Name: 一种简单有效的方法，用于测试从人 CD14+ 单核细胞生成致耐受性树突状细胞的免疫调节剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 了解利用人CD14+单核细胞体外诱导致耐受性树突状细胞的方法，并通过流式细胞术验证其诱导调节性T细胞的功能。该技术为自身免疫病和移植治疗提供了新的细胞治疗策略。

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我们感谢宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室（HIC）提供来自捐赠者的新型人类外周血单个核细胞（PBMCs）。HIC 部分由美国国立卫生研究院（NIH）P30 AI045008 和 P30 CA016520 项目资助。

所有人外周血单个核细胞（PBMC）样本均来自宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室，供体均为匿名捐赠者，经宾夕法尼亚大学机构审查委员会（IRB）事先批准，并获得患者知情同意。
可选步骤：本方法中使用了来自学术实验室的新鲜分离外周血单个核细胞（PBMC），但PBMC也可从全血或白细胞分离富集的血液制品中分离获得。我们推荐使用密度梯度离心法，因为这是一种成熟且可靠的方法，其他文献中已有详细描述23。
1. 单核细胞/T 细胞的分离及 moDC 的分化
<ol>
	<li>从外周血单个核细胞中分离单核细胞和T细胞——第1天
	<ol>
		<li>从健康供体获取2亿个人外周血单个核细胞（PBMCs）。将细胞置于15 mL离心管中，并置于冰上运输。</li>
		<li>在锥形管中分装50 mL分离缓冲液（可从市售分离试剂盒中获得）。 
		注意：分离缓冲液也可用含2%胎牛血清（FBS）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的DPBS替代。</li>
		<li>将PBMC离心管从冰上取出，加入分离缓冲液。在300 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>使用10 mL移液管吸除上清液。用移液管将细胞沉淀重悬于4 mL推荐培养基中。</li>
		<li>将悬液均分为两份，分别加入两个15 mL离心管中，每管2 mL（每管细胞浓度为5 × 107 个细胞/mL）。将其中一管标记为 &#34;T&#34;，另一管标记为 &#34;单核细胞&#34;。</li>
		<li>取出 人单核细胞分离试剂盒，并按照生产商说明书操作，从标记为“单核细胞”的离心管中分离单核细胞。</li>
		<li>取出 人T细胞分离试剂盒，并按照生产商说明书操作，从第二管中分离T细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单核细胞铺板以诱导分化及T细胞冻存——第1天
	<ol>
		<li>将50 mL moDC培养基（表1）预热至37 °C，至少10分钟。</li>
		<li>将富集后的单核细胞所在的15 mL离心管以及步骤1.1中获得的T细胞所在的15 mL离心管在250 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液。用移液器反复吹打，将单核细胞重悬于1 mL moDC培养基中，T细胞重悬于T细胞培养基（表1）中。确保细胞沉淀完全分散。</li>
		<li>使用自动细胞计数仪或台盼蓝染色结合血细胞计数板进行细胞计数。 
		注意：在代表性数据中，分离得到1000万个T细胞和300万个单核细胞。</li>
		<li>取含单核细胞的离心管，向悬液中加入9 mL预热的moDC培养基，终体积为10 mL。然后加入100 µL 10 µg/mL GM-CSF储备液和100 µL 10 µg/mL IL-4储备液，使培养基中GM-CSF和IL-4的终浓度均为100 ng/mL。将悬液转移至培养皿中，标记为 &#34;moDC&#34;（第1天），并在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
		<li>取T细胞管，将1 mL T细胞冻存液（表1）与1 mL T细胞悬液混合，分装至两个2 mL冻存管中（每管1 mL），密封（每管终浓度为500万个细胞）。将冻存管放入冻存盒中，未使用孔位用平衡管填充。将冻存盒置于−80 °C冰箱中过夜，随后将冻存管转移至液氮罐中长期保存。</li>
		<li>第4天，更换培养基：加入5 mL新鲜moDC培养基，并添加GM-CSF和IL-4储备液各100 µL。第7天时，分化完成的moDC即可使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 添加免疫调节药物以生成耐受性 moDC
<ol>
	<li>设置 moDC 培养板。
	<ol>
		<li>第7天，从培养箱中取出已分化的 moDCs，将 moDC 细胞悬液转移至 50 mL 离心管中。</li>
		<li>以 250 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，用移液器上下吹打，将细胞沉淀重悬于 1 mL 温热的 moDC 培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并用含 100 ng/mL GM-CSF 和 IL-4 的温热 moDC 培养基将细胞稀释至浓度为 3 × 105 个细胞/mL。</li>
		<li>在平底 96 孔细胞培养板中，每孔加入 100 µL 含 3 × 104 个细胞的悬液，加入所需数量的孔。 
