Name: 小鼠单核细胞衍生树突状细胞的分离及与肿瘤免疫配合物的后体外活化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学习从小鼠血液和肿瘤中分离单核细胞衍生树突状细胞（MoDC）的方法，并使用肿瘤免疫配合物进行体外活化。该方案强调无菌操作的重要性，以避免细胞过早活化并确保实验结果准确反映其免疫刺激特性。

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以下方案涉及小鼠 MoDC 的分离，但其总体原则也可能适用于其他 DC 亚群细胞。12 至 16 周龄的 C57Bl/6j 小鼠饲养于经美国实验动物照护与使用认证协会（American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care）认证的动物实验设施中。所有实验方案均经斯坦福大学和特拉维夫大学机构动物照护与使用委员会批准。
1. 肿瘤相关单核细胞来源树突状细胞的分离
<ol>
	<li>在超净工作台中，将肿瘤从 CO 中取出2 处死小鼠并将肿瘤置于不含胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。 
	注意：建议在取肿瘤前将小鼠剃毛并用70%乙醇喷洒，以尽量减少毛发可能带来的污染。务必确保肿瘤直径不超过25 - 40 mm2 由于较大的肿瘤中树突状细胞（DC）数量较少，且这些细胞往往较为脆弱，容易发生细胞死亡。如果需要获得更多的DC，可将肿瘤细胞接种于每只小鼠的多个位点。</li>
	<li>在无菌超净工作台中，使用手术剪将肿瘤组织剪切成小块（约 1 x 1 mm）2).
	<ol>
		<li>将一只小鼠的全部肿瘤碎片加入含有磁力搅拌子的30 mL无菌平底管中，管内含5 mL Hank平衡盐溶液（HBSS）、2 mg/mL胶原酶IV和0.01 mg/mL DNase I。 
		注意：髓系细胞即使在稳态下也通过糖酵解产生能量。因此，只能使用含葡萄糖的培养基（如 HBSS、RPMI 和 DMEM），因为葡萄糖剥夺仅 10–15 分钟即可导致细胞在 24 小时内发生死亡和凋亡。务必使用低内毒素的胶原酶 IV，因为胶原酶由革兰氏阳性菌产生艰难梭菌（Clostridium histolyticum）.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37℃下以约200 - 400 rpm搅拌 o在含磁力搅拌器的C培养箱中孵育20-30分钟。</li>
	<li>加入5 mL完全培养基，充分重悬。</li>
	<li>通过70 µm细胞筛过滤细胞，4 ℃下离心 o400 rcf 离心 5 - 10 分钟，使细胞沉淀。 
	注意：酶消化后请勿直接尝试分离细胞，因为某些肿瘤存在坏死，含有相对大量的细胞碎片或细胞外基质。应将细胞置于15%密度梯度介质中，以获得纯净的细胞。</li>
	<li>将9 mL密度梯度介质与1 mL 10×PBS混合以调节渗透压，制备100% Percoll储存液。取1.5 mL密度梯度介质储存液与8.5 mL HBSS混合，并与肿瘤来源的细胞沉淀充分混匀。在15%密度梯度介质上方轻柔铺加2 mL DMEM，于室温下以400 rcf离心20分钟。弃去上清液，细胞将形成沉淀位于离心管底部。
	<ol>
		<li>将沉淀的细胞用含有2% FBS、1%青霉素/链霉素和10 mM EDTA的10 mL HBSS（分离缓冲液）重悬，洗涤两次，每次在4℃下离心 o400 × g 离心 5–10 分钟以沉淀细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板在光学显微镜下利用台盼蓝对细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重悬 1 × 108 1 mL 分离缓冲液中重悬细胞，并在 4 ℃ 下孵育 oC，加入30 μL CD11b+ 结合磁珠15分钟。 
	注意：避免使用CD11c偶联磁珠，因其会激活树突状细胞并诱导细胞死亡。切勿尝试用抗CD16/32抗体阻断FcγRII和FcγRIII。阻断性抗体会与FcγR结合，引发MAP激酶的强烈磷酸化，并使树突状细胞致敏。
	<ol>
		<li>加入 9 mL 分离缓冲液，去除未结合的磁珠，于 4 ℃ 以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸弃上清液，将细胞重悬于1 mL分离缓冲液中。将细胞上样至预清洗的磁性柱中。用3 mL分离缓冲液洗涤磁柱两次。
	<ol>
