使用免疫复合物对树突状细胞活化进行基于流式细胞术的分析

从化学固定的肿瘤细胞悬液开始。

添加最佳浓度的肿瘤结合免疫球蛋白 G，与肿瘤细胞表面抗原结合，形成免疫复合物或 IC。

将IC转移到含有粘附树突状细胞的培养板中。孵化。

树突状细胞识别IC，将其内化，并将其加工成肽片段。

这些片段被加载到主要组织相容性复合物II类或MHC-II分子上，并与共刺激分子CD86一起呈现在细胞表面。

移除介质。加入细胞解离缓冲液并用力移液以分离细胞。

细胞转移到试管中。

细胞离心并重悬于封闭溶液中以阻断非特异性相互作用。

与靶向 MHC-II 和 CD86 的荧光团标记抗体混合物叠加。

加入DNA结合染料并短暂孵育以染色死细胞核。

使用流式细胞术，鉴定共表达MHC-II和CD86的活细胞，确认IC介导的树突状细胞活化。

首先，在室温下将细胞固定在1.8%缓冲的多聚甲醛中10分钟。将细胞悬液接种在U形96孔板的每个孔中。接下来，在每个孔中加入不同稀释度的肿瘤结合抗体。此后，将细胞在冰上孵育 15 至 20 分钟。

孵育后，用150微升磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，然后在4摄氏度下以400倍g 离心5至10分钟。离心后，排出上清液并洗涤细胞两次。将细胞溶解在含有荧光团偶联二抗的 100 微升 FACS 缓冲液中。接下来，将板在冰上孵育 15 至 20 分钟。

15 至 20 分钟后，加入 200 微升 FACS 缓冲液洗涤细胞。将板以 400 倍 g 离心 5 至 10 分钟。倒出上清液。进行流式细胞术以分析肿瘤结合，并确定包被细胞所需的免疫球蛋白G的最小浓度。

一旦细胞被最小免疫球蛋白G浓度包被，以1：5的比例将CFSE标记的肿瘤免疫复合物添加到单核细胞来源的树突状细胞中。然后，将混合物在完全培养基中孵育过夜 12 至 16 小时。对单核细胞来源的树突状细胞活化进行FACS分析。