		注：为获得代表性结果，我们共使用了 48 个孔（四个条件，每个条件设三个复孔，用于第 3 和第 4 部分的四种不同分析），但可根据需要调整至最多 60 个孔。其余孔每孔加入 100 µL PBS，以防止干燥，尤其是外周孔。建议为每种分析方法分别准备不同的培养板。</li>
		<li>向目标孔中每孔加入 1 µL 免疫调节药物（此处为 10 ng/mL 雷帕霉素）。将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。 
		注：若在第 8 天进行免疫刺激，则应分别设置含和不含免疫刺激的免疫调节药物孔。是否使用免疫刺激以诱导 moDC 成熟为可选步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复苏 T 细胞。
	<ol>
		<li>第8天，从液氮罐中取出两个冻存管，在 37 °C 的金属浴或水浴中快速解冻，直至内容物开始融化（&#60;3 分钟）。</li>
		<li>当内容物开始融化时，将冻存管转移至细胞培养操作台，用移液器加入 1 mL 温热的 T 细胞培养基以加速解冻。将管内全部内容物转移至一个 50 mL 离心管中。用 1 mL T 细胞培养基冲洗冻存管，确保所有细胞均被转移至离心管中。</li>
		<li>用流式染色液（表 1）将悬液补至 15 mL。以 200 × g 离心 10 分钟，吸除上清液。随后将沉淀重悬于 5 mL 流式染色液中，再次离心。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL 温热的 T 细胞培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数。 
		注：此阶段细胞活力应&#62;70%；若存在大量死细胞，可将细胞转移至新管，加入 10 mL 细胞染色液，以 200 × g 离心 5 分钟，重悬于 1 mL T 细胞培养基中，重新计数。</li>
		<li>加入 9 mL 温热的 T 细胞培养基，使终体积为 10 mL。将细胞悬液转移至培养皿中，标记为&#34;Rethawed T Cells&#34;，并在 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养，使细胞恢复状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤 moDC 培养板，并根据需要加入免疫刺激剂。
	<ol>
		<li>第8天，将第7天的 moDC 培养板以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，用温热的 HBSS 洗涤，重复离心，再次吸除上清液，然后用含 GM-CSF 和 IL-4 的温热 moDC 培养基将细胞重悬（每孔 100 µL）。 
		注：操作时注意不要扰动细胞。吸液时倾斜培养板。每孔可残留约 10 µL 液体。</li>
		<li>如需进行免疫刺激，向目标孔中每孔加入 1 µL 100 倍浓缩的 LPS 储液（或其他免疫刺激剂）。将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. moDC 的流式分析（验证 + 耐受性）
<ol>
	<li>用于验证moDC的流式分析
	<ol>
		<li>第8天，配制针对以下标志物的验证面板抗体混合液：HLA-DR、CD14、树突状细胞特异性C型凝集素（DC-SIGN）、CD1c和CD40，具体如表2所述。使用流式染色液稀释所有抗体。 
		注：该抗体组合是为配备红/蓝激光的7色流式细胞仪设计的。</li>
		<li>从培养箱中取出moDC培养板，以300 × g离心5分钟，弃去上清液。可选：保留上清液，按照试剂盒说明书使用市售试剂盒进行IL-10和TNFα细胞因子的ELISA分析。</li>
		<li>每孔加入200 µL流式染色液，以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，每孔加入50 µL用流式染色液按1:200稀释的Fc受体结合抑制抗体，以阻断非特异性结合。室温（RT）孵育30分钟。</li>
		<li>每孔加入50 µL配制好的验证面板抗体混合液。</li>
		<li>在培养板或1.5 mL离心管中制备补偿对照，将50 µL补偿微球与每种稀释后的抗体50 µL混合。4 °C孵育1小时。 
		注：此处使用补偿微球而非细胞进行补偿，因为moDC上某些标志物的表达水平可能较低。</li>
		<li>以300 × g离心5分钟，弃去上清液，用200 µL流式染色液重悬细胞，洗涤两次。</li>
		<li>最后一次洗涤后再次离心，每孔用110 µL流式染色液重悬细胞。样品现可进行流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>耐受性moDC的流式分析（耐受性面板）
	<ol>
		<li>与第8天步骤3.1类似，配制针对以下标志物的耐受性面板抗体混合液：CD86、PD-L1、DC-SIGN、CD1c、BTLA和CD40（表2）。</li>
		<li>重复步骤3.1.2–3.1.8，将抗体混合液替换为耐受性面板抗体混合液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. T细胞的流式分析
<ol>
	<li>将T细胞与经处理的耐受性moDCs混合。
	<ol>
		<li>第9天，从培养箱中取出重新解冻的T细胞培养皿，将所有T细胞转移至50 mL离心管中，并用流式染色液补足体积。</li>
		<li>可选步骤：如需进行T细胞增殖分析，将T细胞分装至两个离心管中。
		<ol>
			<li>取第一管，以250 × g离心5分钟，弃去上清液。根据制造商说明书，用细胞增殖染料对该管进行染色。 
			注：我们使用了可固定的活死染料eFluor 670，需孵育30分钟，随后进行两次洗涤步骤。建议使用50 mL锥形管以防止细胞丢失，并在染色后使用含10% HIFBS的HBSS进行洗涤。</li>
