Name: 膜蛋白的绿色荧光蛋白为基础的表达筛选大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习利用绿色荧光蛋白融合技术在大肠杆菌中筛选膜蛋白表达的方法。该方案结合无连接克隆、凝胶内荧光检测和荧光检测尺寸排阻色谱，快速评估蛋白质表达水平、完整性及去污剂相容性，助力结构生物学研究。

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英国牛津蛋白质生产设施（OPPF-UK）由英国医学研究理事会（资助号 MR/K018779/1）资助，膜蛋白实验室由惠康基金会（资助号 099165/Z/12/Z）资助。

1. 表达载体的构建
<ol>
	<li>使用PCR Infusion克隆技术，利用载体pOPINE-3C-GFP和pOPIN-N-GFP并行构建多达96个表达质粒，这两个载体分别在目标序列上添加可切割的C末端或N末端GFP-His6融合标签13&#160;。 
	注意：载体的选择取决于蛋白的拓扑结构，因为GFP必须在细胞质中表达。因此，对于N末端位于细胞质、C末端位于胞外的蛋白，应使用pOPIN-N-GFP；而对于N末端位于胞外、C末端位于细胞质的蛋白，则应使用pOPINE-3C-GFP。当两个末端均位于细胞质时，除非有功能上的原因不宜标记C末端，否则应使用pOPINE-3C-GFP。</li>
	<li>使用带有以下延伸序列的引物扩增编码膜蛋白的DNA序列： 
	pOPINE-3C-GFP（正向引物 — AGGAGATATACCATG；反向引物 — CAGAACTTCCAGTTT）和pOPIN-N-GFP（正向引物 — AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG；反向引物 — ATGGTCTAGAAAGCTTTA）。</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物。获得清晰的PCR产物后，向每个孔中加入5 U DpnI（用5 µl 1× DpnI反应缓冲液配制）。使用磁珠在96孔板中纯化PCR产物。 
	注意：DpnI用于去除模板质粒；若以基因组DNA为模板，则此步骤非必需。</li>
	<li>向PCR板的每孔中加入1 μl（100 ng）相应线性化载体。</li>
	<li>使用多通道移液器将x μl纯化的PCR插入片段加入PCR板的相应孔中。确保所有产物的浓度在10–250 ng范围内。</li>
	<li>向孔中加入(9-x) μl水，并将全部10 μl混合液转移至含有干燥In-Fusion试剂的管中。静置30秒。</li>
	<li>通过上下吹打短暂混匀内容物。将反应液转移回原始PCR板并密封。</li>
	<li>在PCR仪中于42 °C孵育30分钟。</li>
	<li>反应完成后立即转移至冰上，并加入40 μl TE缓冲液（10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA）。</li>
	<li>立即冷冻或转入感受态细胞中进行转化。转化时，每50 μl高感受态（&#62; 5 × 109 转化子/µg）E. coli细胞中加入3 µl稀释后的反应液。</li>
	<li>向24孔细胞培养板的每孔中加入1 ml LB琼脂，其中添加50 µg/ml羧苄青霉素（用于克隆时，需为构建体数量的2倍准备孔数）。</li>
	<li>在复苏培养后，将25 μl培养物及其1:5稀释液各25 μl涂布于含琼脂的24孔细胞培养板上。</li>
	<li>通过轻轻倾斜培养板使细胞均匀分布。</li>
	<li>在37 °C下开盖干燥10–15分钟，或在室温下于通风橱中干燥。</li>
	<li>盖上盖子并将培养板倒置，于37 °C过夜培养。</li>
	<li>挑取两个单菌落并进行质粒小量提取。</li>
	<li>使用构建体特异性的反向引物和载体特异性的正向引物（例如 pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG）通过PCR验证构建体。</li>
</ol>
2. E. coli 表达菌株的转化
注意： 在执行本方案之前， E. coli 感受态细胞按先前所述方法制备，分装后于 -80 °C 冻存13膜蛋白表达通常在两种菌株 Lemo21(DE3) 和 C41(DE3)pLysS 中进行常规筛选。为便于结果解读，建议包含一个阳性对照， 例如 表达GFP的质粒、已知可表达的与GFP融合的膜蛋白质粒，以及空载体阴性对照。
