Name: 小鼠树突状细胞亚群的分离的高效和高产的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习利用Flt-3配体扩增和磁珠分选技术，从小鼠脾脏高效分离浆细胞样、CD8α+及CD8α-树突状细胞亚群的方法。该方法可获得高纯度细胞，用于免疫学研究。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）/国家过敏与传染病研究所（NIAID）授予 S.A.P. 的资助项目 AI45889 的支持。流式细胞术研究使用了阿尔伯特·爱因斯坦癌症中心（美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 CA013330）和艾滋病研究中心（美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所 AI51519）资助的 FACS 核心设施。

动物实验均按照机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的指南进行。所有需要无菌操作的步骤均在生物安全柜中进行。
1. 小鼠体内植入 B16.Flt3L 黑色素瘤
<ol>
	<li>在含有10% CO2、37 °C的完全DMEM培养基中，将表达Flt-3的B16黑色素瘤细胞系以0.5 × 106 个细胞/ml&#160;的密度接种于T25培养瓶中进行培养。持续培养至细胞融合度达到约90%（约20小时）。</li>
	<li>通过胰蛋白酶消化法收集细胞。吸除细胞培养基，并用PBS洗涤贴壁细胞。加入5 ml&#160;0.05%胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5分钟。加入20 ml&#160;含胎牛血清（FCS）的冷完全DMEM培养基（4 °C）以终止蛋白酶消化反应。轻敲培养瓶使细胞脱落，随后轻轻吹打混匀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟&#160;收集细胞。使用血细胞计数板或自动细胞活力计数仪对细胞进行计数。将细胞重悬于PBS中，调整浓度至108 个细胞/ml&#160;。</li>
	<li>按照Machholz et al.19所述方法，将100 µl&#160;细胞悬液（含107个细胞）于小鼠（C57BL/6或其他组织相容性品系）颈背部皮下注射接种肿瘤细胞。</li>
	<li>接种后让肿瘤生长至可触及或可见大小（直径2–10 mm，通常为7–12天），随后处死动物以收获器官。</li>
</ol>
2. 荷瘤小鼠脾脏单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>使用过量异氟烷麻醉小鼠（将异氟烷流速调节至&#62;5%，并在呼吸停止后继续暴露至少2分钟&#160;）。根据机构安乐死指南，通过颈椎脱位法处死携带Flt-3黑色素瘤的小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇对皮肤进行消毒，并在无菌条件下使用无菌剪刀摘取脾脏20。</li>
	<li>将脾脏放入无菌培养皿中，转移至生物安全柜。此后所有操作均需在无菌条件下进行。</li>
	<li>将脾脏转移至新的培养皿中，用RPMI培养基洗涤。使用解剖刀将脾脏切成小块（约0.2 cm2）。加入10 ml&#160;胶原酶/DNase溶液，在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>将部分消化的脾组织悬液倒入70 µm细胞筛中。使用5 ml&#160;注射器活塞将剩余组织碎片压过筛网。</li>
	<li>用10 ml&#160;新鲜培养基冲洗筛网，弃去滤膜。将悬液在4 °C下以300 x g离心10分钟&#160;，使细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml&#160;红细胞裂解缓冲液中。室温孵育10分钟。加入10 ml&#160;完全RPMI培养基以终止红细胞裂解反应。</li>
	<li>在4 °C下以300 x g离心5分钟使细胞沉淀。重悬于适当体积的细胞分选缓冲液（例如，MACS缓冲液）中，其中含20 µg/ml&#160;的Fc阻断抗体（2.4G2），调整至细胞密度为108 cells/ml&#160;。</li>
</ol>
3. 从脾脏单细胞悬液中纯化浆细胞样树突状细胞、CD8αPos 树突状细胞和 CD8αNeg 树突状细胞