			<li>第二管保留未染色T细胞用于Treg分析。同样以250 × g离心5分钟，弃去上清液，用预温的细胞培养基重悬，并在染色过程中置于培养箱内。若无需进行T细胞增殖分析，则将全部T细胞离心后重悬于预温的T细胞培养基中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计数细胞，获得至少400万个细胞（仅用于Treg分析）或800万个细胞（用于Treg与T细胞增殖分析）。</li>
		<li>从培养箱中取出含有剩余孔的moDC培养板，以300 × g离心5分钟，吸除上清液。每孔加入200 µL T细胞悬液，细胞密度为1.6 × 105 个细胞/孔。Treg分析板中加入未染色T细胞，T细胞增殖分析板中加入已染色T细胞。 
		注：由于初始接种的3 × 104 个moDCs通常会略有扩增，此操作可维持T细胞与moDCs的比例为5:1。</li>
		<li>除阴性对照孔外，向所有组别中加入25 µL/mL抗CD3/CD28抗体混合物以刺激T细胞。将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育72小时，至第12天。 
		注：务必使用已染色T细胞进行增殖分析，未染色T细胞用于Treg分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Treg流式分析
	<ol>
		<li>表面标志物染色
		<ol>
			<li>第12天，配制Treg Panel的抗体混合液（表2）。</li>
			<li>将96孔培养板中所有细胞悬液转移至V型底板中，并加入流式染色液。保留上清液用于细胞因子分析。</li>
			<li>通过离心（200 × g，5分钟）用流式染色液洗涤细胞两次，每次200 µL。留取部分细胞用于补偿对照。另设一管用于FOXP3染色及未染色对照。 
			注：我们建议在步骤4.2.1.3最终离心前，将所有样本各取10 µL混合，以获得必要的补偿对照。这可提供细胞表面各标志物表达水平的代表性样本。</li>
			<li>第二次洗涤后，于室温下以200 × g离心5分钟，吸除上清液，每孔加入50 µL Fc受体结合抑制抗体（用流式染色液按1:200稀释）。室温孵育10分钟。</li>
			<li>每孔加入50 µL已配制好的Treg Panel抗体混合液。</li>
			<li>对于补偿对照，将50 µL未染色补偿细胞与50 µL每种单染抗体混合。</li>
			<li>将培养板及补偿对照于4 °C孵育1小时。用流式染色液洗涤一次（200 µL/孔），并以300 × g离心5分钟。</li>
			<li>每孔加入200 µL用HBSS稀释的活死近红外染料（1:1,000），于4 °C孵育30分钟。</li>
			<li>用流式染色液（200 µL/孔）洗涤一次，于300 × g离心5分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据制造商说明书进行FoxP3染色，需过夜孵育。FoxP3染色方案简要描述如下。
		<ol>
			<li>根据制造商说明书配制FoxP3固定/通透工作液：将1份FoxP3固定/通透浓缩液与3份FoxP3固定/通透稀释液混合。每样本准备200 µL工作液。</li>
			<li>所有样本每孔加入200 µL工作液，于4 °C孵育1小时。</li>
			<li>配制1x通透缓冲液：将1份10x通透缓冲液（购自商用试剂盒）与9份去离子水混合。</li>
			<li>用1x通透缓冲液（200 µL/孔）洗涤培养板两次，每次以300 × g离心5分钟。</li>
			<li>FoxP3抗体染色（PE-Cy5.5，用1x通透缓冲液按1:300稀释）：每孔加入100 µL稀释后的FoxP3抗体，于4 °C过夜孵育。</li>
			<li>用1x通透缓冲液（200 µL/孔）洗涤培养板两次，每次以300 × g离心5分钟。</li>
			<li>每孔用110 µL流式染色液重悬细胞。</li>
			<li>进行流式细胞术分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T细胞增殖分析
	<ol>
		<li>配制T增殖Panel的抗体混合液（表2）。</li>
		<li>将96孔培养板中所有细胞悬液转移至V型底板中，并加入流式染色液。保留上清液用于细胞因子分析。</li>
		<li>通过离心（200 × g，5分钟）用流式染色液洗涤细胞两次，每次200 µL。留取部分细胞用于补偿对照。另设一管用于FOXP3染色及未染色对照。 
		注：我们建议在步骤4.3.3最终离心前，将所有样本各取10 µL混合，以获得必要的补偿对照。这可提供细胞表面各标志物表达水平的代表性样本。</li>
		<li>第二次洗涤后，于室温下以200 × g离心5分钟，吸除上清液，每孔加入50 µL Fc受体结合抑制抗体（用流式染色液按1:200稀释）。室温孵育10分钟。</li>
		<li>每孔加入50 µL已配制好的T增殖Panel抗体混合液。</li>
		<li>对于补偿对照，将50 µL未染色补偿细胞与50 µL每种单染抗体混合。</li>
		<li>将培养板及补偿对照于4 °C孵育1小时。用流式染色液洗涤一次，以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>每孔加入200 µL用HBSS稀释的活死近红外染料（1:1,000），于4 °C孵育30分钟。</li>
		<li>用流式染色液（200 µL/孔）洗涤一次，于300 × g离心5分钟。</li>
		<li>进行流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