<ol>
	<li>将分装的 E. coli 在冰上解冻。向每份感受态细胞中加入 3 µl 小量提取的表达质粒。</li>
	<li>将混合物置于冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 42 °C 下热激细胞 30 秒。</li>
	<li>让细胞在冰上恢复 2 分钟，然后向每根试管中加入 300 µl 动力肉汤（power broth）。</li>
	<li>在 37 °C 静置培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>在 24 孔组织培养板中制备含 50 µg/ml 羧苄青霉素和 35 µg/ml 氯霉素的 LB 琼脂。向含有 Lemo21 (DE3) 的孔中加入鼠李糖，使其终浓度为 0.25 mM。 
	注意：若目标产物可能具有毒性，可在含有 C41(DE3) pLysS 的孔中添加 1% (w/v) 葡萄糖。</li>
	<li>从转化混合物中转移 30 µl 细胞至 LB 琼脂平板上。按照 1.13–1.15 步骤所述涂布并干燥平板。</li>
</ol>
3. 过夜起始培养物的制备
注意：始终在转化后的第二天制备过夜培养物，切勿使用陈旧的转化平板。
<ol>
	<li>向每个装有96孔深孔板的孔中加入0.7 ml power broth，补充50 µg/ml羧苄青霉素和35 µg/ml氯霉素。向含有Lemo21 (DE3)的孔中加入鼠李糖，使其终浓度为0.25 mM。可选地，向C41(DE3) pLysS中补充1% (w/v)葡萄糖；参见上文（2.6注释）。</li>
	<li>从过夜转化平板中挑取单个菌落接种至各孔中。用透气封板膜密封该板块。</li>
	<li>在37 °C条件下，将板块置于具有大振幅（例如 25 mm轨道）的摇床中以250 rpm振荡，或置于具有小振幅（例如 4.3 mm轨道）的摇床中以600 rpm振荡过夜。</li>
</ol>
4. 培养物的生长与诱导
<ol>
	<li>向24孔深孔板的每个孔中加入3 ml添加了50 µg/ml羧苄青霉素和35 µg/ml氯霉素的power broth。按照3.1节所述加入L-鼠李糖（和葡萄糖）。使用3 ml培养液体积，以便进行重复取样，并补偿透气封膜导致的水分蒸发。</li>
	<li>将Lemo21 (DE3) 或 C41(DE3) pLysS的过夜培养物各150 µl接种至24孔深孔板的每孔中，建立表达培养体系。</li>
	<li>在37 °C下振荡培养，直至整个培养板在595 nm处的平均光密度（O.D.）约为0.5。</li>
	<li>通过向培养物中加入IPTG至终浓度为1.0 mM，诱导蛋白表达。</li>
	<li>在20 °C下继续振荡培养过夜（18–20 小时）。</li>
</ol>
5. 凝胶内荧光分析表达
<ol>
	<li>重复取样。从每个孔中转移1 ml培养物至一个方形孔、锥底的96深孔板中。 
	注意： 若发生组织块破损，或需要测试其他去垢剂时，可进行重复取样。</li>
	<li>将样品密封后，于6,000 × g离心10分钟以收集细胞。</li>
	<li>倒置切块并倾去培养基。将切块轻轻 tapping 在纸巾上，以沥去残留的培养基。</li>
	<li>将培养板密封，并在 -80 °C 下保存至少 20 分钟。可选步骤：可在此处暂停实验，待方便时再继续进行后续处理。</li>
	<li>在室温下解冻沉淀物20分钟。</li>
	<li>使用多通道移液器或在4 °C下以1,000 rpm振荡10分钟的轨道摇床重悬&#160;细胞完全裂解于200 µl裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4,&#160;300 mM NaCl，10 mM 咪唑，1% v/v Tween 20，用 NaOH 调节 pH 至 8.0。</li>
	<li>加入20 µl DLPI溶液（20 µl DNase I（4,000单位/毫升）、20 mg溶菌酶和20 µl蛋白酶抑制剂混合液，加水至终体积为2 ml）。在4 °C下振荡孵育10分钟（约1,000 rpm）。</li>
	<li>加入 25 µl 的 10% n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）</li>