		<li>将柱子从磁铁上取下。用移液器将6 mL分离缓冲液加到柱子上，推动活塞，将磁标记细胞冲洗至无菌收集管中。在4℃下以400 rcf离心5–10分钟 oC.</li>
		<li>以每 1 × 10⁶ 个细胞 100 μL 重悬细胞7 细胞并用以下荧光染料标记的抗体染色：谱系阴性（TCRb、Siglec F、B220、CD19、FceRI）&#160;和 Ly6G）&#160;MHCII，Ly-6C</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）圈选小细胞，并在添加了5 ng/mL GM-CSF的完全培养基中培养。将细胞在37℃孵育1小时。&#160;oC，以使巨噬细胞贴壁。随后，将未贴壁的松散非黏附细胞转移至新的培养皿中。 
	注意：小鼠 MoDC 定义为 CD11b+/CD11c+/MHCII你好/Ly6Clo/int 7,26,27Ly6C 的表达在不同肿瘤模型之间可能存在显著差异，在某些模型（例如 LMP）中，单核细胞来源的树突状细胞完全不表达 Ly6C。总体而言，一个 100 mm3 B16F10 肿瘤通常含有 5 x 104 的DC，得到约4 - 5 x 106 总细胞中，免疫细胞占10-15%，其中MoDC占8-10%。通过在多个位点接种肿瘤细胞可增加DC数量。分选时仅选择小颗粒SSC/FSC细胞，因为其他髓系细胞也可能表达CD11c和Ly6C等标志物。&#160; 
	可选：根据小的SSC/FSC特征及表达Ly6C，分选肿瘤浸润的单核细胞你好 且MHCII呈阴性。随后，培养单核细胞 体外 加入50 ng/mL GM-CSF以获得树突状细胞（DC）。</li>
</ol>
2. 从外周血中分离单核细胞来源的树突状细胞
注意：由于成熟的小鼠树突状细胞（MoDCs）在小鼠血液中相对稀少，以下方案描述的是其衍生方法 体外 从分选的单核细胞中。
<ol>
	<li>为了提高血液中单核细胞的水平，使用 4% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并在皮下（s.c.）注射 1 μg 的 GM-CSF 溶于 50 μL PBS 中。</li>
	<li>1–2 小时后，使用 CO2 处死小鼠。 
	注意：不要采用颈椎脱位法处死小鼠，因为这会导致内出血。</li>
	<li>安乐死后立即用 70% 乙醇喷洒小鼠，在无菌超净工作台中使用手术剪剪除覆盖心脏的皮肤。用乙醇清洁剪刀后剪开右心房。使用 10 mL 注射器和 25 号针头，通过右心室缓慢灌注 20 mM EDTA 的 HBSS 溶液冲洗心脏。
	<ol>
		<li>用无菌注射器从胸膜腔中抽取血液，收集至含有肝素硫酸盐和 EDTA 的无菌试管中。持续灌注心脏，直至肝脏和肺部变为粉红色或白色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将血液加至密度梯度介质上，于室温下以 400 rcf 离心 15 分钟，刹车设置为低档。 
	注意：使用无内毒素的密度梯度介质（通常每毫升内毒素含量低于 0.12 EU）。
	<ol>
		<li>将单个核细胞收集至新试管中。用 10 mL 含 2% FBS、1% 青霉素/链霉素和 10 mM EDTA 的 HBSS（分离缓冲液）重悬细胞进行洗涤，然后在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5–10 分钟，使细胞沉淀。 
		注意：仅使用葡萄糖含量至少为 1 g/L 的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 CD11b 阳性筛选，将 1 × 108 个细胞重悬于 1 mL 分离缓冲液中，在 4 oC 下与 50 μL CD11b 偶联磁珠孵育 15 分钟。
	<ol>
		<li>加入 9 mL 分离缓冲液洗涤未结合的磁珠，在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5–10 分钟。吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL 分离缓冲液中。按照制造商说明书，将细胞上样至预清洗的磁性分离柱中。</li>
		<li>将分离柱从磁架上取下，用移液器加入 6 mL 分离缓冲液，并推动推杆将磁性标记的细胞冲洗至无菌收集管中。在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5–10 分钟。用 3 mL 分离缓冲液洗涤分离柱两次。</li>