在此，我们介绍一种可靠且多功能的方法，用于评估免疫调节剂诱导单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）分化为耐受性树突状细胞（tolDCs）的功能，并验证这些tolDCs诱导自体T细胞生成调节性T细胞（Tregs）的功能活性。 离体该方案中有几个关键步骤。首先，单核细胞是众所周知的敏感细胞，必须从新鲜的、未经冻存的外周血单个核细胞（PBMC）中获取，以获得最佳结果。单核细胞应尽快分离并立即放入分化培养基中。通常，单核细胞得率低或在前24小时出现高死亡率，是由于冻融循环或PBMC与单核细胞分离之间间隔时间过长所致。其次，用于moDC分化和T细胞培养的细胞因子必须来源于高质量试剂。通常，moDC分化效果不佳是由于细胞因子质量差或浓度不正确所致。第三，建议在第1至第7天之间将T细胞冻存，而不是持续培养，以维持其初始（naïve）且未受刺激的表型。第四，处理后的moDC可静置培养最多72小时，有助于促进耐受性标志物（如PD-L1和IL-10）的表达上调，这一点已在研究中观察到。 图6最后，正如我们在数据中所见，不同患者在Treg生成能力方面存在显著个体差异，因此每次实验必...

树突状细胞（DCs）是连接先天免疫与适应性免疫的关键媒介。DCs 主要存在于黏膜膜、皮肤和淋巴组织中，是主要的抗原呈递细胞（APCs）1。DCs 摄取外源性蛋白质，并将其加工后通过主要组织相容性复合物（MHC）呈递给初始T细胞。DCs 特异性表达 MHC II 类分子，例如人类中的人白细胞抗原-DR（HLA-DR）。DCs 在接触抗原后的活化状态对下游T细胞应答至关重要2。未成熟DCs 表达多种模式识别受体（PRRs），可识别称为病原体相关分子模式（PAMPs）的一类分子，例如细菌细胞壁成分脂多糖（LPS）3。当PRRs受到刺激后，DCs 成熟为成熟DCs，并上调重要的T细胞共刺激分子，如CD80、CD86和CD40，同时分泌促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNFα），从而促进初始T细胞分化为传统的效应T细胞或辅助T细胞2。相反，如果DC的成熟过程被中断，或DC在耐受性环境中发育，则可形成耐受性DC状态（tolDCs）4。tolDCs 下调经典的T细胞共刺激受体，转而上调耐受性受体，如程序性细胞死亡配体1（PD-L1）和B细胞及T细胞衰减因子（BTLA），并产生抑制性细胞因子，如白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β）4。这并非耐受性标志物的完整列表，事实上，目前对于哪些tolDC标志物适合用于定义tolDC状态尚缺乏明确共识5。鉴于此，我们建议将调节性T细胞（Treg）的生成作为功能性标志物，应用于比较不同tolDC诱导剂的效果。
除了耐受性树突状细胞（tolDC）与成熟树突状细胞（成熟DC）的活化状态外，树突状细胞（DC）还可根据其谱系或组织定位进行分类，每种亚群的功能略有不同。尽管tolDC与成熟DC之间的划分并不十分明确，更多表现为一种连续状态，但基于谱系的分类在人和小鼠中均有明确的标志物。DC前体细胞在骨髓中形成，但根据其谱系来源主要分为两种亚型：1）浆细胞样树突状细胞（pDCs），来源于淋巴样谱系；2）传统树突状细胞（cDCs），来源于髓样谱系。在人体中，pDCs在淋巴器官中成熟，表达CD303，并在病毒感染中具有高度应答性6。表达CD11c的cDCs则在外周组织中成熟，并存在两种不同的亚型：CD1c+ cDC1和CD141+ cDC2，它们各自诱导不同的T细胞应答7。此外，所有cDCs均可处于组织驻留型（CD103-）或迁移型（CD103+）两种亚状态之一8。最后，在特定条件下，单核细胞谱系（CD14+）的细胞可被诱导转化为树突状细胞表型，并表现为CD14-、CD141+、CD1c+ 9。这类细胞被称为单核细胞来源的树突状细胞（moDCs），在人类中常用于体外（ex vivo）分析，因为单核细胞约占人外周血单个核细胞（PBMCs）的10–30%，而pDCs仅占1–3%10。这使得moDC成为一种具有吸引力的选择，但已知moDC比从原代组织中分离的典型cDC更具炎症特性9。
目前，利用耐受性树突状细胞（tolDCs）诱导临床耐受的研究主要分为两大类。第一类是将单核细胞体外诱导生成tolDCs，作为细胞疗法使用。在此策略中，通常在IL-4和GM-CSF存在下，同时联合使用维生素D3、雷帕霉素（rapa）、IL-10、地塞米松等免疫调节剂或其组合，将单核细胞分化为髓系树突状细胞（moDCs）11,12。这类tolDCs已被探索用于自身免疫病和器官移植的自体细胞治疗13。第二类方法则是利用游离药物或纳米载体递送免疫调节剂和目标抗原，原位重编程内源性树突状细胞向tolDCs转化14,15,16。然而，由于已分化的树突状细胞通常具有稳定的代谢表型，而该表型往往与tolDC的代谢特征相悖，因此对其进行诱导更为困难17,18。这对大多数药理学免疫调节剂提出了较高要求；因此，大多数针对内源性DC的重编程研究虽能有效抑制DC活性并部分诱导调节性T细胞（Treg）生成，但往往因T细胞无法持久存续而导致临床疗效不佳15,19,20。这凸显了亟需开发新的策略，以从现有树突状细胞中筛选潜在的tolDC诱导剂。
此处，我们介绍一种方法 体外 评估免疫调节剂对已分化单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）在诱导自体调节性T细胞（Treg）这一终末指标下的作用。本方案旨在评估免疫调节剂对已完全分化的入源moDCs向耐受性表型重编程的效果。此外，本方案可验证经重编程获得的耐受性树突状细胞（tolDCs）能否利用来自同一份外周血单个核细胞（PBMC）样本的自体T细胞诱导生成调节性T细胞（Tregs）。相比之下，其他方案通常在细胞分化过程中诱导耐受性，和/或使用异基因供体的T细胞来验证tolDCs的功能21在本实验方案中，我们以常用的耐受性诱导剂雷帕霉素（rapa）为例，同时展示了经rapa处理的moDC在诱导调节性T细胞（Tregs）方面的局限性。在代表性结果中，我们还展示了其他常见免疫调节剂（如IL-10、地塞米松和维生素D3）的干预效果。我们预期本方案可用于筛选针对已建立的moDC更具潜力的耐受性树突状细胞（tolDC）诱导剂。22.

