小鼠单核细胞衍生树突状细胞的分离及与肿瘤免疫配合物的后体外活化

单核细胞衍生的 DC (MoDC) 可以感觉到少量的危险相关分子, 因此很容易被引。我们提供了一个详细的协议, 以隔离 MoDC 从血液和肿瘤和他们的活化与免疫复合体, 同时强调应考虑的关键预防措施, 以避免其过早激活。

该方法旨在帮助科学家从荷瘤小鼠的血液和肿瘤中分离单核细胞衍生的 DC，以研究其免疫刺激特性。我认为与其他方法相比，该程序的主要优点是获得的单核细胞衍生的 DC 更好地反映了它们在肿瘤和血液中的激活状态。最难的事情可能是确保所有试剂和工具都是无菌的，并且在此过程中不会引入污染。

从肿瘤中分离髓系细胞和树突状细胞已经超过 15 年了，当我注意到不同的分离方案导致不同的细胞活化模式时，我有了这种方法的想法。演示该程序的是 Santana-Magal 夫人，她是我实验室的研究生。

层流罩内使用二氧化碳对小鼠实施安乐死后，提取肿瘤并将它们置于不含胎牛血清的 RPMI 培养基中。然后，使用手术剪刀将肿瘤切成小块。将所有肿瘤块从一只小鼠转移到含有 HBSS 缓冲液的 30 毫升平底管中，该缓冲液补充有胶原酶 IV 和 DNase I 以及磁力搅拌棒。

将试管与肿瘤块放在摇床上，在 37 摄氏度下孵育，内部装有磁力搅拌器，以每分钟 200 至 400 转的速度孵育 20 至 30 分钟。接下来，通过 70 微米的细胞过滤器过滤细胞。然后，在 4 摄氏度下以 400 倍 g 离心细胞 5 至 10 分钟。

离心后，将 1.5 mL 密度梯度培养基储备液添加到 8.5 mL的 HBSS 中。然后，充分混合密度梯度介质。接下来，将混合物移液到沉淀中。

在室温下以 400 x g 离心细胞悬液 20 分钟。离心结束后倒出上清液。洗涤沉淀的细胞两次后，重悬于 1 mL 分离缓冲液中。

将细胞悬液添加到 30 μL CD11b 偶联磁珠中。接下来，将混合物在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。离心后，去除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 分离缓冲液中。

将细胞悬液涂在预洗的磁柱上。接下来，使用 3 mL 分离缓冲液洗涤色谱柱两次。然后，从磁力架上取下色谱柱。

接下来，在色谱柱中加入 6 mL 分离缓冲液。用柱塞推动以冲洗无菌收集管中磁性标记的细胞。再次将细胞在 4 摄氏度下以 400 x g 离心 5 至 10 分钟。

重悬和染色细胞后，通过使用小侧和小前向散射对小细胞设门来对细胞进行分选。对小鼠实施安乐死后，在其上喷洒 70% 乙醇。然后，使用手术剪刀去除层流罩下覆盖心脏的皮肤。

接下来，用乙醇清洁剪刀。用 20 毫摩尔 EDTA HBSS 清洗腔，然后用剪刀剪开心脏的右心房。然后，使用带有 25 号针头的 10 毫升注射器，用 20 毫摩尔 EDTA HBSS 缓慢冲洗心脏的右心室。

然后，使用无菌注射器从胸膜腔抽血。将血液转移到含有硫酸乙酰肝素和 EDTA 的试管中。接下来，在密度梯度培养基上移液血液。

室温下以 400 倍 g 离心血细胞 15 分钟，并低速制动。离心后，将单核细胞收集在试管中。将细胞溶解在 10 毫升分离缓冲液中以洗涤细胞。

同样，在 4 摄氏度下以 400 倍 g 离心细胞 5 至 10 分钟。要选择 CD11b 细胞，请将细胞沉淀重悬于 1 mL 分离缓冲液中。在 4 摄氏度下与 50 μL CD11b 偶联磁珠孵育 15 分钟。