		<li>将细胞重悬于 1 × 107 个细胞/100 μL 分离缓冲液中，并使用以下荧光素偶联抗体进行染色：每 1 × 106 个细胞加入 0.1 μg CD115、0.25 μg MHCII 和 0.1 μg Ly-6C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过设门选择侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC）较小的细胞进行分选。 
	注：小鼠炎症性单核细胞通常定义为 CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Chi，而巡逻型单核细胞定义为 CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4,5。当无需区分这两个亚群时，可分选总的 SSClo/FSClo/CD115+/MHCIIlo 细胞。在正常小鼠和荷瘤小鼠中，每 1 mL 血液中约含有 5–8 × 104 个 MoDC，注射 GM-CSF 后可增至 4–5 × 105 个 MoDC。其中约 70% 为炎症性单核细胞，30% 为巡逻型单核细胞。</li>
	<li>将细胞以 1 × 106 个细胞/mL 的浓度接种于补充了 20 ng/mL GM-CSF 的完全培养基中。培养 1 天后，将非贴壁和松散贴壁的细胞转移至新培养板，继续培养 4–5 天。 
	注意：树突状细胞培养基中不应添加丙酮酸钠。</li>
</ol>
3. 肿瘤-IgG 免疫复合物的制备
<ol>
	<li>在完全 DMEM 培养基中，将肿瘤细胞于 75 cm2 培养瓶中培养至 70% 汇合度。
	<ol>
		<li>加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 以使细胞从培养瓶中脱落，并在光学显微镜下监测细胞形态，避免过度消化。</li>
		<li>每 2 mL 胰蛋白酶加入 8 mL 完全培养基以抑制胰蛋白酶消化作用，然后在 4 oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟以收集细胞。 
		注意：必须使用商用 PCR 试剂盒检测肿瘤细胞中是否存在Mycoplasma。使用Limulus Amebocyte Lysate（LAL）试验检测革兰氏阴性菌和真菌内毒素的存在28。血清必须经 0.22 μM 滤膜过滤，并检测是否含有联邦法规 9 项病毒。此外，将 100–200 μL 培养基或血清滴加至 LB 琼脂或肉汤中，在 37 oC 培养 2 天进行检测。</li>
		<li>用 10 mL PBS 重悬细胞以去除残留的胰蛋白酶和血清，在 400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。吸除上清液，并重复洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下用 1.8% 缓冲的多聚甲醛固定细胞 10 分钟。
	<ol>
		<li>用 10 mL PBS 重悬细胞进行洗涤，在 4 oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，并重复洗涤两次。 
		可选步骤：对于肿瘤摄取实验，可将细胞在含 1 μM 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的 PBS 中于 37 oC 孵育 5 分钟进行标记。随后在冰上用完全培养基淬灭 CFSE 10 分钟。应用含 2% 血清的 PBS 对细胞进行充分洗涤，以去除残留染料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于 FACS 缓冲液（含 2% FCS 和 5 mM EDTA 的 PBS）中，并加入 0.5 μg/mL 抗 CD16/32 抗体，以阻断潜在的非特异性蛋白-蛋白相互作用。以每 100 μL 含 1 × 105 个细胞的浓度接种至 U 型 96 孔板中。
	<ol>
		<li>加入不同稀释浓度的肿瘤结合抗体，范围为每 1 × 105 个细胞 5 μg 至 5 ng。将板置于冰上孵育 15–20 分钟。 
		注意：IgG 抗体从未经处理的 20–24 周龄雌性小鼠血清中提取，通过蛋白 A 柱纯化获得，方法如文献所述24。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔加入 150 μL PBS 洗涤细胞，然后在 4 oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。