注意：从单细胞悬液中分离脾脏树突状细胞亚群是一个多步骤过程，如图1所示。所有步骤均需使用预冷缓冲液并在冰水浴中进行，以维持温度在4 - 8 °C。&#160;本方案后续部分中所有试剂的体积均基于初始加入200 µl脾细胞悬液（浓度为108个细胞/ml）计算得出。可根据需要通过调整细胞悬液的体积（始终维持细胞密度为1 × 108个细胞/ml）以及初始步骤（3.1.1和3.2.1）中其他试剂的相应比例进行放大或缩小。后续所有步骤中的试剂体积也需相应调整。例如，若起始使用100 µl脾细胞悬液（浓度为1 × 108/ml），则所有步骤中试剂体积均减半使用。
<ol>
	<li>浆细胞样树突状细胞（pDC）的分离
	<ol>
		<li>加入 300 µl&#160;将浆细胞样树突状细胞分离试剂盒中提供的生物素标记抗体混合物加入200 µl&#160;脾细胞悬液</li>
		<li>充分混匀，置于冰水浴中孵育15分钟，每隔3分钟轻弹试管。&#160;使细胞保持悬浮状态，并最大限度地增强抗体结合。</li>
		<li>加入12 ml&#160;细胞分选缓冲液重悬细胞，300 × g 离心收集细胞沉淀&#160;4 °C 下离心 5 分钟。吸除上清液以去除未结合的生物素化抗体。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于500 µl中&#160;细胞分选缓冲液。加入 300 µl&#160;抗生物素抗体偶联磁珠。重复步骤 3.1.2 和 3.1.3。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 2 ml&#160;细胞分选缓冲液。自此步骤起，所有操作均在室温下进行&#160;使用预冷的缓冲液。</li>
		<li>将一个新的磁性激活细胞分选LS柱置于磁力架上，用5 ml缓冲液洗涤并平衡柱子&#160;细胞分选缓冲液</li>
		<li>用移液器将细胞悬液加至层析柱上，轻轻加至柱床表面的中心位置。收集穿流液。</li>
		<li>用10 ml缓冲液洗涤层析柱&#160;加入细胞分选缓冲液。收集流穿部分，并与步骤 3.1.7 中的流穿部分合并。pDCs 富集于该柱流穿液（FT1）中。</li>
		<li>以 300 × g 在 4 °C 离心 5 分钟，沉淀 FT1 中的细胞，重悬于 2 ml&#160;细胞分选缓冲液，并通过重复步骤 3.1.6 - 3.1.8 将细胞过新鲜的 LS 柱。连续使用两根串联柱可提高分离细胞的纯度。</li>
		<li>300 × g 离心 5 分钟（4 °C）收集细胞，弃上清后用 2 ml 重悬&#160;完全RPMI培养基。置于冰上，待用时取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CD8α的分离位置 和 CD8α阴性 DCs 
	注意：该实验步骤的第一步是耗竭B细胞、pDC细胞、T细胞和NK细胞。
	<ol>
		<li>从脾脏单细胞悬液开始（1 ml，108&#160;细胞/ml（在步骤2.8中获得），加入100 µl&#160;CD8α试剂盒中提供的生物素标记抗体混合物位置 DC分离试剂盒</li>
		<li>充分混匀，置于冰水浴中孵育15分钟，每3分钟轻轻敲击试管一次。&#160;以最大化生物素标记的抗体与其靶细胞的结合。</li>
		<li>加入 12 ml&#160;细胞分选缓冲液重悬细胞，4 °C下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。吸除上清液以去除未结合的生物素化抗体。</li>
		<li>加入 150 µl&#160;细胞分选缓冲液和100 µl&#160;CD8α分选试剂盒中提供的抗生物素微珠阳性 DC 分离试剂盒。充分混匀，置于冰水浴中孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入10 ml&#160;用细胞分选缓冲液重悬细胞，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
		<li>在1 ml中重悬细胞&#160;细胞分选缓冲液并按照步骤3.1.6至3.1.8的操作程序过新鲜的LS柱。</li>
