一种快速的银染色协议, 能够使用非变性聚丙烯酰胺凝胶对 SSR 标记进行简单而有效的检测

该方案的总体目标是引入一种优化的银染方法，用于快速、简单和低成本地检测非变性聚丙烯酰胺凝胶中的 SSR 标志物。SSR 标记的快速基因分型有助于回答遗传研究和应用领域中的关键问题，例如分子育种计划中的遗传多样性分析和标记辅助选择。该技术的主要优点是易于实施、花费的时间更少、使用的化学试剂比其他 SSR 标志物检测方案少。

这种方法避免了传统方案中的固定、停止和几个洗涤步骤。并且只需要浸渍和显影两个主要步骤。使用该协议可以生成清晰的图像，因为没有背景噪声，可以明确检测 SSR 条带模式。

使用这项技术每天可以筛选大约 800 个 DNA 样本，它已成功用于烟草和开花大白菜的研究。根据文本方案制备 PCR 产物和凝胶溶液后，使用自来水中的洗涤剂清洗一组玻璃板和垫片，然后用蒸馏水完全冲洗。将板放在板晾架中风干。

将 1 毫升 Bind-硅烷溶液分散到矩形玻璃板的内表面，并干燥 5 分钟。然后用棉签将 1 毫升 Repel-silane 分散到有缺口的玻璃板的内表面，用纸巾擦去多余的溶液，然后让板风干 5 分钟。用垫片组装玻璃板，缺口板在顶部。

并使用铸造夹具夹紧组件的两侧。接下来，将适量的 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入板组烧杯中。加入 20 微升 TEMED 和 200 微升新鲜的 20%APS 并轻轻混合。

立即小心地将溶液沿着缺口板的边缘倒入组装好的玻璃板中，几乎填满空间到顶部。并插入梳子。然后在梳子上加入少量凝胶溶液，让凝胶在室温下凝固 30 分钟。

当凝胶完全聚合后，取下铸夹，将板组放置在电泳槽单元中，使缺口板朝向上缓冲储液槽。使用大夹子将板组连接到树脂槽单元。将 1 升 0.5 X TBE 缓冲液倒入上腔室和下腔室中。

然后取下梳子，使用装满缓冲液的移液器或注射器彻底冲洗所有孔。要电泳聚丙烯酰胺凝胶，请将约 1 μL PCR 产物加载到每个孔中。此外，在两端加载 DNA 分子量标准。

然后将安全盖固定在上缓冲室上。将引线连接到电源，将颜色编码的红色与红色、黑色与黑色匹配。在 110 伏特的恒定电压下运行凝胶，直到染料达到定义位置。

通常，大约需要 70 分钟。电泳后，打开阀门，将缓冲液从上腔室排入一个大烧杯中。拆下侧夹并从设备中取出板。

然后用刮刀小心地将一侧的缺口玻璃板分开，并确保凝胶仍然附着在涂有 Bind-silane 的另一块玻璃板上。接下来，通过将 1.5 克硝酸银溶解在一升蒸馏水中来制备一升新鲜的浸渍溶液。然后将 10 克氢氧化钠溶解在 900 毫升蒸馏水中，制备 1 升新鲜显影液。

加入 1 毫升 37% 甲醛，并使用蒸馏水调整至最终体积为 1 升。用充足的蒸馏水，仔细冲洗凝胶和玻璃板以去除电泳缓冲液。然后将凝胶朝上的板放入塑料托盘中，并将凝胶浸入 1 升浸渍溶液中。

在摇床上以 60 RPM 的速度轻轻摇动托盘 3 到 4 分钟。将板从浸渍溶液中转移到另一个托盘中。然后用充足的蒸馏水冲洗板和凝胶表面残留的浸渍溶液两次，每次 3 到 5 秒。

浸渍后的凝胶洗涤步骤至关重要。洗涤不足导致浸渍液去除不完全。并导致深色背景。

将凝胶朝上的位置放入另一个托盘中。将板浸入 1 升显影液中，然后以 50 RPM 的速度轻轻摇动托盘约三分钟。监测 DNA 片段的外观，并在观察到 DNA 片段信号与背景噪音的最高比率时停止显影。

适当的开发时间是另一个关键步骤。过度显影会导致 DNA 片段图像的深棕色背景和低对比度图像。用充足的蒸馏水冲洗板和凝胶两次，然后用纸巾擦干凝胶板。

然后使用扫描仪和适当的软件以 300 DPI 扫描凝胶，并调整亮度和对比度，以获得 DNA 条带的清晰可视化。最后，根据图像中的 DNA 片段大小对 SSR 标记的条带模式进行评分。这里介绍的 PCR 扩增子是在开花的大白菜和烟草中使用相应的 SSR 引物对产生的。

电泳后，使用本视频中演示的银染方案对聚丙烯酰胺凝胶进行染色。它明确地检测到了 SSR 标记的条带模式。为了比较不同银染方案的检测效率，使用 PAGE 分离 SSR 标志物的 PCR 产物，并使用本视频中演示的五种已发表的银染方案和第六种方法进行可视化。

此处演示的方案具有最低的背景噪声和最高的 DNA 片段对比度，因此可以产生最高的图片清晰度。在测试的 6 个方案中，此处演示的方法花费的时间最少，需要的化学试剂和工艺步骤最少。最后，该图显示了在非变性聚丙烯酰胺凝胶上连续稀释 50 至 2000 bp DNA 标记物测量的方案灵敏度，从泳道 1 中每个条带 10 ng 到泳道 11 中每个 DNA 条带 9.8 pg

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 7 分钟内完成。在尝试此程序时，请务必记住防止浸渍和显影溶液的交叉污染。开发后，这项技术为研究人员快速对 SSR 标记物进行基因分型铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何使用银染简单有效地检测非变性聚丙烯酰胺凝胶中的 SSR 标志物有了很好的了解。不要忘记，使用化学试剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终佩戴手套等预防措施。