	<li>在 4 °C 下振荡孵育 60 分钟（约 1,000 rpm）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 6,000 × g 离心深孔板 30 分钟。</li>
	<li>将10 μl澄清裂解液转移至微孔板中，加入10 μl SDS-PAGE凝胶上样缓冲液（100 mM Tris，pH 6.8，4% w/v SDS，0.2% w/v溴酚蓝，10% v/v β-巯基乙醇，20% v/v甘油）。 警告！切勿煮沸样品.</li>
	<li>将5.11步骤中的样品10 μl加样至各孔，于冷室中在SDS-PAGE凝胶上以100–120 V（恒定电压）电泳，直至染料前沿到达胶底（2–2.5小时）。</li>
	<li>将凝胶置于成像仪上（例如 使用蓝光滤光片检测GFP融合蛋白。选择曝光时间以确保最亮的条带不饱和。</li>
</ol>
6. 细胞培养的放大
<ol>
	<li>按照第2节所述方法，将感受态大肠杆菌（E. coli）进行转化。</li>
	<li>挑取单菌落接种于10 ml增菌肉汤（按第3节所述添加补充物）中，于37 °C过夜培养。</li>
	<li>将5 ml过夜培养物转接至500 ml增菌肉汤中。</li>
	<li>在37 °C、250 rpm振荡培养，直至595 nm处的光密度（O.D.）约为0.5。</li>
	<li>加入IPTG至终浓度1.0 mM，诱导蛋白表达。</li>
	<li>于20 °C、250 rpm振荡条件下继续培养过夜。</li>
	<li>在5,000 × g离心15分钟收集菌体。</li>
	<li>弃去上清液。菌体沉淀可于-80 °C保存。</li>
</ol>
7. 膜的制备
<ol>
	<li>将细胞（如有必要）在室温下解冻，并用 5 ml 每克细胞沉淀的 1× PBS（pH 7.5）重悬；根据需要增加体积，直至黏度降低至可流动状态。&#160;加入&#160;MgCl2 至终浓度为 1 mM，DNAse I 至终浓度为 10 μg/ml，并每 20 g 细胞沉淀加入一片预包装的蛋白酶抑制剂。使用预冷的细胞破碎仪在 30 kpsi 压力下破碎细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 30,000 g 离心 15 分钟，沉淀未破碎的细胞和碎片。将上清液转移至超速离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，于超速离心机中以 200,000 × g 离心 1 小时，收集总膜组分。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>使用细胞匀浆器将膜沉淀重悬于 10 ml 冰冷的 PBS（pH 7.5）中。每种去垢剂需使用 1 ml 重悬的膜。可选步骤：在此阶段，可将膜悬液在液氮中快速冷冻，并于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
8. 膜组分的溶解与分析
<ol>
	<li>解冻膜组分（如有必要），针对每种用于溶解的去垢剂，将900 µl膜悬液分装至1.5 ml聚烯烃微量离心管中。</li>
	<li>向指定的1.5 ml离心管中各加入100 µl新配制的去垢剂（DDM、DM、Cymal-6和LDAO的10% w/v溶液），使终浓度为1%。在溶解真核膜蛋白时，可在去垢剂中添加胆固醇半琥珀酸酯（终浓度0.2%）。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育混合物 1 小时，同时进行轻柔振荡。</li>
	<li>使用台式超速离心机，在4 °C、150,000 g条件下离心45分钟，沉淀去污剂不溶性组分，确保离心管至少半满，并保留上清液。 
	注意： 可通过荧光酶标仪检测经去垢剂溶解的膜组分中的GFP荧光强度，并将不溶于去垢剂的组分重悬于相同体积的PBS中进行对照，以此评估去垢剂溶解的效果。</li>
	<li>使用荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）分析不同去垢剂-膜蛋白复合物的单分散性。</li>
	<li>用于FSEC分析时，使用具有宽分离范围的尺寸排阻柱，并用平衡缓冲液平衡该柱， 例如 分子量范围为5,000至5,000,000，使用洗脱缓冲液（20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.03% DDM），流速为0.3 ml/min。所有样品均使用此缓冲液，即 对于每种测试的去垢剂，该参数均保持不变。</li>