		<li>收集未标记的穿流组分2（FT2），弃去柱上残留物。该未标记组分富含CD8α位置 和 CD8α阴性 树突状细胞（DCs）。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟，使FT2中的细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞重悬于 1 ml 中&#160;细胞分选缓冲液，并加入 200 µl&#160;CD8α磁珠试剂盒中提供的抗CD8α偶联磁珠位置 DC分离试剂盒</li>
		<li>重复步骤 3.2.2 至 3.2.6。柱流穿液富含 CD8α阴性 树突状细胞和CD8α耗竭位置 树突状细胞。此部分标记为流穿3（FT3）。</li>
		<li>为了洗脱 CD8α位置 柱中保留的DCs，从磁铁上取下柱子，加入5 ml&#160;加入细胞分选缓冲液，并使用LS柱附带的推杆冲洗柱基质。</li>
		<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于 1 ml 中&#160;细胞分选缓冲液。为提高纯度，将洗脱的细胞重复步骤3.1.6至3.1.8，再次通过新的LS柱，但弃去流穿部分，并按3.2.11收集滞留的细胞。</li>
		<li>为了纯化 CD8α阴性 从FT3悬液中收集DCs，于4 °C下以300 × g离心5分钟沉淀FT3，然后重悬于300 µl中&#160;细胞分选缓冲液</li>
		<li>加入 100 µl&#160;加入抗CD11c磁珠，充分混匀后置于冰水浴中孵育15分钟。</li>
		<li>加入10 ml&#160;用细胞分选缓冲液重悬细胞，4 °C、300 x g 离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>重复步骤 3.1.5 至 3.1.8。CD8α阴性 使用CD11c磁珠对树突状细胞（DCs）进行阳性筛选，细胞将结合于柱上，流穿液可弃去。</li>
		<li>按照步骤 3.2.11 所述方法洗脱柱中保留的细胞，以收集纯化的 CD8α阴性 树突状细胞（DCs）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 抗原呈递细胞的抗原脉冲处理及细胞转移
<ol>
	<li>使用台盼蓝染色排除法对纯化后的细胞进行活细胞计数21，以区分活细胞与死细胞。</li>
	<li>用选定的抗原孵育细胞。使用浓度为 100 nM 的糖脂抗原类似物 α-半乳糖基&#160;神经酰胺（αGalCer）13。通常将 106 个活细胞接种于含有完全 RPMI 培养基的超低吸附 U 型底 96 孔板中，以减少细胞贴壁。将细胞置于 37 °C、5% CO2 环境中孵育 1 - 4 小时。</li>
	<li>通过轻柔吹打数次收集细胞。使用宽口移液吸头，以尽量减少剪切力对细胞造成的损伤。用 PBS 洗涤各孔，并合并洗涤液以最大化回收细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟收集细胞，然后重悬于 PBS 中至所需密度。通常每只受体动物注射 200 µl 含 100 万个细胞的悬液&#160;&#160;。注射前将细胞置于冰上以最大限度保持其活性。</li>
	<li>通过尾侧静脉或眶后静脉丛将细胞静脉注射至小鼠体内19。使用 1 ml&#160;注射器配 27 G 针头，每只小鼠注射体积不超过 0.1 ml&#160;。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

树突状细胞被公认为是参与启动T细胞应答的主要专职抗原呈递细胞。其主要功能是通过摄取和加工抗原并将其呈递给T细胞，来监测组织微环境。为了研究特定DC亚群的功能，需要采用能够维持其正常表型和功能的方法，以获得足够数量的细胞。目前大多数方案依赖于从未经处理的小鼠中分离特定的DC亚群。由于这类细胞数量稀少，分离过程效率低下，所得细胞数量有限。例如，一只小鼠脾脏仅能获得约0.5 -&#160;1 × 10⁶个CD8pos DCs，而大多数采用细胞转移实验的研究每只动物至少需要使用同等数量的细胞。因此，现有方法的一个主要局限在于，若不使用大量供体小鼠和大量试剂，则难以获得足够的细胞数量。我们的方法通过使用植入可分泌Flt-3L肿瘤的小鼠，显著扩增DC数量，再结合一系列免疫磁珠纯化步骤，从而能够纯化出数量显著更多的三种公认DC亚群&#160;，在很大程度上克服了上述问题。因此，本文所述方案在细胞得率方面比现有方法至少提高了数倍，实现了显著改进。
本研究所述的分离方案存在一些注意事项。主要局限性在于，用于分离这些细胞的操作可能会无意中改变其表型。树突状细胞（DCs）对内毒素污...

