小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

该方法旨在帮助科学家从小鼠肿瘤模型的血液和肿瘤组织中分离出单核细胞来源的树突状细胞（DCs），以研究其免疫刺激特性。我认为，与其它方法相比，该方案的主要优势在于所获得的单核细胞来源的树突状细胞更能真实反映其在肿瘤和血液中的活化状态。实验过程中最困难的部分可能是确保所有试剂和工具均保持无菌，并且在操作中避免引入污染。

我从事从肿瘤中分离髓系细胞和树突状细胞的工作已有15年多，当我发现不同的分离方案会导致细胞活化模式不同时，便萌生了这一方法的想法。本次实验操作将由我实验室的研究生Santana-Magal女士进行演示。

在超净工作台内使用二氧化碳处死小鼠后，取出肿瘤并将其置于不含胎牛血清的 RPMI 培养基中。随后，使用手术剪将肿瘤剪切成小块。将单只小鼠的所有肿瘤组织块转移至含有 HBSS 缓冲液的 30 毫升平底管中，该缓冲液需添加胶原酶 IV 和 DNase I，并放入磁力搅拌子。

将含有肿瘤组织块的离心管置于摇床中，37摄氏度下以内部磁力搅拌器以200至400转/分钟的速度振荡孵育20至30分钟。接着，通过70微米细胞滤网过滤细胞。然后，在4摄氏度下以400 × g离心5至10分钟。

离心后，将1.5毫升密度梯度介质储备液加入8.5毫升HBSS中。然后，剧烈混匀密度梯度介质。接着，用移液器将混合液转移至沉淀物中。

将细胞悬液在室温下以400 × g离心20分钟。离心结束后倾去上清液。将沉淀的细胞洗涤两次后，重悬于1毫升分离缓冲液中。

将细胞悬液加入30 µL CD11b偶联磁珠中。接着，在4°C下孵育15分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL分离缓冲液中。

将细胞悬液加入经预洗涤的磁性柱中。接着，用3毫升分离缓冲液洗涤柱子两次。然后，将柱子从磁铁上取下。

接下来，向柱中加入6毫升分离缓冲液。用活塞推动，将磁性标记的细胞冲洗至无菌收集管中。再次于4°C下以400 × g离心5至10分钟。

重悬并染色细胞后，通过门控小细胞（依据较小的侧向散射和前向散射）进行细胞分选。安乐死后，用70%乙醇喷洒小鼠，然后在超净工作台内使用手术剪去除覆盖心脏的皮肤。

接下来，用乙醇清洁剪刀。用 20 毫摩尔 EDTA HBSS 冲洗心腔，并用剪刀剪开心脏的右心房。然后，使用带有 25 号针头的 10 毫升注射器，缓慢用 20 毫摩尔 EDTA HBSS 灌注心脏的右心室。

然后，使用无菌注射器从胸膜腔抽取血液。将血液转移至含有肝素硫酸盐和EDTA的试管中。接着，用移液器将血液加至密度梯度介质上。

在室温下以400 × g离心力、低刹车条件下离心血液细胞15分钟。离心后，收集单个核细胞至离心管中。用10 mL分离缓冲液重悬细胞以洗涤细胞。

再次在4 °C条件下，以400 × g离心细胞5至10分钟。为筛选CD11b细胞，将细胞沉淀重悬于1 mL分离缓冲液中。在4 °C条件下，加入50 µL与磁珠偶联的CD11b抗体，孵育15分钟。

在4 °C条件下，以400 × g离心5至10分钟。然后，弃去上清液。用1 mL分离缓冲液重悬沉淀。

接下来，将细胞悬液加入经预洗涤的磁性柱中。用分离缓冲液洗涤柱子两次。将柱子从磁铁上取下，然后在柱子中加入6 mL分离缓冲液。

接下来，推动活塞，将磁性标记的细胞冲洗至无菌收集管中。在4°C条件下，以400 × g离心5到10分钟。用分离缓冲液重悬细胞，并使用荧光染料偶联抗体进行染色。

通过使用较小的侧向散射和较小的前向散射圈选小细胞来分选细胞。首先，在室温下用1.8%缓冲的多聚甲醛固定细胞10分钟。将细胞悬液接种至U型96孔板的每孔中。

接下来，在每个孔中加入不同稀释度的肿瘤结合抗体。随后，将细胞在冰上孵育15至20分钟。孵育结束后，用150 µL磷酸盐缓冲液洗涤细胞。

然后在4 °C条件下以400 × g离心5至10分钟。离心后弃去上清液，并将细胞洗涤两次。用含有荧光染料标记的二抗的100 µL FACS缓冲液重悬细胞。

接下来，将培养板置于冰上孵育15至20分钟。孵育15至20分钟后，加入200 µL FACS缓冲液以洗涤细胞。以400 × g离心5至10分钟。

弃去上清液。通过流式细胞术分析肿瘤结合情况，并确定包被细胞所需的最低免疫球蛋白G浓度。当细胞被最低浓度的免疫球蛋白G包被后，按1:5的比例将CFSE标记的肿瘤免疫复合物加入单核细胞来源的树突状细胞中。

然后，在完全培养基中于4°C孵育混合物12至16小时过夜。对单核细胞来源的树突状细胞活化进行流式细胞术（FACS）分析。通过流式细胞术分析计算平均荧光强度，以研究体外条件下结合LMP肿瘤细胞的IgG和M抗体的存在情况。

结果表明，来自C57-Black/6同种异体小鼠的IgG抗体与肿瘤细胞的结合强度明显高于129S1同系小鼠的抗体。随后计算B16F10肿瘤细胞与IgG结合能力的平均荧光强度。结果显示，来自129S1同种异体小鼠的IgG与B16F10肿瘤细胞的染色强度比来自C57-Black/6同系小鼠的IgG高出10倍。

接下来，采集DIC显微图像，以显示来自B16F10肿瘤的与肿瘤相关、由单核细胞衍生的树突状细胞。此处采集的DIC图像用于展示从荷B16F10肿瘤小鼠血液中分离出的炎症性及巡逻型单核细胞衍生的树突状细胞。此外，还通过流式细胞术分析，在与免疫复合物共孵育后，比较来自脾脏和骨髓的单核细胞衍生树突状细胞与来自肿瘤和血液的细胞的活化模式。

结果显示，骨髓和脾脏树突状细胞在免疫复合物作用下，CD86 和 MHC II 的表达增加。随后进行共聚焦免疫组织化学检测，显示当树突状细胞与 CFSE 标记的肿瘤免疫复合物共孵育时，可观察到肿瘤摄取及 MHC II 的表达。一旦掌握该技术，根据所使用小鼠的数量，该操作可在数小时内完成。

进行此操作时，重要的是要始终确保所有试剂和工具保持无菌。小鼠的毛发是污染的主要来源。务必确保毛发不会接触到您的组织样本。

我们希望在观看本视频后，您能够充分掌握如何从小鼠血液和肿瘤中分离单核细胞来源的树突状细胞，以及如何随后使用免疫复合物细胞对其进行激活，同时避免其过早激活的方法。