	<ol>
		<li>弃去上清液，重复洗涤两次。将细胞重悬于含荧光素标记的二抗的 100 μL FACS 缓冲液中。将板置于冰上孵育 20 分钟。</li>
		<li>每孔加入 200 μL FACS 缓冲液洗涤细胞，在 400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。弃去上清液，并重复洗涤一次。</li>
		<li>通过流式细胞术分析肿瘤结合情况，并确定包被细胞所需的最低抗体浓度。 
		注意：与同型对照相比，若抗体未能使染色肿瘤细胞的平均荧光强度（MFI）至少增加五倍，则不应在后续功能实验中使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用肿瘤-IgG 免疫复合物激活 MoDC
<ol>
	<li>按照第 3.1 至 3.4.3 节所述，用最低浓度的 IgG 包被肿瘤细胞。
	<ol>
		<li>在用肿瘤免疫复合物（IC）激活 MoDC 的前一天，更换含有 GM-CSF 的 MoDC 培养基。操作时，轻柔吸除培养基，并用预热的完全培养基洗涤细胞一次。 
		注意：分选后，分离得到的成熟肿瘤相关 MoDC 应在不含 GM-CSF 的完全培养基中培养至少 2 - 3 小时（或过夜），然后再用 IC 激活。</li>
		<li>进行肿瘤摄取分析时，将 CFSE 标记的肿瘤 IC 以 1:5（IC:MoDC）的比例加入 MoDC 中，每 1 × 106 个 DC 使用 1 mL 完全培养基，于 12 - 16 小时内过夜孵育。</li>
		<li>进行 MoDC 激活实验的流式细胞术（FACS）分析时，以 1:1（IC:MoDC）的比例加入肿瘤 IC，并过夜孵育 12 - 16 小时。 
		注意：强烈建议设置阳性对照孔，其中 MoDC 使用 1 μg/mL 的 LPS 或其他 TLR 激动剂进行刺激。</li>
		<li>过夜激活后，吸除上清液，并用分离缓冲液或 10 mM EDTA HBSS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
		<li>为使 DC 从培养板上脱落，将细胞在含有 10 mM EDTA 的 1 mL HBSS 中孵育 2 - 3 分钟，并通过剧烈吹打使细胞脱落。</li>
		<li>以 400 rcf 离心细胞，将 1 × 106 个 DC 重悬于 90 μL 含 2% FCS 和 5 mM EDTA 的 PBS（FACS 缓冲液）中，并加入 0.5 μg 阻断抗体。冰上孵育 5 - 10 分钟。</li>
		<li>向细胞中加入 10 μL 染色抗体混合物，冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>向细胞中加入 2 mL FACS 缓冲液，并在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。
	<ol>
		<li>在上机检测前 1 - 2 分钟加入 0.5 - 1 μg/mL 的 DAPI，以排除死细胞。DAPI 孵育时间不宜过长，因为 MoDC 会在 10 - 15 分钟内摄取 DAPI。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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所有作者声明均无利益冲突，且无任何需要披露的内容。

由于小鼠疫苗接种所需的树突状细胞（DC）数量较大（每只小鼠约需 2–4 × 106 个 DC），大多数小鼠疫苗接种策略均基于从小鼠骨髓（BM）和脾脏中分离 DC，随后进行体外（ex vivo）激活。然而，尝试在体内（in vivo）使用相同条件激活肿瘤相关 DC 时，往往难以诱导有效的免疫应答。Carmi et al. 在相继发表的两篇论文中发现，血液和肿瘤中的单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）与脾脏及骨髓来源的 DC 存在显著差异：前者天然具有较高的酪氨酸磷酸酶本底水平，因此在使用 IC24,25 激活前需要预先启动。此外，这些结果进一步强调了采取额外预防措施的必要性，以维持 DC 处于更接近其生理状态的激活水平。因此，本实验方案旨在详细描述从肿瘤组织和外周循环中分离 MoDC 的操作流程，并重点指出可能导致其过早激活的关键步骤。
首先，为了从血液和肿瘤中获得足够数量的树突状细胞（DC）...

