.
- Reduces risk of late-stage attrition due to instability or poor expression of membrane proteins.
Pipeline & Workflow Integration
This GFP-based screening method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting the transition from construct design to preclinical validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by screening multiple membrane protein variants for expression and stability.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for expression level and detergent compatibility, supporting assay readiness.
- Analytics: Provides fluorescence-based measurements and FSEC profiles to compare construct performance and aggregation.
- Translational Research: Facilitates selection of membrane protein candidates suitable for downstream structural and functional studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for membrane protein screening across diverse targets and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in membrane protein target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes and streamlines membrane protein screening for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by focusing resources on viable targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of membrane protein projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial expression, and fluorescence-based analytics.
- Needs access to SDS-PAGE, fluorescence imaging, and FSEC instrumentation.
- Demands cross-team standardization of construct design and screening criteria.
- Adaptable to different E. coli strains, expression conditions, and detergent panels as needed.
- Limited by the inherent variability of membrane protein expression and stability across orthologs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:58
Analysis of Isopropyl Beta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)-induced Expression by In-gel Flourescence
3:37
Scale-up of Cell Cultures and Membrane Preparation
5:30
Solubilization and Analysis of the Membrane Fraction
6:48
Results: Representative In-gel and FSEC Analyses
8:11
Conclusion