树突状细胞（DC）近四十年前被发现作为 &#34;大型星状（希腊 树形分子细胞&#34; 存在于淋巴器官中1许多研究表明，树突状细胞（DCs）是唯一能够有效刺激初始T细胞的抗原提呈细胞2这些细胞的主要功能是摄取和呈递抗原，并高效地加工处理这些抗原，进而将其加载至抗原呈递分子上。在小鼠脾脏中，树突状细胞（DCs）可分为浆细胞样和经典两种亚群。浆细胞样树突状细胞的特征是低水平表达CD11c，高水平表达B220和Gr-1，同时表面标志物mPDCA1呈阳性，并可在Toll样受体9（TLR9）配体刺激下分泌I型干扰素。经典树突状细胞高表达CD11c和MHC II类分子，可根据表面表型标志物如CD4、CD8α、DEC205、CD11b以及树突状细胞抑制性受体2（DCIR2，可被33D1抗体识别）的表达情况进一步分为三个不同的亚群。 3,4CD8α位置 树突状细胞（DCs）也被称为cDC1，表达DEC205，但不表达髓系标志物如CD11b和33D1。CD8α阴性 树突状细胞（DCs），也称为cDC2，表达33D1、CD11b和CD4，但不表达DEC205。双阴性亚群（即，对CD4和CD8α均为阴性）相对罕见，且DEC205和33D1呈阴性。该亚群特征最不明确，可能是CD8α的一种低度分化形式阴性 DC
不同DC亚群之间的表型差异也延伸至其 体内 功能。CD8α阴性 树突状细胞具有很强的吞噬能力，被认为主要呈递外源性抗原&#160;通过MHC II类分子向CD4 T细胞递呈 3相比之下，CD8α阳性 树突状细胞（DCs）专门负责通过一种称为交叉提呈的机制，将可溶性蛋白抗原在MHC I类分子上进行提呈。交叉提呈的结果取决于这些树突状细胞的活化状态。5，可导致细胞毒性T细胞（CTLs）扩增或调节性T细胞的发育 62,7. 将抗原靶向递送至 CD8α位置&#160;DCs&#160;使用抗DEC205抗体介导的递送主要导致T细胞的删除8而由感染性凋亡细胞来源的抗原呈递则可诱导强烈的CTL反应 9.
