小鼠树突状细胞亚群的分离的高效和高产的方法

该方案的总体目标是开发一种高效、高产量的方法来产生树突状细胞或 DC，这注定地反映了它们的体内表型和功能分歧。树突状细胞在淋巴器官中以大量群体的形式存在。因此，我们使用滤过配体来增加供体组织中这些必需细胞的频率，以促进这种分离。

该技术的主要优点是它消除了所有合适数量的 DC 子集的生成，以便仅使用市售试剂进行分析。要从 90% 汇合培养物中收获表达 B16 黑色素瘤细胞的 flt-3 配体，首先用 PBS 洗涤细胞，并在 37 摄氏度下与 05% 胰蛋白酶孵育培养物。5 分钟后，用 20 mL 4 摄氏度完全二元培养基淬灭蛋白酶活性，然后轻轻敲击和轻轻移液分离贴壁细胞模型层。

通过离心收集细胞并计数。然后，将单细胞悬液重悬至 PBS 中 8 个细胞浓度的 1 倍，用于皮下注射到 C57 黑色 6 受体小鼠中。当肿瘤直径达到 2 至 10 毫升时，从荷瘤动物中收获脾脏，并将脾脏置于含有新鲜 RPMI 培养基的培养皿中。

使用手术刀将组织切成 0.2 平方厘米的小块，然后将片段在 10 毫升胶原酶和 Dnase 中于 37 摄氏度孵育。30 分钟后，将部分消化的组织浆液倒在 70 微米的细胞过滤器上，并使用 5 毫升注射器柱塞将剩余的组织碎片压入过滤器的网孔。用 10 毫升新鲜培养基冲洗过滤器，将洗涤液与其余单细胞悬液混合并沉淀细胞。

我们将细胞沉淀物在 2 mL 红细胞裂解缓冲液中，在室温下悬浮 10 分钟。然后在 10 毫升新鲜的 RPMI 培养基中洗涤细胞，并在含有 FC 块的细胞分选缓冲液中以 1 倍 10 至每毫升 8 个细胞的速度重新悬浮细胞。为了分离浆细胞 DC，将来自浆细胞 DC 分离试剂盒的 300 μL 生物素标记的抗体混合物与 200 μL 脾单细胞悬液彻底混合。

将细胞置于冰水浴中 15 分钟，每 3 分钟轻轻敲击一次。然后用 12 毫升细胞分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 500 微升新鲜分选缓冲液中。接下来，将细胞在 300 μL 抗生物素抗体偶联珠中再孵育 15 分钟，同时定期敲击。

在新鲜的分选缓冲液中洗涤细胞后，将托盘重新悬浮在 2 mL细胞分选缓冲液中，并将适当大小的磁柱加载到相应的磁力架上。用 5 mL 新鲜的 4 °C 细胞分选缓冲液平衡色谱柱。当所有缓冲液从柱顶部排出后，小心地将细胞添加到柱头表面的中心，并收集流出液。

然后用 10 mL 新鲜的 4 °C 分选缓冲液洗涤色谱柱，并将流出液收集在同一管中。通过第二根磁柱后，可以预期会出现纯度大于 94% 的浆细胞树突状细胞群。为了分离 CD8aplha + 和 CD8alpha-DC，将剩余的脾细胞悬液与 CD8alpha + 树突状细胞分离试剂盒中的 100 微升生物离子偶联抗体混合物在冰上混合 15 分钟，轻轻敲击，如刚才所示。

孵育结束时，在 12 毫升 4 摄氏度细胞分选缓冲液中洗涤细胞，并将沉淀重悬于 150 微升新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液中。接下来，将细胞与 100 μL CD8alpha + 树突状细胞分离试剂盒抗生物素珠混合。在冰上轻轻敲击 15 分钟后，在 10 mL 4°C 细胞分选缓冲液中洗涤细胞，然后将沉淀重悬于 1 mL 新鲜的 4°C 分选缓冲液中。

在孵育结束时，通过磁珠分离对细胞进行分选，如刚才所示，收集流出液和第一次洗涤液。然后，旋转细胞并将沉淀重悬于一毫升新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液中。现在用试剂盒中的 200 μL 抗 CD8aplha 偶联磁珠标记细胞，并使细胞通过新的色谱柱，收集 CD8alpha-树突状细胞流出。

要收集 CD8alpha + DC，请将色谱柱转移到 15 mL 锥形管中，然后将 5 mL 新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液浸入色谱柱中。在细胞通过第二柱后，可以预期会有大于 96% 的 CD8alpha + 树突状细胞群。要分离 CD8alpha 细胞，请旋转 CD8alpha 流穿细胞悬液。

然后用 100 微升抗 CD11 c 磁珠标记细胞，并收集磁珠阳性细胞群，如刚才所示，以获得大于 97% CD8alpha 树突状细胞亚群。最后，通过台盼蓝排除法确定活细胞的数量。一旦肿瘤变得可触及，B16 flt-3 配体荷瘤小鼠始终表现出脾细胞性的显着增加，这与脾树突状细胞亚群的扩增相关。

有趣的是，虽然在这些动物中观察到常规 DC 的绝对细胞数增加了 15 到 20 倍，但对于浆细胞 DC 亚群，仅观察到大约 4 倍。根据其 B220、CD11b、CD11c 和 CD8alpha 表达对不同的树突状细胞亚群进行表征。细胞群也表现出其他独特的亚群标志物，然而，mPDCA1 仅在浆细胞 DC 上表达，DEC205 在 CD8alpa+DC 上高度表达，CD11b 和 33D1 在 CD8alpha-DC 上检测最为突出。

使用这种方法，我们已经证明 CD8alpa+DC 在 CD 键分子将抗原呈递到称为不变 NKT 细胞的特殊 T 细胞群中是最有效的。直流隔离最关键的特征是保持严格的无菌和无抗氧剂的条件。在手术过程中，这些 T 细胞对抗毒素高度敏感。

在尝试此过程时，重要的是要记住轻柔地处理细胞，因为重复的机械刺激可能会改变树突细胞的成熟状态。一旦掌握，该技术可用于从单个脾脏中分离出大量所有主要 DC 亚群。感谢您的观看，祝您的实验好运。