一种简单有效的方法，用于测试从人 CD14⁺ 单核细胞生成致耐受性树突状细胞的免疫调节剂

我们试图了解哪些免疫调节治疗可以从已经分化的单核细胞来源的树突状细胞中产生耐受的树突状细胞，这对于自身免疫和移植研究非常有价值。由于制造技术的进步，自我治疗变得越来越实用，并且耐受性树突状细胞在临床前研究中显示出前景。它们可以产生抗原特异性耐受性。最常见的是细胞术。这提供了一种快速且易于使用的方法来分析耐受细胞。产生在体内持续具有两种功能的致耐受性树突状细胞具有挑战性。这就是为什么没有临床批准的树突状细胞疗法用于耐受的原因。我们从大型筛选研究中确定了免疫调节化合物的新组合，这些组合显示出耐受树突状细胞功能的改善。我们还设计耐受纳米颗粒配方。

[导师]首先，将装有富集人单核细胞和 T 细胞的 15 毫升试管放入离心机中。离心完成后，使用移液器从管中吸出上清液。将一毫升MODC培养基加入单核细胞沉淀中，将一毫升T细胞培养基加入装有T细胞的试管中，并在细胞计数前充分混合。接下来，将 9 毫升温热的 MODC 培养基加入单核细胞悬浮液中，使最终体积为 10 毫升。然后移液各100微升GM-CSF和IL-4储备溶液。将悬浮液转移到标记为MODC的培养皿中，并孵育。接下来，将一毫升 T 细胞冷冻培养基添加到 T 细胞悬液中。将混合物分成两个两毫升冷冻瓶。将密封的冷冻瓶放入冷冻室中，并在未使用的孔中放置平衡管。在第四天，向单核细胞管中加入五毫升新鲜的MODC培养基。然后移液 GM-CSF 和 IL-4 储备液各 100 微升，七并孵育至第七天。在第七天，将分化的单核细胞来源的树突状细胞或MDOC转移到50毫升管中，并像以前一样离心。将一毫升温热的 MODC 培养基加入细胞沉淀中，上下移液以充分混合。使用血细胞计数器计数细胞。用含有GM-CSF和IL4的温MODC培养基稀释悬液，直到获得所需的细胞浓度。将含有 30,000 个细胞的 100 微升悬浮液分配到平底 96 孔组织培养板的每个孔中。将一微升免疫调节药物加入指定孔中并孵育。第二天，将MODC板以300G离心五分钟。轻轻除去上清液后，轻轻地将 200 微升温热的 HBSS 加入板侧面并离心。再次，在上清液抽吸后加入100微升含有GM-CSF和IL4的温MODC培养基。如果使用免疫刺激，则将一微升100X脂多糖储备液加入指定孔中并孵育。第八天，在 37 摄氏度的热珠浴中解冻两个冷冻瓶，直到内容物开始融化。部分解冻后，将小瓶转移到细胞培养罩中。然后加入一毫升温热的T细胞培养基，快速解冻细胞。将内容物转移到 50 毫升管中，并用额外的 1 毫升 T 细胞培养基冲洗冷冻瓶以收集所有细胞。用 15 毫升的流动染色溶液加满悬浮液并离心。将沉淀重悬于五毫升流动染色溶液中并再次离心，然后在移出上清液后将细胞沉淀重悬于一毫升温热的T细胞培养基中。加入 9 毫升温热的 T 细胞培养基，使最终体积为 10 毫升。将悬浮液转移到标记为重解冻 T 细胞的培养皿中并孵育。在第八天，将MODC板以300G离心五分钟。移出上清液后，向每个孔中加入200微升流动染色溶液并孵育。然后上下移液以去除附着的细胞和细胞悬液到新的 96 孔 V 型底板上，然后再次离心。吸出上清液后，将 50 微升 FC 受体结合抑制剂抗体移液到每个孔中以阻断非特异性结合。将板在室温下孵育 30 分钟后，将 50 微升制备的验证面板抗体混合物加入每个孔中。将 50 微升补偿珠与 50 微升每种稀释抗体混合在 1.5 毫升管中并孵育。将板以300G离心五分钟。将沉淀重悬于 200 微升流动染色溶液中以洗涤细胞。最终洗涤和离心后，将细胞重悬于 110 微升流式染色溶液中进行流式细胞术分析。 对于致耐受性MODC，用耐受组合混合物代替抗体混合物。第九天，将重新解冻的T细胞培养皿转移到50毫升管中，并在管中加满流动染色溶液。使用含有未染色 T 细胞的第二个试管进行触发分析。以 250 G 旋转试管五分钟。除去上清液后，将细胞重悬于温热的细胞培养基中。计数 T 细胞并确保获得至少 400 万个细胞。将MODC板以300G离心五分钟。吸出上清液后，向每个孔中加入 200 微升 T 细胞。添加未染色的 T 细胞用于三角分析板。向除阴性对照孔外的所有组中加入每毫升25微升抗CD3 / CD28抗体混合物，以刺激T细胞并孵育至第12天。接下来，将所有细胞悬液从 96 孔培养板转移到带有流动染色溶液的 V 底板中。在 200 微升流动染色溶液中洗涤细胞两次。留出一些单元格用于补偿控制。第二次洗涤后，离心板。然后向每个孔中加入50微升稀释的FC受体结合抑制剂抗体并孵育。孵育完成后，将 50 微升制备的 trig panel 抗体混合物加入每个孔中。对于补偿对照，将 50 微升未染色的补偿细胞与每个单一染色抗体的 50 微升混合。将板和补偿对照在4摄氏度下孵育一小时，然后在离心前用流动染色溶液洗涤。现在在冷孵育之前，用在HBSS中以每孔200微升稀释的活/死近红外染料对细胞进行染色。在用 Fox P3 和流式细胞术分析染色之前洗涤和离心板。在第一天，未分化的单核细胞主要是 HLA-DR-负，CD14 减值很小，而第 7 天的分化单核细胞显示大多数细胞为 HLA-DR 加 CD14 减、CD1c-加、CD141 加。雷帕霉素联合和不联合脂多糖治疗，显着减少了 DC-SIGN 加 CD1c 加人群，并抑制了单独使用 LPS 治疗观察到的 CD86 和 CD40 标志物的上调。当MDC与T细胞共培养时，FOX P3加T调节细胞群增加。但4个MODC治疗组之间无显著差异。与 Rapa 处理的 MDOC 共培养后，CD4 加和 CD8 加 T 细胞群的 T 细胞增殖均减少。白细胞介素 10 处理的样品在 24 小时内显着增加了白细胞介素 10 的产生。Dex 处理的 MDOC 显着增加了白细胞介素 10 的产生，但仅在休息 72 小时后。地塞米松预处理可减少 LPS 治疗 24 小时时的平均 TNF α 生成。在 72 小时时，在 Dex 加 LPS 和 Rapa 治疗组中观察到 PDL1 加 MDOC 显着增加。在 24 小时和 72 小时时，所有免疫调节剂治疗组均观察到 CD86 表达的抑制。免疫调节剂处理的 MDOC 不会增加 CD4 加 T 细胞增殖。