自发现以来，树突状细胞（DC）因其独特调控T细胞分化的潜能而成为广泛研究的焦点1。在过去几十年中，大量研究致力于定义各种DC亚群及其在肿瘤进展与免疫反应中的功能2。DC由异质性细胞群体组成，彼此在模式识别受体、组织分布以及迁移和抗原提呈能力方面存在差异3,4,5。与其他DC亚群相比，单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）在肿瘤中更为丰富，并且可由循环或肿瘤浸润的单核细胞轻松诱导生成6,7。因此，许多旨在利用其相对高丰度的临床试验均基于对自体MoDC进行体内（in vivo）和体外（ex vivo）操控，以激发T细胞免疫应答8,9。
类似地，基于树突状细胞（DC）的实验性肿瘤模型疫苗接种需要每隔5至7天进行2到3次连续注射，每次注射1-2 × 106个经肿瘤抗原刺激活化的DC。因此，为了获得足够数量的DC，大多数小鼠研究主要采用在GM-CSF中培养7至9天由骨髓（BM）前体细胞分化而来的单核细胞来源树突状细胞（MoDC）（在小鼠体系中无需添加IL-4）10,11。然而，由于GM-CSF基因敲除小鼠的DC区室总体正常12,13，且该培养方法获得的细胞群体成分混杂14，这些体外诱导DC的生理相关性已受到质疑。
此外，树突状细胞（DC）也可常规性地从脾细胞中分离获得。然而，DC仅占总脾细胞的约0.3%-0.8%（相当于每只小鼠脾脏中约7 × 105个DC），而在这些细胞中，仅有CD103+ DC和单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够迁移回淋巴器官。由于MoDC约占脾脏DC群体的10%-15%15,16，大多数分离方案每只脾脏仅能获得约1 × 105个MoDC。通过注射可分泌GM-CSF的转染B16细胞可实现MoDC的扩增，从而使脾脏中的MoDC数量增加约100倍17。然而，由于该方法无法应用于人类，且所获得的MoDC已处于高度活化状态，因此MoDC在树突状细胞疫苗开发中的应用受到限制。
除了获得足够数量的DC外，开发针对自体癌细胞的有效DC疫苗面临的另一个挑战是肿瘤微环境中缺乏足够的危险信号来充分激活DC。共刺激信号的诱导通常通过激活模式识别受体（PRR）或C型凝集素信号通路实现18,19,20,21。另一种激活DC的策略是利用其通过表面Fcγ受体（FcγR）与抗原相互作用而摄取抗原的能力。事实上，已有若干重要文献表明，在预防性条件下，将来源于骨髓前体细胞并经肿瘤-IgG免疫复合物激活的MoDC注射入体内，不仅可以抑制肿瘤生长，还可实现对已形成肿瘤的根除22,23。
在最近发表的两篇论文中，Carmi et al. 发现，与骨髓来源的树突状细胞（BMDC）和脾脏树突状细胞不同，来自血液和肿瘤的单核细胞来源树突状细胞（MoDC）在缺乏额外刺激的情况下无法对IgG免疫复合物（IC）产生应答。该现象被证实是由于细胞内存在高水平的酪氨酸磷酸酶，从而调控FcγR信号通路24,25。该研究通过定义树突状细胞中的一个关键检查点，为基于树突状细胞疫苗的成功接种条件提供了重要见解。需要额外刺激才能启动FcγR信号通路，以及可能依赖类似磷酸化级联反应的其他凝集素受体的信号传导，因此强调了在分离树突状细胞过程中应避免其过早活化的必要性。
因此，本方案描述了从血液和肿瘤中分离单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的方法，这些细胞与骨髓和脾脏来源的树突状细胞存在显著差异，并强调了操作过程中值得重视的注意事项。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>StemCell Technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 单核细胞分离试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>19861</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Sigma</td><td>C9697-50MG</td><td>每批次均需检测内毒素</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-10MG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td>每批次均需检测内毒素</td></tr><tr><td>PE-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117307</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101211</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 