<table><tbody><tr><td>0.1-10 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>VWR</td><td>76322-158</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>77508-358</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>414004-267</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>100-1000 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>VWR</td><td>76322-164</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>VWR</td><td>77508-212</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>20-200 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>VWR</td><td>76322-160</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>MP Biomedical</td><td>194834</td><td>T 细胞培养</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>VWR</td><td>21008-736</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>60 × 15 mm 培养皿，Nunclon Delta</td><td>Thermo Fischer</td><td>150326</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>96 孔锥底（V 型底）板，非处理表面</td><td>Thermo Fischer</td><td>277143</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>Thermo Fischer</td><td>161093</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗人 CD272 (BTLA) 抗体</td><td>Biolegend</td><td>344518</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>Attune NxT（红/蓝激光，7 通道）</td><td>Thermo Fischer</td><td>A24863</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermo Fischer</td><td>15260-037</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>CD14 单克隆抗体 (61D3)，PE</td><td>Thermo Fischer</td><td>12-0149-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD1c 单克隆抗体 (L161)，PE-Cyanine7</td><td>Thermo Fischer</td><td>25-0015-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD209 (DC-SIGN) 单克隆抗体 (eB-h209)，PerCP-Cyanine5.5</td><td>Thermo Fischer</td><td>45-2099-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD25 单克隆抗体 (CD25-4E3)，APC</td><td>Thermo Fischer</td><td>17-0257-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) 单克隆抗体 (MIH1)，PE</td><td>Thermo Fischer</td><td>12-5983-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD4 单克隆抗体 (RPA-T4)，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fischer</td><td>53-0049-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD40 单克隆抗体 (5C3)，APC</td><td>Thermo Fischer</td><td>17-0409-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD40 单克隆抗体 (5C3)，APC-eFluor 780</td><td>Thermo Fischer</td><td>47-0409-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD69 单克隆抗体 (FN50)，PE</td><td>Thermo Fischer</td><td>MA1-10276</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD86 单克隆抗体 (BU63)，FITC</td><td>Thermo Fischer</td><td>MHCD8601</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD8a 单克隆抗体 (RPA-T8)，PE-Cyanine7</td><td>Thermo Fischer</td><td>25-0088-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>锥底（V 型底）96 孔板</td><td>Thermo Fischer</td><td>2605</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>冻存管，2 mL</td><td>Thermo Fischer</td><td>430488</td><td>T 细胞培养</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)，测序级</td><td>Thermo Fischer</td><td>20688</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fischer</td><td>14200166</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>EasySep 人单核细胞分离试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19359</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>EasySep 人 T 细胞分离试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17951</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>EasySep 磁力架</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fischer</td><td>AIM9260G</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚苯乙烯管，5 mL</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>38025</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>Fc 受体结合抑制剂多克隆抗体</td><td>Thermo Fischer</td><td>14-9161-73</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fischer</td><td>A5670701</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>可固定活力染料 eFluor 780</td><td>Thermo Fischer</td><td>65-0865-18</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装</td><td>Thermo Fischer</td><td>00-5523-00</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>FOXP3 单克隆抗体 (PCH101)，PE-Cyanine5.5</td><td>Thermo Fischer</td><td>35-4776-42</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fischer</td><td>14170-112</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Thermo Fischer</td><td>A5670801</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fischer</td><td>15630106</td><td>moDC 细胞培养</td></tr><tr><td>HLA-DR 单克隆抗体 (L243)，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fischer</td><td>A51009</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>人 CD3/CD28/CD2 T 细胞激活剂</td><td>StemCell Technologies</td><td>10970</td><td>T 细胞培养</td></tr><tr><td>人 GM-CSF 重组蛋白</td><td>Thermo Fischer</td><td>300-03</td><td>moDC 细胞培养</td></tr><tr><td>人 IL-10 ELISA 试剂盒，高灵敏度</td><td>Thermo Fischer</td><td>BMS215-2HS</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>人 IL-4，无动物源重组蛋白</td><td>Thermo Fischer</td><td>AF-200-04</td><td>moDC 细胞培养</td></tr><tr><td>人外周血单个核细胞（新鲜分离）</td><td>UPenn HIC</td><td>N/A</td><td>细胞</td></tr><tr><td>人 TNF-α ELISA 试剂盒</td><td>Thermo Fischer</td><td>BMS223-4</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>倒置显微镜 (DMi1)</td><td>Lucia</td><td>391240</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>脂多糖 (LPS)</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eblps</td><td>moDC 细胞培养</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒</td><td>Thermo Fischer</td><td>L34975</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)</td><td>Thermo Fischer</td><td>11140050</td><td>T 细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 (100x)</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>移液控制器</td><td>VWR</td><td>77575-370</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>雷帕霉素，98+%</td><td>Thermo Fischer</td><td>J62473.MF</td><td>moDC 细胞培养</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（含 Glutamax）</td><td>Thermo Fischer</td><td>61870-036</td><td>常规细胞培养</td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>20144</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>T 细胞刺激混合物 (500x)</td><td>Thermo Fischer</td><td>00-4970-93</td><td>T 细胞培养</td></tr><tr><td>UltraComp eBead Plus 补偿微珠</td><td>Thermo Fischer</td><td>01-3333-41</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>可调式移液器套装</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-403-152</td><td>常规细胞培养</td></tr></tbody></table>

