小鼠树突状细胞亚群的分离的高效和高产的方法
2016年4月18日
独特的树突状细胞亚群在淋巴器官中作为稀有群体存在，因此难以分离出足够数量和纯度的免疫学实验。在这里，我们描述了一种高效、高产量的方法，用于分离所有目前已知的小鼠脾树突状细胞的主要亚群。
该方案的总体目标是开发一种高效、高产量的方法来产生树突状细胞或 DC，这注定地反映了它们的体内表型和功能分歧。树突状细胞在淋巴器官中以大量群体的形式存在。因此，我们使用滤过配体来增加供体组织中这些必需细胞的频率，以促进这种分离。
该技术的主要优点是它消除了所有合适数量的 DC 子集的生成，以便仅使用市售试剂进行分析。要从 90% 汇合培养物中收获表达 B16 黑色素瘤细胞的 flt-3 配体，首先用 PBS 洗涤细胞，并在 37 摄氏度下与 05% 胰蛋白酶孵育培养物。5 分钟后，用 20 mL 4 摄氏度完全二元培养基淬灭蛋白酶活性，然后轻轻敲击和轻轻移液分离贴壁细胞模型层。
通过离心收集细胞并计数。然后，将单细胞悬液重悬至 PBS 中 8 个细胞浓度的 1 倍，用于皮下注射到 C57 黑色 6 受体小鼠中。当肿瘤直径达到 2 至 10 毫升时，从荷瘤动物中收获脾脏，并将脾脏置于含有新鲜 RPMI 培养基的培养皿中。
使用手术刀将组织切成 0.2 平方厘米的小块，然后将片段在 10 毫升胶原酶和 Dnase 中于 37 摄氏度孵育。30 分钟后，将部分消化的组织浆液倒在 70 微米的细胞过滤器上，并使用 5 毫升注射器柱塞将剩余的组织碎片压入过滤器的网孔。用 10 毫升新鲜培养基冲洗过滤器，将洗涤液与其余单细胞悬液混合并沉淀细胞。
我们将细胞沉淀物在 2 mL 红细胞裂解缓冲液中，在室温下悬浮 10 分钟。然后在 10 毫升新鲜的 RPMI 培养基中洗涤细胞，并在含有 FC 块的细胞分选缓冲液中以 1 倍 10 至每毫升 8 个细胞的速度重新悬浮细胞。为了分离浆细胞 DC，将来自浆细胞 DC 分离试剂盒的 300 μL 生物素标记的抗体混合物与 200 μL 脾单细胞悬液彻底混合。
将细胞置于冰水浴中 15 分钟，每 3 分钟轻轻敲击一次。然后用 12 毫升细胞分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 500 微升新鲜分选缓冲液中。接下来，将细胞在 300 μL 抗生物素抗体偶联珠中再孵育 15 分钟，同时定期敲击。
在新鲜的分选缓冲液中洗涤细胞后，将托盘重新悬浮在 2 mL细胞分选缓冲液中，并将适当大小的磁柱加载到相应的磁力架上。用 5 mL 新鲜的 4 °C 细胞分选缓冲液平衡色谱柱。当所有缓冲液从柱顶部排出后，小心地将细胞添加到柱头表面的中心，并收集流出液。
然后用 10 mL 新鲜的 4 °C 分选缓冲液洗涤色谱柱，并将流出液收集在同一管中。通过第二根磁柱后，可以预期会出现纯度大于 94% 的浆细胞树突状细胞群。为了分离 CD8aplha + 和 CD8alpha-DC，将剩余的脾细胞悬液与 CD8alpha + 树突状细胞分离试剂盒中的 100 微升生物离子偶联抗体混合物在冰上混合 15 分钟，轻轻敲击，如刚才所示。
孵育结束时，在 12 毫升 4 摄氏度细胞分选缓冲液中洗涤细胞，并将沉淀重悬于 150 微升新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液中。接下来，将细胞与 100 μL CD8alpha + 树突状细胞分离试剂盒抗生物素珠混合。在冰上轻轻敲击 15 分钟后，在 10 mL 4°C 细胞分选缓冲液中洗涤细胞，然后将沉淀重悬于 1 mL 新鲜的 4°C 分选缓冲液中。
在孵育结束时，通过磁珠分离对细胞进行分选，如刚才所示，收集流出液和第一次洗涤液。然后，旋转细胞并将沉淀重悬于一毫升新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液中。现在用试剂盒中的 200 μL 抗 CD8aplha 偶联磁珠标记细胞，并使细胞通过新的色谱柱，收集 CD8alpha-树突状细胞流出。
要收集 CD8alpha + DC，请将色谱柱转移到 15 mL 锥形管中，然后将 5 mL 新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液浸入色谱柱中。在细胞通过第二柱后，可以预期会有大于 96% 的 CD8alpha + 树突状细胞群。要分离 CD8alpha 细胞，请旋转 CD8alpha 流穿细胞悬液。
然后用 100 微升抗 CD11 c 磁珠标记细胞，并收集磁珠阳性细胞群，如刚才所示，以获得大于 97% CD8alpha 树突状细胞亚群。最后，通过台盼蓝排除法确定活细胞的数量。一旦肿瘤变得可触及，B16 flt-3 配体荷瘤小鼠始终表现出脾细胞性的显着增加，这与脾树突状细胞亚群的扩增相关。
有趣的是，虽然在这些动物中观察到常规 DC 的绝对细胞数增加了 15 到 20 倍，但对于浆细胞 DC 亚群，仅观察到大约 4 倍。根据其 B220、CD11b、CD11c 和 CD8alpha 表达对不同的树突状细胞亚群进行表征。细胞群也表现出其他独特的亚群标志物，然而，mPDCA1 仅在浆细胞 DC 上表达，DEC205 在 CD8alpa+DC 上高度表达，CD11b 和 33D1 在 CD8alpha-DC 上检测最为突出。
使用这种方法，我们已经证明 CD8alpa+DC 在 CD 键分子将抗原呈递到称为不变 NKT 细胞的特殊 T 细胞群中是最有效的。直流隔离最关键的特征是保持严格的无菌和无抗氧剂的条件。在手术过程中，这些 T 细胞对抗毒素高度敏感。
在尝试此过程时，重要的是要记住轻柔地处理细胞，因为重复的机械刺激可能会改变树突细胞的成熟状态。一旦掌握，该技术可用于从单个脾脏中分离出大量所有主要 DC 亚群。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文介绍了一种从小鼠脾脏中分离树突状细胞（DCs）的高效、高产量方法。该技术旨在生成准确反映其体内特征的DCs，从而促进免疫学研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 树突状细胞生物学
- 细胞分离技术
背景
- 树突状细胞对免疫反应至关重要。
- 它们在淋巴器官中存在于稀有群体中。
- 由于它们的低丰度，这些细胞的分离具有挑战性。
- 当前的方法可能无法获得足够的数量用于分析。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分离小鼠脾脏树突状细胞的所有主要亚群。
- 提高分离DCs的产量和纯度。
- 促进进一步的免疫学实验使用这些细胞。
使用的方法
- 利用过滤配体增加供体组织中DC的频率。
- 收集表达flt-3配体的B16黑色素瘤细胞。
- 用胰蛋白酶洗涤和孵育细胞以脱离。
- 熄灭蛋白酶活性并分离细胞以进行分析。