	<li>将100 µl溶解的膜样品以0.3 ml/min的流速注入色谱柱。使用荧光光学系统监测洗脱曲线（激发波长488 nm，发射波长512 nm）。若无在线荧光监测器，可收集洗脱组分，并在酶标仪中测定荧光信号。</li>
	<li>将洗脱体积和荧光强度数据导入电子表格程序以进行图形化展示。</li>
	<li>按照第5节所述方法，通过凝胶内荧光分析剩余的可溶化膜材料。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案中，将无需连接的克隆技术与绿色荧光蛋白报告载体结合，并联合荧光检测，以快速筛选多种膜蛋白的相对表达水平 E. coli载体可在四个工作日内构建完成，初步表达筛选则需额外一周时间。通过全细胞去垢剂裂解液的凝胶荧光分析对表达阳性克隆进行排序，以供后续二次筛选进一步分析。本方案所述的初步表达筛选除需要一个适用于深孔板培养细胞的摇床培养箱外，无需其他专业设备。所有涉及96孔SBS板的液体操作均可使用多通道移液器完成。该方案可轻松修改以包含其他 E.coli 在不同表达条件下培养的菌株（例如 较低温度下。对于 LEMO21(DE3) 菌株，通过调节添加的鼠李糖浓度（0 到 2.0 mM）以控制转录速率，可提高某些膜蛋白的表达水平7 . 初筛中可使用除DDM以外的其他去垢剂进行提取，但作用较强的去垢剂可能会溶解包涵体中的蛋白质，从而导致假阳性结果。显然，初始筛选步骤越复杂，实验耗时就越长。
二级筛选包括从初筛鉴定出的表达阳性克隆中制备总膜组分。这一步骤至关重要，因为它能够确认融合蛋白是否定位于大肠杆菌（E. coli）细胞的细胞膜上。随后通过荧光检测的尺寸排阻色谱法对不同去垢剂中提取的GFP融合蛋白进行可溶化材料分析，以评估去垢剂-蛋白复合物的单分散性。这是另一个关键步骤，因为它可确定最适合膜蛋白可溶化的去垢剂，以便后续下游处理。然而，经验表明，在纯化和结晶过程中可能仍需进一步优化去垢剂的选择。在不同去垢剂中表现出均一行为的证据——包括具有相对较小胶束尺寸的去垢剂（例如 LDAO）——似乎至少对于原核生物膜蛋白而言，是易于形成高质量衍射晶体的一个良好指标14。从这一角度来看，图2B中所示膜蛋白的谱图表现非常理想。
使用GFP报告基因的主要优势在于能够对未纯化的样品进行快速的表达检测。其缺点是，在将蛋白纯化用于结晶时，必须去除GFP融合蛋白。在本研究所用载体的情况下，可通过鼻病毒3C蛋白酶识别位点实现GFP的切割。 Alternatively，可将筛选中鉴定出的候选蛋白直接重新克隆至仅携带多聚组氨酸标签或其他亲和标签的载体中，以便后续纯化。但此方法的前提是GFP融合对蛋白表达并非必需。检测膜蛋白表达与溶解性的主要替代方案是仅添加组氨酸标签，然而该方法通常需要从膜组分开始实验。15 对于大量变异体的评估，这种方法将非常耗时。
总之，本文所述实验方案的主要目的是能够快速评估大量膜蛋白序列变异体的表达情况和去垢剂溶解性，并据此对这些变异体进行优先级排序，以进行更深入的分析。

据估计，膜蛋白占所有已测序基因组（包括人类基因组）中编码基因的约20%至30%12。鉴于膜蛋白在多种生物学过程中的关键作用，例如代谢物转运、能量生成以及作为药物靶点，人们对其三维结构的解析具有浓厚兴趣。然而，与可溶性蛋白相比，膜蛋白在蛋白质数据库（Protein Data Bank）中的结构代表严重不足。事实上，在PDB发布的99,624个结构中（<a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a>），仅有471个被归类为膜蛋白（<a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a>）。这一现象反映了研究膜蛋白所面临的技术难题，因为这类蛋白在天然状态下通常表达水平较低，视紫红质是少数例外之一3,4。在异源细胞中过表达重组蛋白时，常常导致蛋白错误折叠以及膜定位效率低下，从而限制了总体产量。此外，在膜蛋白表达后，选择最适的去垢剂进行提取和增溶，也给后续的纯化带来困难，需要进行细致的优化。
大肠杆菌 仍然是膜蛋白表达最常用的宿主，占72%（<a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a>) 目前已解析结构的蛋白质几乎全部来源于细菌。特异性 E. coli 菌株 C41(DE3) 和 C43(DE3) 已被分离出来，它们不会导致膜蛋白的过量表达，从而避免了在其他 BL21 菌株中观察到的毒性效应5,6调节重组膜蛋白的表达水平对于优化产量至关重要6,7.