除了识别肽类抗原外，哺乳动物免疫系统还进化出识别脂质和糖脂抗原的能力。这些抗原由CD1分子呈递，CD1分子是一类类似于MHC I类的细胞表面蛋白，在多种哺乳动物中存在多个相关形式。在小鼠中，一种高度保守的CD1分子CD1d负责呈递糖脂抗原10。识别CD1d/糖脂复合物的主要T细胞群体被称为不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）。这些细胞表达一种半不变的T细胞受体（TCR），由一个不变的TCRα链与多样性有限的TCRβ链配对组成11。与需要增殖和分化才能成为活化效应T细胞的传统T细胞不同，iNKT细胞本身即为效应细胞群体，在给予糖脂后可迅速启动应答12。鉴定具有生理相关性的脂质抗原呈递细胞是当前活跃的研究领域，已有研究提示B细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）等多种不同类型的细胞可能具备此功能。然而，研究表明，树突状细胞中CD8αPos亚群是介导脂质抗原摄取并将其呈递给小鼠iNKT细胞的主要细胞类型13，同时也负责糖脂介导的CD8 T细胞交叉启动14。
为了比较不同抗原提呈细胞在抗原提呈方面的效率，一种直接的方法是将经等量抗原刺激的不同类型纯化抗原提呈细胞转移至未经免疫的宿主体内。此类细胞转移实验常用于免疫学研究。然而，在进行涉及 离体 抗原处理的DCs较难获取，因为这些细胞在淋巴器官中仅占总细胞数的不到2%，属于稀有细胞群体15因此，有必要促进供体动物中这些细胞的发育，以提高分离方案的效率。
已知，生成pDC、CD8位置 和 CD8阴性 DC亚群表达fms相关受体酪氨酸激酶3（Flt-3）。在 体内 Flt-3配体（Flt-3L）给药可促进表达Flt-3的前体细胞从骨髓迁移，导致外周淋巴器官中前体细胞的定植增加，并促进其成熟树突状细胞后代的扩增16Flt-3的表达在向B细胞、T细胞或NK细胞分化途径承诺的过程中丧失。因此，在给予Flt-3L后，这些细胞中仅观察到最小程度的变化。在植入分泌小鼠Flt-3L的B16黑色素瘤细胞系而形成肿瘤的小鼠中，也观察到树突状细胞群体的类似扩增，该方法为持续提供系统性Flt-3L水平提供了一种简单且经济的途径17,18采用该方法，我们建立了一种基于皮下植入分泌Flt-3L的B16黑色素瘤细胞的实验方案，以刺激小鼠脾脏中所有正常树突状细胞（DC）亚群的扩增，从而显著提高可分离获取的DC数量，用于后续实验。我们 consistently 发现，在植入分泌Flt-3L的肿瘤细胞后10至14天内，小鼠出现脾肿大，且树突状细胞显著富集，占脾脏总细胞数的40%–60%。从这些脾脏中，可利用商品化的标准细胞纯化试剂盒，通过亚群特异性的表型标志物，高纯度地分离出不同的DC亚群。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies，Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D&amp;nbsp;</td><td>罗氏诊断</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（干粉）</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200 proof 乙醇&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td><td>用于配制70%乙醇</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies，Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的DMEM培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies，Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies，Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11130-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; pH 7.2，无自由基</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s PBS（含Ca的DPBS）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Life Technologies，Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝（干粉）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&amp;nbsp;</td><td>用 PBS 配制 0.08%</td></tr><tr><td>小鼠浆细胞样树突状细胞分离试剂盒 II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>与抗小鼠 CD11c 偶联的磁珠&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&amp;alpha;&lt;sup&gt;阳性&lt;/sup&gt; 小鼠DC分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Fc-γ受体阻断抗体（克隆2.4G2）</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c-FITC&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8&amp;alpha;-PerCP&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 