一种简单高效的人cd14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

A Simple and Efficient Method for Testing Immunomodulatory Agents for Generation of Tolerogenic Dendritic Cells from Human CD14+ Monocytes

耐受性树突状细胞（tolDCs）是一类树突状细胞（DCs）亚群，能够诱导初始T细胞向调节性T细胞（Treg）表型分化。目前，tolDCs正作为治疗自身免疫性疾病和移植排斥的潜在手段被广泛研究，既可作为细胞治疗策略，也可通过诱导内源性DC转化为tolDCs来实现治疗目的。然而迄今为止，已知能够从初始DC诱导生成tolDCs的因子数量仍相对有限，且其诱导Treg细胞产生的效力也尚不充分。 体内 一直不一致，尤其是那些通过内源性树突状细胞诱导耐受性树突状细胞（tolDCs）的疗法。这为探索新型化合物以诱导免疫耐受提供了机会。
本文介绍了一种在单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）上测试新型免疫调节化合物的方法 体外 并验证其生成自体调节性T细胞（Tregs）的功能。首先，我们获取外周血单个核细胞（PBMCs）并分离CD14+ 单核细胞和CD3+ 使用市售磁分离试剂盒分离T细胞。接着，将单核细胞诱导分化为moDCs，并用已知的免疫调节剂（如雷帕霉素、地塞米松、IL-10或维生素D3）处理24小时，检测其耐受性标志物的变化，以验证本实验方案的有效性。最后，将诱导生成的耐受性树突状细胞（tolDCs）与自体T细胞在抗CD3/CD28刺激条件下共培养，观察调节性T细胞（Treg）群体的变化及T细胞增殖情况。我们预期该实验方案可用于评估新型免疫调节剂在将已分化树突状细胞重编程为tolDC方面的有效性。

我们描述了一种针对人外周血单个核细胞（PBMCs）的实验方案，使用 commercially available magnetic separation kits 分离 CD3+ T 细胞和 CD14+ 单核细胞，利用 GM-CSF 和 IL-4 将单核细胞诱导分化为 CD14-、HLA-DR+、CD141+、CD1c+ 的单核细胞来源的树突状细胞（moDCs），处理 24 小时后，与经抗 CD3/CD28 刺激的自体 T 细胞共培养 72 小时。实验流程示意图见图 1。
单核细胞/T细胞的分离及moDC分化 
在本研究的初步代表性结果中，我们从宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室（HIC）购买了来自一名健康供体的2亿个人外周血单个核细胞（PBMCs），并按照方案第1和第2部分所述进行处理。血液于第1天采集，并在HIC实验室采用标准的Ficoll密度梯度离...

