生成与分离具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞

本实验方案的总体目标是提供一种简单的方法，用于生成并分离具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞。该方法可解答非整倍性研究领域中的一些关键问题，例如免疫系统与非整倍体细胞之间的相互作用。该技术的主要优势在于能够获得仅携带复杂核型的细胞群体。

开始同步RPE-1 hTERT细胞时，使用 freshly thawed 的细胞，并将其接种至10厘米的组织培养皿中，加入八毫升标准生长培养基。接着，使用血细胞计数板测定细胞数量。然后，将细胞过夜培养。

第二天，将标准生长培养基更换为含有5毫摩尔胸腺嘧啶的培养基。在37摄氏度下孵育24小时，使细胞在G1/S期边界同步化。孵育24小时后，用PBS洗涤细胞三次。

首先，用10毫升PBS洗涤细胞，然后向洗涤后的细胞中加入标准培养基，在37摄氏度下孵育6小时。接着，加入含有500纳摩尔Mps1抑制剂reversine的培养基。

在 37 摄氏度下孵育 12 小时。次日，用 PBS 洗涤细胞三次。然后加入标准生长培养基，并将培养板放回孵箱中。

首次异常有丝分裂后约 72 小时，用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。随后加入含有 330 纳摩尔诺考达唑的培养基。在 37 摄氏度下孵育 12 小时。

第二天，吸除含有诺考达唑的培养基。然后向培养皿中加入三毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻敲培养皿边缘以振落有丝分裂期细胞。每次轻敲后旋转培养皿，以确保有丝分裂期细胞被均匀去除。

初次震荡去除液体后，吸除残留在盖子和培养板边缘的液体。然后在显微镜下以10倍物镜检查培养板。随后用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。

接下来，加入含有 330 纳摩尔诺考达唑的培养基。在 37 摄氏度下孵育 12 小时。最后一次振荡收集后，加入 10 毫升标准生长培养基。

在进行检测前，将细胞在 37 摄氏度下孵育 12 至 24 小时。保留在培养板上的细胞被称为具有复杂核型的停滞细胞（arrested with complex karyotype）或 ArCK 细胞。本方案描述了一种分离 ArCK 细胞的简单方法，并分析了 ArCK 细胞的若干特有特征，以确认其成功分离。

免疫印迹分析显示，ArCK细胞中细胞周期抑制因子p53、p21和p16的水平升高，而整倍体和非整倍体增殖细胞中则无此现象。此外，ArCK细胞衰老相关β-半乳糖苷酶呈阳性，染色呈蓝绿色，而整倍体对照细胞则无此染色。染色体分型图谱显示，ArCK细胞为非整倍体，其特征是存在多个随机的染色体增加和染色体丢失。

分割图显示了从染色体一到X染色体的单细胞拷贝数，相对于整倍体参考的log2尺度。在进行此操作时，重要的是确保在每次振脱过程中完全去除所有有丝分裂细胞。完成此操作后，可进行其他方法，如细胞因子检测。

这些检测将有助于回答其他问题，例如ArCK细胞与免疫系统细胞相互作用的能力。请注意，诺考达唑具有危险性。使用该试剂时应穿戴适当 的个人防护装备。

一旦掌握，该技术可用于在体外高效分离 ArCK 细胞。若操作得当，整个流程可在七天内完成。