MHCII</td><td>Biolegend</td><td>107641</td><td></td></tr><tr><td>AF48- CD86</td><td>Biolegend</td><td>105017</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-Ly-C6</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-CD15</td><td>Biolegend</td><td>135523</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

树突状细胞（DC）是一类异质性的细胞群体，其在细胞膜标志物、迁移模式与分布，以及抗原呈递和T细胞活化能力方面均存在差异。由于大多数实验性肿瘤模型的疫苗接种需要数百万的DC，这些细胞通常广泛地从骨髓或脾脏中分离获得。然而，这些来源的DC在对免疫复合物（IC）的反应性上，与血液和肿瘤来源的DC存在显著差异，对其他与Syk偶联的凝集素受体的反应性也可能不同。尤为重要的是，鉴于DC对危险相关分子的高度敏感性，在分离过程中的任一步骤若存在内毒素或可交联活化受体的抗体，均可能导致DC被提前活化，从而影响其后续活化所需的参数，或至少影响所需剂量。因此，本文详细描述了一种从血液和肿瘤中分离单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）并避免其过早活化的实验方案。此外，还提供了一套使用肿瘤来源免疫复合物活化MoDC及其后续分析的完整流程。

我们首先比较了来自未经免疫的同系和异系小鼠的抗体与肿瘤细胞结合的能力。为此，将B16F10和LMP肿瘤细胞系用多聚甲醛固定并充分洗涤。B16F10是一种黑色素瘤细胞系，最初分离自C57Bl/6小鼠的肺转移灶。LMP是一种胰腺肿瘤细胞，源自KrasG12D/+、LSL-Trp53R172H/+和Pdx-1-Cre小鼠，并可在129F1小鼠中稳定生长。为获得免疫复合物（IC），将肿瘤细胞在冰上与抗体孵育20分钟 2 μg 每1×10⁶个同基因型或异基因型IgG5 肿瘤细胞。IgG和IgM抗体从20-24周龄未免疫小鼠的循环血液中通过蛋白A分离，随后按所述方法进行尺寸排阻色谱纯化24细胞随后被洗涤，并用PE标记的鼠抗小鼠IgG二抗染色，通过流式细胞仪分析平均荧光强度。如图所示 图1A，来自C57Bl/6同种异体小鼠的IgG抗体结合LMP肿瘤细胞 离体 比来自129S1同系小鼠的抗体效果强得多。类似地，用129S1异系IgG对固定的B...

单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。

树突状细胞（DC）是一类异质性细胞群体，它们在细胞膜标志物、迁移模式与分布，以及功能特性等方面存在差异。

该方法旨在帮助科学家从小鼠肿瘤模型的血液和肿瘤组织中分离出单核细胞来源的树突状细胞（DCs），以研究其免疫刺激特性。我认为，与其它方法相比，该方案的主要优势在于所获得的单核细胞来源的树突状细胞更能真实反映其在肿瘤和血液中的活化状态。实验过程中最困难的部分可能是确保所有试剂和工具均保持无菌，并且在操作中避免引入污染。我从事从肿瘤中分离髓系细胞和树突状细胞的工作已有15年多，当我发现不同的分离方案会导致细胞活化模式不同时，便萌生了这一方法的想法。本次实验操作将由我实验室的研究生Santana-Magal女士进行演示。在超净工作台内使用二氧化碳处死小鼠后，取出肿瘤并将其置于不含胎牛血清的 RPMI 培养基中。随后，使用手术剪将肿瘤剪切成小块。将单只小鼠的所有肿瘤组织块转移至含有 HBSS 缓冲液的 30 毫升平底管中，该缓冲液需添加胶原酶 IV 和 DNase I，并放入磁力搅拌子。将含有肿瘤组织块的离心管置于摇床中，37摄氏度下以内部磁力搅拌器以200至400转/分钟的速度振荡孵育20至30分钟。接着，通过70微米细胞滤网过滤细胞。然后，在4摄氏度下以400 × g离心5至10分钟。离心后，将1.5毫升密度梯度介质储备液加入8.5毫升HBSS中。然后，剧烈混匀密度梯度介质。接着，用移液器将混合液转移至沉淀物中。将细胞悬液在室温下以400 × g离心20分钟。离心结束后倾去上清液。