在许多情况下，为获得可用于结构测定的膜蛋白，通常需要评估多种不同版本，包括氨基端和羧基端的缺失突变体、利用天然序列差异的多个直系同源物以及不同的融合蛋白6-8。因此，一种能够并行表达筛选多种膜蛋白的方法至关重要。一种常用的方法是将目标蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）融合，从而在无需纯化蛋白的情况下实现表达情况的追踪。通过这种方法，仅需少量未纯化的样品即可评估蛋白的表达水平、稳定性以及在不同去污剂中的行为特征9-12。
本文介绍了一种在大肠杆菌（E. coli）中克隆和表达膜蛋白的简化方案，通过与绿色荧光蛋白（GFP）融合作为蛋白表达的报告系统，并对去垢剂-蛋白复合物进行后续表征（图1）。

<table><tbody><tr><td>pOPIN-N-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pOPINE-3C-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C41(DE3)pLysS</td><td>Lucigen (http://lucigen.com/)</td><td>60444-1</td><td></td></tr><tr><td>LEMO21(DE3)</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>C2528H</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD EcoDry 克隆系统，96 次反应</td><td>Clontech/Takara</td><td>639688</td><td></td></tr><tr><td>Power broth</td><td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td><td>MD12-106-1</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>罗氏</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, 无 EDTA；蛋白酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>L-鼠李糖一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇半琥珀酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6512</td><td></td></tr><tr><td>CYMAL-6 (6-环己基-1-己基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷)</td><td>Anatrace</td><td>C326</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-十二烷基 &amp;beta;-麦芽糖苷)</td><td>Generon</td><td>D97002</td><td></td></tr><tr><td>DM (n-癸基 &amp;beta;-麦芽糖苷)</td><td>Generon</td><td>D99003</td><td></td></tr><tr><td>LDAO (&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基-n-十二烷基胺 &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-氧化物)</td><td>Generon</td><td>D71111</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Eq384 8&amp;nbsp;通道 1-30 &amp;micro;l</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>4672030</td><td></td></tr><tr><td>Rainin 移液器 Pipet-Lite XLS 6通道 100-1,200 &amp;micro;l LTS 间距器</td><td>Anachem</td><td>LA6-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>Rainin 移液器 Light XLS+ 8通道 2-20 &amp;micro;l LTS</td><td>Anachem</td><td>L8-20XLSPLUS</td><td></td></tr><tr><td>移液器 Pipet-Lite XLS 8通道 100-1,200 &amp;micro;l LTS 吸头</td><td>Anachem</td><td>L8-1200XLS</td><td></td></tr><tr><td>24 孔 V 