B220-PE&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1 针头&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 皿&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>手术器械&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（70 &amp;micro;m)</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>大号培养皿&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤系统（500 ml（0.22 &amp;micro;m)</td><td>康宁</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>磁力架 MACS 分离器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>宽孔径 200 &amp;mu;l 移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning 超低吸附 96 孔板&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>6-8周龄雌性C57BL/6小鼠&amp;nbsp;</td><td>杰克逊研究所，Jax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 B16.Flt3L 黑色素瘤细胞系</td><td></td><td></td><td>由 Mach 描述 &lt;em&gt;等人&lt;/em&gt;, 2000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;无血清 DMEM 和 RPMI 培养基&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;500 ml DMEM 含 L-谷氨酰胺，或 500 ml RPMI-1640 含 L-谷氨酰胺&lt;br/&gt;5 ml MEM 非必需氨基酸（100倍，10&amp;nbsp;mM&lt;br/&gt; 5 ml HEPES缓冲液（1 M）&lt;br/&gt;5 ml L-谷氨酰胺（200&amp;nbsp;mM&lt;br/&gt; 0.5 ml 2-巯基乙醇（5.5 × 10&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt; M)</td><td></td><td></td><td>在生物安全柜中，根据需要使用 DMEM 或 RPMI 培养基混合所有成分。通过 0.22 微米滤膜过滤培养基以实现过滤除菌。 &amp;micro;m 真空过滤系统</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;完全 RPMI 和 DMEM 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>向无血清的 RPMI 或 DMEM 培养基中加入 50 ml 热灭活的胎牛血清，制备完全培养基。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MACS 缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>加入 2 ml 0.5 M EDTA 和 10 ml 热灭活的胎牛血清至 500 ml 磷酸盐缓冲液（PBS, Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 游离，pH 7.2）和 2&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml 2.4G2（Fc阻断抗体）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;FACS 染色缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>将叠氮化钠溶解于MACS缓冲液中至0.05%（每500 ml加入0.25 g），配制FACS染色缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;10倍浓度胶原酶D和DNase 1储存液&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;
将 1 g 胶原酶 D 和 0.2 ml DNase 1 储存液（1 mg/ml，100 倍浓度）溶解于 20 ml 含 Ca 的 PBS 中&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 获得每毫升约含 1,000-2,000 单位胶原酶活性的溶液。</td><td></td><td></td><td>该10倍储存液可预先配制，并于-20℃保存 &amp;deg;C 下保存数周。使用前立即用 9 ml 无血清 RPMI 培养基稀释 1 ml 该溶液。</td></tr></tbody></table>

一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