将沉淀的细胞洗涤两次后，重悬于1毫升分离缓冲液中。将细胞悬液加入30 µL CD11b偶联磁珠中。接着，在4°C下孵育15分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL分离缓冲液中。将细胞悬液加入经预洗涤的磁性柱中。接着，用3毫升分离缓冲液洗涤柱子两次。然后，将柱子从磁铁上取下。接下来，向柱中加入6毫升分离缓冲液。用活塞推动，将磁性标记的细胞冲洗至无菌收集管中。再次于4°C下以400 × g离心5至10分钟。重悬并染色细胞后，通过门控小细胞（依据较小的侧向散射和前向散射）进行细胞分选。安乐死后，用70%乙醇喷洒小鼠，然后在超净工作台内使用手术剪去除覆盖心脏的皮肤。接下来，用乙醇清洁剪刀。用 20 毫摩尔 EDTA HBSS 冲洗心腔，并用剪刀剪开心脏的右心房。然后，使用带有 25 号针头的 10 毫升注射器，缓慢用 20 毫摩尔 EDTA HBSS 灌注心脏的右心室。然后，使用无菌注射器从胸膜腔抽取血液。将血液转移至含有肝素硫酸盐和EDTA的试管中。接着，用移液器将血液加至密度梯度介质上。在室温下以400 × g离心力、低刹车条件下离心血液细胞15分钟。离心后，收集单个核细胞至离心管中。用10 mL分离缓冲液重悬细胞以洗涤细胞。再次在4 °C条件下，以400 × g离心细胞5至10分钟。为筛选CD11b细胞，将细胞沉淀重悬于1 mL分离缓冲液中。在4 °C条件下，加入50 µL与磁珠偶联的CD11b抗体，孵育15分钟。在4 °C条件下，以400 × g离心5至10分钟。然后，弃去上清液。用1 mL分离缓冲液重悬沉淀。接下来，将细胞悬液加入经预洗涤的磁性柱中。用分离缓冲液洗涤柱子两次。将柱子从磁铁上取下，然后在柱子中加入6 mL分离缓冲液。接下来，推动活塞，将磁性标记的细胞冲洗至无菌收集管中。在4°C条件下，以400 × g离心5到10分钟。用分离缓冲液重悬细胞，并使用荧光染料偶联抗体进行染色。通过使用较小的侧向散射和较小的前向散射圈选小细胞来分选细胞。首先，在室温下用1.8%缓冲的多聚甲醛固定细胞10分钟。将细胞悬液接种至U型96孔板的每孔中。接下来，在每个孔中加入不同稀释度的肿瘤结合抗体。随后，将细胞在冰上孵育15至20分钟。孵育结束后，用150 µL磷酸盐缓冲液洗涤细胞。然后在4 °C条件下以400 × g离心5至10分钟。离心后弃去上清液，并将细胞洗涤两次。用含有荧光染料标记的二抗的100 µL FACS缓冲液重悬细胞。接下来，将培养板置于冰上孵育15至20分钟。孵育15至20分钟后，加入200 µL FACS缓冲液以洗涤细胞。以400 × g离心5至10分钟。弃去上清液。通过流式细胞术分析肿瘤结合情况，并确定包被细胞所需的最低免疫球蛋白G浓度。当细胞被最低浓度的免疫球蛋白G包被后，按1:5的比例将CFSE标记的肿瘤免疫复合物加入单核细胞来源的树突状细胞中。然后，在完全培养基中于4°C孵育混合物12至16小时过夜。对单核细胞来源的树突状细胞活化进行流式细胞术（FACS）分析。通过流式细胞术分析计算平均荧光强度，以研究体外条件下结合LMP肿瘤细胞的IgG和M抗体的存在情况。结果表明，来自C57-Black/6同种异体小鼠的IgG抗体与肿瘤细胞的结合强度明显高于129S1同系小鼠的抗体。随后计算B16F10肿瘤细胞与IgG结合能力的平均荧光强度。结果显示，来自129S1同种异体小鼠的IgG与B16F10肿瘤细胞的染色强度比来自C57-Black/6同系小鼠的IgG高出10倍。接下来，采集DIC显微图像，以显示来自B16F10肿瘤的与肿瘤相关、由单核细胞衍生的树突状细胞。此处采集的DIC图像用于展示从荷B16F10肿瘤小鼠血液中分离出的炎症性及巡逻型单核细胞衍生的树突状细胞。此外，还通过流式细胞术分析，在与免疫复合物共孵育后，比较来自脾脏和骨髓的单核细胞衍生树突状细胞与来自肿瘤和血液的细胞的活化模式。结果显示，骨髓和脾脏树突状细胞在免疫复合物作用下，CD86 和 MHC II 的表达增加。随后进行共聚焦免疫组织化学检测，显示当树突状细胞与 CFSE 标记的肿瘤免疫复合物共孵育时，可观察到肿瘤摄取及 MHC II 的表达。一旦掌握该技术，根据所使用小鼠的数量，该操作可在数小时内完成。进行此操作时，重要的是要始终确保所有试剂和工具保持无菌。小鼠的毛发是污染的主要来源。务必确保毛发不会接触到您的组织样本。我们希望在观看本视频后，您能够充分掌握如何从小鼠血液和肿瘤中分离单核细胞来源的树突状细胞，以及如何随后使用免疫复合物细胞对其进行激活，同时避免其过早激活的方法。

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