我们描述了一种评估药物制剂能否将未经处理的单核细胞来源的树突状细胞转化为耐受性树突状细胞的方法 体外 并通过自体调节性T细胞的生成来验证其效力。

一种简单高效的人CD14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

耐受性树突状细胞（tolDCs）是一类树突状细胞（DCs）亚群，已知可诱导初始T细胞向调节性T细胞分化……

我们致力于研究哪些免疫调节治疗能够使已分化的单核细胞来源树突状细胞转化为耐受性树突状细胞，这对于自身免疫病和移植研究具有重要价值。随着制造技术的进步，自体疗法正变得越来越可行，而耐受性树突状细胞在临床前研究中已显示出良好的应用前景，其能够诱导抗原特异性免疫耐受。最常用的技术是流式细胞术，该方法为分析耐受性细胞提供了一种快速且易于实施的途径。然而，生成在体内具有持久功能的耐受性树突状细胞仍具挑战性，这也是目前尚无任何经临床批准的用于诱导耐受的树突状细胞疗法的原因。我们通过大规模筛选研究，已鉴定出若干新型免疫调节化合物组合，这些组合可显著改善耐受性树突状细胞的功能特性。此外，我们还设计了具有耐受诱导功能的纳米颗粒制剂。[讲师] 首先，将含有富集人单核细胞和T细胞的15毫升离心管放入离心机中。离心完成后，使用移液器吸除管中的上清液。向单核细胞沉淀中加入1毫升MODC培养基，向含有T细胞的管中加入1毫升T细胞培养基，并充分混匀后再进行细胞计数。接着，向单核细胞悬液中加入9毫升预热的MODC培养基，使最终体积达到10毫升。然后分别用移液器加入100微升GM-CSF和IL-4储备液。将悬液转移至标记为MODC的培养皿中，并进行孵育。接下来，向T细胞悬液中加入1毫升T细胞冻存液。将混合液分装至两个2毫升冻存管中。将密封的冻存管放入冷冻室中，未使用的孔位用配平管填充。第4天时，向单核细胞管中加入5毫升新鲜MODC培养基。然后分别用移液器加入100微升GM-CSF和IL-4储备液，并继续孵育至第7天。第7天时，将已分化的单核细胞来源的树突状细胞（即MDOCs）转移至50毫升离心管中，并按前述方法离心。向细胞沉淀中加入1毫升预热的MODC培养基，反复吹打混匀。使用血细胞计数板进行细胞计数。用含GM-CSF和IL4的预热MODC培养基稀释悬液，直至达到所需细胞浓度。将含30,000个细胞的100微升悬液分装至平底96孔组织培养板的每孔中。向指定孔中加入1微升免疫调节药物，并进行孵育。次日，以300 ×g离心MODC板5分钟。轻轻去除上清液后，沿板壁轻轻加入200微升预热的HBSS，再次离心。再次吸除上清液后，向每孔加入含GM-CSF和IL4的100微升预热MODC培养基。若使用免疫刺激，则向指定孔中加入1微升100倍浓缩的脂多糖（LPS）储备液，并进行孵育。第8天时，在37摄氏度的热珠浴中解冻两支冻存管，直至内容物开始融化。部分解冻后，将冻存管转移至细胞培养超净台中。然后加入1毫升预热的T细胞培养基以快速解冻细胞。将内容物转移至50毫升离心管中，并用额外1毫升T细胞培养基冲洗冻存管，以回收全部细胞。用流式染色液补至15毫升后离心。将沉淀重悬于5毫升流式染色液中，再次离心，然后在吸除上清液后，用移液器将细胞沉淀重悬于1毫升预热的T细胞培养基中。加入9毫升预热的T细胞培养基，使最终体积为10毫升。将悬液转移至标记为“复苏T细胞”的培养皿中，并进行孵育。第8天时，以300 ×g离心MODC板5分钟。吸除上清液后，向每孔加入200微升流式染色液并孵育。然后反复吹打以去除贴壁细胞，并将细胞悬液转移至新的96孔V型底板，再次离心。在吸除上清液后，向每孔加入50微升FC受体结合抑制抗体，以阻断非特异性结合。室温孵育30分钟后，向每孔加入50微升预先配制的验证抗体混合液。在1.5毫升离心管中，将50微升补偿微珠与50微升每种稀释后的抗体混合，并进行孵育。以300 ×g离心板5分钟。用200微升流式染色液重悬沉淀以洗涤细胞。最终洗涤和离心后，将细胞重悬于110微升流式染色液中，用于流式细胞术分析。对于耐受性MODCs，使用耐受性抗体组合替代验证抗体组合。第9天时，将复苏T细胞的培养皿转移至50毫升离心管中，并用流式染色液补足体积。使用另一管未染色T细胞作为三联分析（trig analysis）对照。以250 ×g离心5分钟。去除上清液后，将细胞重悬于预热的细胞培养基中。对T细胞进行计数，并确保获得至少400万个细胞。以300 ×g离心MODC板5分钟。吸除上清液后，向每孔加入200微升T细胞悬液。为三联分析板加入未染色T细胞。除阴性对照孔外，向所有组别每毫升加入25微升抗CD3/CD28抗体混合液，以刺激T细胞，并继续孵育至第12天。接着，将96孔培养板中的所有细胞悬液转移至含流式染色液的V型底板中。用200微升流式染色液洗涤细胞两次。保留部分细胞用于补偿对照。第二次洗涤后，离心板。然后向每孔加入50微升稀释的FC受体结合抑制抗体，并进行孵育。孵育完成后，向每孔加入50微升预先配制的三联分析抗体混合液。对于补偿对照，将50微升未染色的补偿细胞与50微升每种单染抗体混合。将板和补偿对照在4摄氏度孵育1小时，然后用流式染色液洗涤并离心。随后，在冷孵育前，用HBSS稀释的Live/Dead近红外染料对细胞染色，每孔200微升。染色前先洗涤并离心板，再进行Fox P3染色和流式细胞术分析。第1天时，未分化的单核细胞主要为HLA-DR阴性，伴有少量CD14阴性细胞；而第7天分化的单核细胞则多数表现为HLA-DR阳性、CD14阴性、CD1c阳性、CD141阳性。使用雷帕霉素（rapamycin）处理，无论是否联合脂多糖（LPS），均显著减少DC-SIGN阳性CD1c阳性细胞群，并抑制单独LPS处理所诱导的CD86和CD40标志物的上调。当MDCs与T细胞共培养时，FOXP3阳性调节性T细胞群增加；但在四个MODC处理组之间未观察到显著差异。与经雷帕霉素处理的MDOCs共培养后，CD4阳性及CD8阳性T细胞群的增殖均减少。经白细胞介素-10（Interleukin-10）处理的样本在24小时时显著增加IL-10的产生。经地塞米松（Dex）处理的MDOCs显著增加IL-10的产生，但仅在静置72小时后观察到。地塞米松预处理可降低LPS处理24小时后的平均TNF-α生成量。在Dex联合LPS组及雷帕霉素处理组中，72小时时观察到PDL1阳性MDOCs显著增加。所有经免疫调节剂处理的组别在24小时和72小时均表现出CD86表达的抑制。经免疫调节剂处理的MDOCs未引起CD4阳性T细胞增殖的增加。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一种简单有效的方法，用于测试从人 CD14+ 单核细胞生成致耐受性树突状细胞的免疫调节剂