4 摄氏度下以 400 倍 g 重新离心 5 至 10 分钟。然后，去除上清液。将沉淀重悬于 1 mL 分离缓冲液中。

接下来，将细胞悬液涂在预洗的磁柱上。用分离缓冲液洗涤色谱柱两次。从磁力架上取下色谱柱，并在色谱柱上添加 6 mL 分离缓冲液。

接下来，通过推动柱塞冲洗无菌收集管中的磁性标记细胞。在 4 摄氏度下以 400 倍 g 离心细胞 5 至 10 分钟。在分离缓冲液中重悬细胞，并用荧光团偶联的抗体染色。

通过使用小侧和小前向散射对小细胞进行门控来对细胞进行排序。首先，在室温下将细胞固定在 1.8% 缓冲多聚甲醛中 10 分钟。将细胞悬液接种在 U 形 96 孔板的每个孔中。

接下来，在每个孔中加入不同稀释度的肿瘤结合抗体。此后，将细胞在冰上孵育 15 至 20 分钟。孵育后，用 150 μL 磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞。

然后，在 4 摄氏度下以 400 倍 g 离心 5 至 10 分钟。离心后，排出上清液并洗涤细胞两次。将细胞溶解在 100 μL 含有荧光团偶联二抗的 FACS 缓冲液中。

接下来，将板在冰上孵育 15 到 20 分钟。15 至 20 分钟后，加入 200 μL FACS 缓冲液以洗涤细胞。以 400 倍 g 离心板 5 至 10 分钟。

倒出上清液。进行流式细胞术以分析肿瘤结合并确定包被细胞所需的免疫球蛋白 G 的最低浓度。一旦细胞涂有最低浓度的免疫球蛋白 G，就以 1 比 5 的比例将 CFSE 标记的肿瘤免疫复合物添加到单核细胞衍生的树突状细胞中。

然后，将混合物在完全培养基中孵育 12 至 16 小时过夜。对单核细胞衍生的树突状细胞活化进行 FACS 分析。在流式细胞术分析后计算平均荧光强度，以研究体外结合 LMP 肿瘤细胞的 IgG 和 M 抗体的存在。

结果表明，来自 C57-Black/6 同种异体小鼠的 IgG 抗体比来自 129S1 同基因小鼠的抗体更强地结合肿瘤细胞。然后，计算 B16F10 肿瘤细胞与 IgG 结合能力的平均荧光强度。与 C57-Black/6 小鼠的同基因 IgG 相比，从 129S1 同种异体小鼠获得的 IgG 显示 B16F10 肿瘤的染色强度高 10 倍。

接下来，捕获 DIC 显微图像以显示来自 B16F10 肿瘤的肿瘤相关、单核细胞衍生的树突状细胞。在这里，捕获 DIC 图像以显示从 B16F10 荷瘤小鼠血液中分离的炎症和巡逻单核细胞衍生的树突状细胞。还进行了流式细胞术分析，以比较来自脾脏和骨髓的单核细胞衍生的树突状细胞与肿瘤和血液在与免疫复合物孵育时的激活模式。

结果显示骨髓和脾树突状细胞与免疫复合物的 CD86 和 MHC II 表达增加。然后，进行共聚焦免疫组织化学，当树突状细胞与 CFSE 标记的肿瘤免疫复合物一起孵育时，显示肿瘤摄取和 MHC II 表达。掌握后，此过程可以在几个小时内完成，具体取决于您使用的鼠标数量。

在尝试此程序时，请务必记住始终保持所有试剂和工具无菌。老鼠皮毛是污染的主要来源。确保没有一根毛发接触您的组织。

我们希望在观看此视频后，您将对如何从小鼠血液和肿瘤中分离单核细胞衍生的树突状细胞，以及如何随后用免疫复合物细胞激活它们，同时避免其过早激活。