底深孔板</td><td>Porvair Sciences</td><td>360115</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark 荧光蛋白标准品</td><td>Life Technologies</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi 蛋白凝胶，26 孔</td><td>Life Technologies</td><td>WG1203BOX</td><td></td></tr><tr><td>XCell4 SureLock Midi-Cell 电泳槽</td><td>Life Technologies</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>Vibramax 100 振荡器</td><td>Heidolph</td><td>544-21200-00</td><td></td></tr><tr><td>张力滚轮附件</td><td>Heidolph</td><td>549-81000-00</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 超速离心机，配备 45-Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP 超速离心机，配备 TLA-55 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>落地式离心机 Avanti J-26S XPI，配备 JA-17 和 JS-5.3 转子&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14535</td><td></td></tr><tr><td>Prominence UFLC 配 RF-20A 荧光检测器</td><td>岛津</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6 10/300 GL 尺寸排阻色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SSI5R-HS SHEL LAB 立式摇床培养箱，5 立方英尺 (144&amp;nbsp;L)，30-850 rpm</td><td>Shel Lab&amp;nbsp;</td><td>SSI5R-HS</td><td></td></tr><tr><td>Innova44R 培养箱</td><td>New Brunswick /Eppendorf</td><td>Innova44R</td><td></td></tr><tr><td>TS 系列 0.75 kW 破碎仪，230 V 50 Hz 1&amp;nbsp;相 (40 kpsi)</td><td>Constant Systems</td><td>PL083016</td><td></td></tr><tr><td>L-鼠李糖一水合物</td><td>Sigma</td><td>83650</td><td></td></tr></tbody></table>

基于绿色荧光蛋白的膜蛋白表达筛选 大肠杆菌

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

重组膜蛋白的制备在结构与功能研究中仍面临技术挑战，主要由于表达水平较低，以及许多膜蛋白在去垢剂中溶解后固有的不稳定性。本文描述了一种将膜蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）融合后进行无缝克隆，并在Escherichia coli中表达、通过GFP荧光检测的实验方案。该方法可实现多种膜蛋白或其变异体的构建与表达筛选，从而识别出值得进一步投入时间和精力的候选蛋白。在初步表达筛选中，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后观察GFP荧光来评估表达情况。选择表达水平高且降解最少（以无游离GFP为标志）的膜蛋白进入次级筛选。对这些构建体进行放大培养，并制备总膜组分，随后用四种不同的去垢剂进行溶解。经超速离心去除去垢剂不溶性物质后，采用荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）分析裂解液。通过GFP荧光监测尺寸排阻色谱图，可以获得膜蛋白在不同去垢剂中的单分散性与完整性信息。那些洗脱峰形对称、游离GFP极少或没有、且聚集最少的蛋白-去垢剂组合，可作为后续纯化的候选条件。采用上述方法，分析了来自47种不同细菌的SED（形态、伸长、分裂和孢子形成）蛋白在E. coli中的异源表达情况。这些蛋白通常含有十个跨膜结构域，对细胞分裂至关重要。结果显示，SED同源蛋白在E. coli中的表达水平和GFP融合蛋白的完整性差异显著，实验从中鉴定出一部分适合进一步研究的候选蛋白。