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

本视频展示了如何从人单核细胞诱导生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞（DC）。通过将单核细胞与生长因子和细胞因子共同孵育，可获得未成熟DC。在免疫调节分子的作用下，未成熟DC可进一步分化为耐受性DC和成熟DC。...

从单核细胞生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞

本视频演示了一种使用免疫调节药理学试剂将树突状细胞（DCs）转化为耐受性树突状细胞（TolDCs）的方法。通过评估TolDCs对CD4+...

免疫调节药剂对树突状细胞与CD4+ T细胞相互作用的影响

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

本研究比较了两种不同的人单核细胞分离方法，以获得 体外...

通过成像流式细胞术表征人单核细胞来源的树突状细胞：两种单核细胞分离方案的比较

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

转免疫化（TI）装置或培养板及相关实验方案已在实验条件下开发，用于模拟体外光化学疗法（ECP）的关键特征，从而生成生理活化且可调控的树突状细胞（DCs），用于癌症免疫治疗。...

生成生理免疫原性树突状细胞的新方法

本文介绍了一种体内增强肠道归巢调节性T细胞诱导的实验方案。在该方案中，树突状细胞被改造为能够局部从头合成高浓度的活性维生素D（1,25-二羟基维生素D或1,25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸或RA）。...

体内增强肠道归巢性调节性T细胞的诱导

该方法描述了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）的制备及其应用 体外...

利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

本文介绍了一种独特的综合性方案，可通过唾液酸酶处理，从分离的外周血单个核细胞（PBMCs）制备去唾液酸化的人单核细胞来源树突状细胞（mo-DCs）。此外，还描述了对mo-DCs进行表型和功能特征分析的方法，并评估唾液酸酶处理如何提高mo-DCs成熟水平的实验流程。...

生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

了解利用人CD14+单核细胞体外诱导致耐受性树突状细胞的方法，并通过流式细胞术验证其诱导调节性T细胞的功能。该技术为自身免疫病和移植治疗提供了新的细胞治疗策略。

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