一种简单高效的人CD14⁺单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

我们致力于研究哪些免疫调节治疗能够使已分化的单核细胞来源树突状细胞转化为耐受性树突状细胞，这对于自身免疫病和移植研究具有重要价值。随着制造技术的进步，自体疗法正变得越来越可行，而耐受性树突状细胞在临床前研究中已显示出良好的应用前景，其能够诱导抗原特异性免疫耐受。最常用的技术是流式细胞术，该方法为分析耐受性细胞提供了一种快速且易于实施的途径。然而，生成在体内具有持久功能的耐受性树突状细胞仍具挑战性，这也是目前尚无任何经临床批准的用于诱导耐受的树突状细胞疗法的原因。我们通过大规模筛选研究，已鉴定出若干新型免疫调节化合物组合，这些组合可显著改善耐受性树突状细胞的功能特性。此外，我们还设计了具有耐受诱导功能的纳米颗粒制剂。

[讲师] 首先，将含有富集人单核细胞和T细胞的15毫升离心管放入离心机中。离心完成后，使用移液器吸除管中的上清液。向单核细胞沉淀中加入1毫升MODC培养基，向含有T细胞的管中加入1毫升T细胞培养基，并充分混匀后再进行细胞计数。接着，向单核细胞悬液中加入9毫升预热的MODC培养基，使最终体积达到10毫升。然后分别用移液器加入100微升GM-CSF和IL-4储备液。将悬液转移至标记为MODC的培养皿中，并进行孵育。接下来，向T细胞悬液中加入1毫升T细胞冻存液。将混合液分装至两个2毫升冻存管中。将密封的冻存管放入冷冻室中，未使用的孔位用配平管填充。第4天时，向单核细胞管中加入5毫升新鲜MODC培养基。然后分别用移液器加入100微升GM-CSF和IL-4储备液，并继续孵育至第7天。第7天时，将已分化的单核细胞来源的树突状细胞（即MDOCs）转移至50毫升离心管中，并按前述方法离心。向细胞沉淀中加入1毫升预热的MODC培养基，反复吹打混匀。使用血细胞计数板进行细胞计数。用含GM-CSF和IL4的预热MODC培养基稀释悬液，直至达到所需细胞浓度。将含30,000个细胞的100微升悬液分装至平底96孔组织培养板的每孔中。向指定孔中加入1微升免疫调节药物，并进行孵育。次日，以300 ×g离心MODC板5分钟。轻轻去除上清液后，沿板壁轻轻加入200微升预热的HBSS，再次离心。再次吸除上清液后，向每孔加入含GM-CSF和IL4的100微升预热MODC培养基。若使用免疫刺激，则向指定孔中加入1微升100倍浓缩的脂多糖（LPS）储备液，并进行孵育。第8天时，在37摄氏度的热珠浴中解冻两支冻存管，直至内容物开始融化。部分解冻后，将冻存管转移至细胞培养超净台中。然后加入1毫升预热的T细胞培养基以快速解冻细胞。将内容物转移至50毫升离心管中，并用额外1毫升T细胞培养基冲洗冻存管，以回收全部细胞。用流式染色液补至15毫升后离心。将沉淀重悬于5毫升流式染色液中，再次离心，然后在吸除上清液后，用移液器将细胞沉淀重悬于1毫升预热的T细胞培养基中。加入9毫升预热的T细胞培养基，使最终体积为10毫升。将悬液转移至标记为“复苏T细胞”的培养皿中，并进行孵育。第8天时，以300 ×g离心MODC板5分钟。吸除上清液后，向每孔加入200微升流式染色液并孵育。然后反复吹打以去除贴壁细胞，并将细胞悬液转移至新的96孔V型底板，再次离心。在吸除上清液后，向每孔加入50微升FC受体结合抑制抗体，以阻断非特异性结合。室温孵育30分钟后，向每孔加入50微升预先配制的验证抗体混合液。在1.5毫升离心管中，将50微升补偿微珠与50微升每种稀释后的抗体混合，并进行孵育。以300 ×g离心板5分钟。用200微升流式染色液重悬沉淀以洗涤细胞。最终洗涤和离心后，将细胞重悬于110微升流式染色液中，用于流式细胞术分析。对于耐受性MODCs，使用耐受性抗体组合替代验证抗体组合。第9天时，将复苏T细胞的培养皿转移至50毫升离心管中，并用流式染色液补足体积。使用另一管未染色T细胞作为三联分析（trig analysis）对照。以250 ×g离心5分钟。去除上清液后，将细胞重悬于预热的细胞培养基中。对T细胞进行计数，并确保获得至少400万个细胞。以300 ×g离心MODC板5分钟。吸除上清液后，向每孔加入200微升T细胞悬液。为三联分析板加入未染色T细胞。除阴性对照孔外，向所有组别每毫升加入25微升抗CD3/CD28抗体混合液，以刺激T细胞，并继续孵育至第12天。接着，将96孔培养板中的所有细胞悬液转移至含流式染色液的V型底板中。用200微升流式染色液洗涤细胞两次。保留部分细胞用于补偿对照。第二次洗涤后，离心板。然后向每孔加入50微升稀释的FC受体结合抑制抗体，并进行孵育。孵育完成后，向每孔加入50微升预先配制的三联分析抗体混合液。对于补偿对照，将50微升未染色的补偿细胞与50微升每种单染抗体混合。将板和补偿对照在4摄氏度孵育1小时，然后用流式染色液洗涤并离心。随后，在冷孵育前，用HBSS稀释的Live/Dead近红外染料对细胞染色，每孔200微升。染色前先洗涤并离心板，再进行Fox P3染色和流式细胞术分析。第1天时，未分化的单核细胞主要为HLA-DR阴性，伴有少量CD14阴性细胞；而第7天分化的单核细胞则多数表现为HLA-DR阳性、CD14阴性、CD1c阳性、CD141阳性。使用雷帕霉素（rapamycin）处理，无论是否联合脂多糖（LPS），均显著减少DC-SIGN阳性CD1c阳性细胞群，并抑制单独LPS处理所诱导的CD86和CD40标志物的上调。当MDCs与T细胞共培养时，FOXP3阳性调节性T细胞群增加；但在四个MODC处理组之间未观察到显著差异。与经雷帕霉素处理的MDOCs共培养后，CD4阳性及CD8阳性T细胞群的增殖均减少。经白细胞介素-10（Interleukin-10）处理的样本在24小时时显著增加IL-10的产生。经地塞米松（Dex）处理的MDOCs显著增加IL-10的产生，但仅在静置72小时后观察到。地塞米松预处理可降低LPS处理24小时后的平均TNF-α生成量。在Dex联合LPS组及雷帕霉素处理组中，72小时时观察到PDL1阳性MDOCs显著增加。所有经免疫调节剂处理的组别在24小时和72小时均表现出CD86表达的抑制。经免疫调节剂处理的MDOCs未引起CD4阳性T细胞增殖的增加。