SEDS 蛋白家族（形态、伸长、分裂和孢子形成）对细菌细胞分裂至关重要。这些内在膜蛋白通常具有十个跨膜结构域，其氨基端和羧基端均位于细胞内。为了示范上述实验方案，将 47 个 SEDs 的直系同源基因克隆至载体 pOPINE-3C-eGFP 中。随后在两种 E. coli 菌株中对这些构建体进行了小规模表达筛选：Lemo21(DE3) 在含有 0.25 mM 鼠李糖的培养基中培养，以抑制泄漏表达；C41(DE3) pLysS 菌株则常用于膜蛋白的表达5-8。
对诱导培养物的去垢剂溶解裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。通过凝胶内荧光检测表达的GFP融合蛋白，结果显示在两种菌株中，47种SEDs构建物中有38种获得表达。有趣的是，两种表达菌株之间存在差异。在38种表达的构建物中，仅有18种在两种菌株中均表达，14种仅在Lemo21(DE3)中表达，6种仅在C41(DE3) pLysS中表达。总体而言，Lemo21(DE3)的表达成功率高于C41(DE3) pLysS（38 vs 24）。然而，部分蛋白呈现菌株特异性表达的现象表明，同时在这两种菌株中进行筛选具有实际意义。
图 1 展示了 47 种 SEDs 构建体中 24 种的代表性数据。图 1 中条带的强度可反映表达水平，例如，图 1A 和 1B 中 C4 孔的融合蛋白在两种菌株中均表达良好，但额外出现的较低分子量条带表明该蛋白发生了部分降解。许多泳道中均可见一条与单独 GFP 大小相符的条带。通过比较融合蛋白与游离 GFP 条带的强度，可对蛋白完整性进行定性评估；例如，在 C41(DE3) pLysS 菌株中，G4 和 H4 样品的融合蛋白完全降解为游离 GFP（图 1B），而在 Lemo21(DE3) 菌株中仍保留部分完整蛋白（图 1A）。在 38 种表达的蛋白中，有 14 种的游离 GFP 条带强度与融合蛋白相近，21 种的游离 GFP 条带强度高于融合蛋白，仅有少数融合蛋白（38 种中占 3 种，例如 图 1A 中的 F6 和 G6）的游离 GFP 含量相对融合蛋白而言较少。
在初筛中表达良好的两个构建体B5（游离GFP和融合蛋白条带强度高）和G6（游离GFP较少）被进一步表达，并从500 ml细胞培养物中制备了总膜组分。重悬的膜样品被分装后，通过荧光检测的尺寸排阻色谱法（FSEC）进行分析。FSEC图谱分别如图2A和图2B所示，结果显示这两个SEDs蛋白在所测试的四种去垢剂中表现出不同的行为。在一种情况下（图2A：样品B5），该蛋白仅在DDM中产生一个对称的峰，且聚集较少，因此DDM是后续纯化的首选去垢剂。相比之下，另一个融合蛋白（图2B：样品G6）在所有测试的去垢剂中均呈现出相似的图谱。
<img alt="克隆至FSEC流程图：步骤包括PCR、表达测试、筛选和荧光分析。" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：利用GFP报告蛋白筛选大肠杆菌（E. coli）中膜蛋白表达的工作流程示意图。
<img alt="显示GFP融合蛋白分离和游离GFP检测的凝胶电泳结果。" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：利用凝胶内荧光法对膜蛋白表达进行初筛。 对大肠杆菌（E. coli）细胞的去垢剂裂解液进行SDS-PAGE分析，并使用蓝光反射照明和530/28滤光片对凝胶成像。结果显示了24个构建体（根据其在96孔板中的位置标记为A4-H6）的结果。图中指出了游离GFP和GFP融合蛋白条带的位置。(A) 在Lemo21(DE3)中表达的蛋白。(B) 在C41(DE3) pLysS中表达的蛋白。
<img alt="凝胶过滤色谱图；GFP 蛋白洗脱；荧光强度 vs 体积；示意图。" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：利用荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）对膜蛋白表达进行的二次筛选。 从四种不同的去污剂中提取总膜组分，并使用与荧光检测器偶联的FPLC系统通过尺寸排阻色谱法分析溶解的膜蛋白。膜蛋白B5的FSEC图谱（A）和膜蛋白G6的FSEC图谱（B）。图中标示了对应于聚集蛋白、溶解的GFP融合蛋白和游离GFP的峰位置。色谱图下方标明了所测试的去污剂。

介绍了一种基于绿色荧光蛋白融合技术，用于在大肠杆菌（Escherichia coli）中快速筛选重组膜蛋白表达的简化方法。

重组膜蛋白的制备在结构与功能研究中仍面临技术挑战，主要由于表达水平较低以及……