树突状细胞（DCs）是专业的抗原呈递细胞，主要负责摄取、加工抗原，并将抗原呈递至抗原呈递分子上，以启动T细胞介导的免疫应答。树突状细胞可根据表型和功能分为多个异质性亚群。脾脏树突状细胞的三个重要亚群为浆细胞样树突状细胞、CD8α⁺树突状细胞和CD11b⁺树突状细胞。位置 和 CD8α阴性 细胞。浆细胞样树突状细胞是I型干扰素的天然生产者，在抗病毒T细胞免疫中具有重要作用。CD8α阴性 DC亚群专门负责MHC II类抗原呈递，在激活CD4 T细胞过程中起核心作用。CD8α位置 树突状细胞（DCs）主要负责外源性抗原的交叉提呈以及CD8 T细胞的活化启动。CD8α阳性 树突状细胞（DCs）已被证实能够通过CD1d分子向一种称为不变的自然杀伤T（iNKT）细胞的特殊T细胞群体呈递糖脂抗原，其效率最高。给予Flt-3配体可增加树突状细胞前体从骨髓迁移的频率，最终导致在小鼠模型中外周淋巴器官中树突状细胞数量的扩增。我们已采用此模型以大量纯化具有功能的树突状细胞，用于细胞转移实验，以进行比较 体内 不同DC亚群的功能熟练程度。

该实验结果依赖于由植入的黑色素瘤细胞表达的小鼠 Flt-3L 所介导的树突状细胞亚群的扩增。B16.Flt3L 肿瘤源自 C57BL/6 小鼠，因此应植入具有相同品系背景的动物体内，以避免因免疫排斥导致肿瘤无法成功建立。在某些情况下，可能需要使用基因修饰小鼠，以获得在特定信号通路或受体方面存在已知缺陷的树突状细胞。需要注意的是，此类动物体内肿瘤的生长动力学可能有所不同，因此必须通过观察和触诊接种部位来密切监测肿瘤的生长情况。根据我们的经验，一旦肿瘤可被触及，携带 B16.Flt3L 肿瘤的小鼠 consistently show&#160;脾细胞数量显著增加，且与所有树突状细胞亚群的扩增相关（图2A我们通常观察到，与未处理动物相比，B16.Flt3L黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中获得的总脾细胞数量增加2至3倍。树突状细胞（DC）数量的增加部分导致B细胞频率明显降低，而B细胞的绝对数量则几乎没有变化。有趣的是，尽管在这些小鼠中传统型DC的绝对数量显著扩增（约增加15至20倍），浆细胞样DC亚群仅表现出适度增加（约4倍）。
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不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。

树突状细胞（DCs）是专业的抗原呈递细胞，主要负责获取、加工并在抗原……上呈递抗原

本方案的总体目标是建立一种高效、高产量的方法，用于生成能够真实反映其体内表型和功能差异的树突状细胞（DCs）。树突状细胞在淋巴器官中以大量群体存在。因此，我们使用滤膜配体来提高供体组织中这些关键细胞的频率，以促进其分离。该技术的主要优势在于，仅使用市售试剂即可获得足够数量的各种DC亚群，用于后续分析。要收获表达flt-3配体的B16黑色素瘤细胞（来自90%融合度的培养物），首先用PBS洗涤细胞，然后在37摄氏度条件下用0.5%胰蛋白酶孵育培养物。5分钟后，加入20毫升4摄氏度的完全DMEM培养基以终止蛋白酶活性，并通过轻敲和轻柔吹打使贴壁的细胞单层脱落。通过离心收集细胞并进行计数。然后，将单细胞悬液用 PBS 重悬，调整浓度至每毫升含 1 × 10⁸ 个细胞，用于皮下注射至 C57BL/6 受体小鼠。当肿瘤直径达到 2 至 10 毫米时，取荷瘤动物的脾脏，并将其置于含有新鲜 RPMI 培养基的培养皿中。使用手术刀将组织切成 0.2 平方厘米大小的片段，然后将组织碎片置于含有胶原酶和 DNA 酶的 10 毫升溶液中，在 37 摄氏度条件下孵育。30 分钟后，将部分消化的组织悬液倒入 70 微米细胞滤筛中，并用 5 毫升注射器的推杆将剩余的组织碎片压过滤网。用 10 毫升新鲜培养基冲洗滤膜，将冲洗液与单细胞悬液合并，随后离心收集细胞沉淀。将细胞沉淀在室温下用2毫升红细胞裂解缓冲液重悬10分钟。随后用10毫升新鲜RPMI培养基洗涤细胞，并将其重新悬浮于细胞分选缓冲液（含FC阻断剂）中，浓度为每毫升1×10⁸个细胞。为分离浆细胞样树突状细胞（pDC），取300微升来自浆细胞样树突状细胞分离试剂盒的生物素标记抗体混合物，与200微升脾脏单细胞悬液充分混匀。将细胞置于冰水浴中15分钟，每3分钟轻轻敲击一次。然后用12毫升细胞分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于500微升新鲜分选缓冲液中。接着，将细胞与300微升抗生物素抗体偶联磁珠在冰水浴中孵育15分钟，期间定期轻敲。用新鲜分选缓冲液洗涤细胞后，将沉淀重悬于 2 毫升细胞分选缓冲液中，并将合适尺寸的磁性柱安装至对应的磁铁上。用 5 毫升新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液平衡磁性柱。当缓冲液完全从柱顶部流尽后，小心地将细胞加至柱头表面的中心位置，并收集穿流组分。然后用10毫升新鲜的、4摄氏度的分选缓冲液洗涤柱子，并将流出液收集到同一管中。经过第二个磁性柱后，可获得纯度高于94%的血浆样树突状细胞群体。为了分离CD8α+和CD8α−树突状细胞，将剩余的脾细胞悬液与CD8α+树突状细胞分离试剂盒中的100微升生物素标记抗体混合液在冰上轻轻混匀15分钟，期间轻弹管壁，操作方法如前所示。孵育结束后，用12毫升4摄氏度的细胞分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于150微升新鲜的4摄氏度细胞分选缓冲液中。接着，将细胞与100微升CD8α+树突

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠树突状细胞亚群的分离的高效和高产的方法

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