主要结果
- 该方法成功生成适量的树突状细胞。
- 所有主要的DC亚群都可以有效分离。
- 该技术基于商业可获得的试剂。
- 分离的DCs保留了其体内表型和功能特征。
结论
- 该方法在树突状细胞研究方面提供了重大进展。
- 它允许更好地分析免疫学研究中的DC亚群。
- 该方法可以适应各种实验需求。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of functionally distinct mouse dendritic cell subsets enables robust target validation and mechanistic de-risking in immunology-focused drug discovery. This high-yield protocol supports comparative studies of antigen presentation and immune modulation, directly impacting early discovery and translational research pipelines. Reliable access to pure DC subsets enhances predictive confidence for immunotherapeutic portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antigen presentation pathways across distinct dendritic cell subsets.
- Supports functional target validation by isolating DCs with preserved in vivo phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking for immune-modulating therapeutic hypotheses.
- Provides a platform for comparative analysis of DC subset roles in T cell activation.
Screening & Assay Development
- Delivers high-purity, functionally intact DC subsets for standardized assay development.
- Improves reproducibility and scalability of immune cell-based screening workflows.
- Enables quantitative assessment of antigen presentation and T cell priming capacity.
- Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DC subset isolation with disease-relevant immune mechanisms for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on functional immune readouts.
- Provides mechanistic insight into DC subset contributions to immune responses.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality DC subsets for hypothesis testing, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of antigen presentation and immune activation pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for evaluating immune-modulating compounds.
- Analytics: Enables measurement of subset-specific antigen presentation and T cell activation.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo immune mechanisms relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for isolating DC subsets across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Standardizes DC isolation for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology and cell isolation techniques.
- Needs access to magnetic bead separation systems and flow cytometry for subset validation.
- Demands strict sterility and antioxidant-free conditions to preserve DC functionality.
- Necessitates gentle handling to avoid altering DC maturation state.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or tissue sources.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
B16.Flt.3L Melanoma Harvest
1:40
Preparation of Splenic Single Cell Suspension from Tumor-bearing Mice
2:54
Plasmacytoid Dendritic Cell (DC) Isolation
4:35
CD8alpha+ and CD8alpha- DC Isolation
7:02
Results: Representative Splenic DC Subset Analysis from B16.Flt3L Tumor-bearing Mice
8:10
Conclusion