本实验的总体目标是鉴定在 SIA 大肠杆菌中表达的膜蛋白，以进行结构与功能分析。首先，收集细菌，裂解后通过 SDS-PAGE 分离，并利用凝胶荧光法观察正确折叠的 GFP 蛋白。第二步，扩大表达目标膜蛋白的大肠杆菌的培养规模，在诱导蛋白表达后，从细胞中制备总膜组分。最后，将总膜组分溶于四种不同的去垢剂中，并通过尺寸排阻色谱分析去垢剂溶解后的GFP蛋白的单分散性。最终，可通过荧光检测这些蛋白，并绘制洗脱曲线，以评估样品中蛋白的聚集情况、单分散性以及游离GFP的存在。由于膜蛋白的溶解度较低，且在提取到去垢剂中后具有固有的不稳定性，因此为结构与功能研究生产重组膜蛋白在技术上仍然具有挑战性。已有经验表明，筛选来自不同物种的膜蛋白多种同源异构体（正交同源蛋白），可提高膜蛋白表达的成功率。通过与绿色荧光蛋白融合，可用于报告膜蛋白的正确折叠状态。在基于GFP的膜蛋白表达筛选实验方案中，第一步是利用全细胞去垢剂裂解液进行凝胶内荧光检测，以根据筛选中的表达水平确定用于进一步分析的膜蛋白构建体。随后通过将荧光检测与尺寸排阻色谱联用，评估膜蛋白在不同去垢剂中的行为，从而获得去垢剂-蛋白复合物均一性的相关信息。为分析IPTG诱导的细菌表达，首先将24孔深孔板中过夜培养的IPTG处理的E. coli菌液一式两份各1毫升转移至96孔深孔板中，密封深孔板后，在室温下以6,000 × g离心10分钟，沉淀细胞。随后，将离心管倒置，轻轻在纸巾上轻敲以倒出培养基并沥干残留液体。再次密封培养板，并在至少20分钟后将细胞置于负80摄氏度保存。在室温下解冻沉淀物20分钟，然后使用多通道移液器将细胞完全重悬于200微升裂解缓冲液中。将细胞与20 µL DLPI溶液在1000 RPM、4°C条件下振荡处理10分钟。然后向每孔加入25 µL 10%十二烷基肌氨酸钠（doda multiside），继续振荡孵育60分钟。DDM处理后，离心深孔板块，取10 µL上清裂解液转移至微孔板中，再加入10 µL SDS-PAGE凝胶上样缓冲液。现在每孔加入10 µL裂解缓冲液，然后在低温室中以100至120伏恒定电压电泳2至2.5小时，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。将凝胶置于带有蓝色光滤光片的成像仪上，以检测融合蛋白，从而扩大细胞培养规模。在将Eloqua转化入感受态大肠杆菌后，挑取单菌落接种于10 mL Power Broth中，在37 °C下过夜培养。次日早晨，将5毫升过夜培养物稀释至500毫升强力肉汤培养基中，继续在37摄氏度、250转/分钟振荡条件下培养。当595纳米处的光密度（OD）约为0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1毫摩尔，诱导表达，然后将培养物放回摇床，于20摄氏度继续培养过夜。次日早晨，通过离心收集细胞，并将菌体沉淀储存在负80摄氏度。为制备细胞膜，将第三个室温沉淀物按每克细胞沉淀加入5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重新悬浮，必要时增加体积，直至黏度降低至可流动状态。然后向细胞中加入氯化镁，使其终浓度为1毫摩尔/升，加入DNase使其终浓度为每毫升10微克，并每20克细胞沉淀加入一片预包装的蛋白酶抑制剂片剂。接下来，使用预冷的细胞破碎仪在30 KPSI的压力下裂解细胞，然后在30,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，沉淀未破碎的细胞和碎片。将上清液转移至超速离心管中，在200,000 × g、4 °C条件下离心1小时，收集总膜组分。然后使用细胞匀浆器将膜沉淀物重新悬浮于10 mL冰冻的PBS中，以便为每种待用的去垢剂溶解膜。将900微升膜悬液分装至1.5毫升聚丙烯离心管中。然后向各1.5毫升离心管中加入100微升新配制的去垢剂，并在4摄氏度下轻柔振荡孵育混合物。一小时后，使用台式超速离心机离心收集去垢剂和可溶性组分，确保离心管至少半满，并保留上清液用于荧光检测尺寸排阻色谱或FEC分析。接下来，使用一根具有宽分离范围的等度尺寸排阻色谱柱，并以每分钟0.3毫升的流速运行流动缓冲液。然后，在相同流速下将100微升溶解的膜样品注入色谱柱，并利用荧光光学系统监测洗脱曲线。最后，将洗脱体积和荧光强度数据导入电子表格程序进行图形化展示，并通过凝胶内荧光分析剩余的溶解膜材料。如前所述，这类蛋白质家族对细菌细胞分裂至关重要。在这些图像中，展示了47种所述构建体中24种的凝胶荧光可视化代表性结果。条带的强度反映了表达水平的高低。例如，第4泳道中融合蛋白在两种菌株中均表达良好。然而，额外出现的较低分子量条带表明该蛋白在多个泳道中发生了部分降解。存在一条与单独GFP大小相符的条带。例如，G4 和 H4 在 C41(DE3)pLysS 菌株中被完全降解为游离的 GFP；而在 LEMO21(DE3) 菌株中，这些图谱中仍存在部分完整的蛋白。通过对初筛中表现良好的两个构建体进行荧光检测尺寸排阻分析，可揭示这些蛋白在四种不同去垢剂测试条件下的行为差异。例如，该蛋白在Dool Multiside中仅产生一个对称峰，且无明显聚集，因此成为后续纯化的首选去垢剂。相比之下，另一种融合蛋白在所有测试的去垢剂中均表现出相似的图谱。本方案可轻松扩展，例如纳入在不同表达条件下培养的不同大肠杆菌菌株，以及在初筛和次筛中加入更多的去垢剂。总之，本实验方案的主要目的是对大量膜蛋白的表达及去垢剂处理条件进行筛选，以鉴定出可用于进一步分析的候选蛋白。

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使用表达增强型绿色荧光蛋白的Escherichia Coli评估小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用

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