Name: 复杂核型细胞周期捕获细胞的生成与分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 学习生成并分离细胞周期捕获的复杂核型细胞的方法。该技术使用RPE-1 hTERT细胞同步化和shake-off技术，可在七天内获得ArCK细胞，用于研究非整倍体与免疫系统的相互作用。

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本工作部分得到了美国国家癌症研究所科赫研究所支持（核心）基金（P30-CA 14051）、美国国立卫生研究院基金（CA206157-22 和 GM118066）以及安杰丽卡·阿蒙（Angelika Amon）获得的柯特·马布尔癌症研究基金的资助。安杰丽卡·阿蒙（Angelika Amon）同时也是霍华德·休斯医学研究所和格伦生物医学研究基金会的研究员。S. S. 获得了美国意大利癌症基金会（AICF）、玛丽·居里行动计划和意大利癌症研究协会（AIRC）癌症研究奖学金以及科赫研究所五年期癌症研究奖学金的资助。E. M. 获得了霍华德·休斯医学研究所奖学金的资助。

培养条件
RPE-1 hTERT 细胞系在添加了10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/ml 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（材料表）中培养。细胞在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育。以下所述方案采用10 cm培养皿开发，所有报告的技术细节均针对此类培养皿。若使用不同规格的培养皿，需相应地进行放大或缩小。
1. RPE-1 细胞的同步化
<ol>
	<li>所有实验均应使用解冻后未超过15代的细胞。第1天，将约2.5 - 5.0 × 105个RPE-1 hTERT细胞解冻并接种至10 cm细胞培养皿中。加入8 mL标准生长培养基，过夜培养。使用标准细胞计数仪（如血细胞计数板）测定细胞数量。 
	注意：细胞密度指的是RPE-1细胞的生长条件。不同细胞系的生长条件可能有所不同，应相应调整。</li>
	<li>第2天，通过吸除常规生长培养基，并加入含5 mM胸腺嘧啶的8 mL培养基，使细胞在G1/S期边界同步化。 
	注意：不同细胞系所需的胸腺嘧啶浓度和处理时间可能不同。建议先进行预实验，以确定待测细胞系的最佳条件。</li>
	<li>第3天，在添加胸腺嘧啶培养基24小时后（步骤1.2），吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞三次，以解除胸腺嘧啶阻滞。加入8 mL常规生长培养基，将培养皿放回培养箱继续培养。</li>
</ol>
2. 通过干扰有丝分裂激酶Mps1的活性产生非整倍体细胞
<ol>
	<li>第3天，在胸苷阻断释放后6小时（步骤1.3；此时约为细胞进入有丝分裂前3–6小时），吸除培养基，用1× PBS洗涤一次，更换为含有500 nM reversine（Mps1抑制剂）的新鲜培养基。 
	注意：RPE-1细胞在胸腺嘧啶洗脱后9 - 12小时进入有丝分裂10,11然而，不同细胞系的细胞周期动力学存在差异。因此，通过已建立的方法在预实验中进行细胞周期分析，以确定这些动力学参数至关重要。例如，通过测量DNA含量 通过 FACS 分析）。此外，Mps1 抑制剂的最佳工作浓度可能因细胞系而异。此前使用 RPE1 细胞的实验已成功采用 500 nM 工作浓度的 reversine10,11,12建议进行预实验以确定待测细胞系的最佳浓度。</li>
	<li>第4天，在使用reversine处理12小时后（约在细胞进入有丝分裂后6小时），吸除含reversine的培养基，用1×PBS洗涤细胞3次。向培养板中加入8 mL常规生长培养基，将细胞放回培养箱中继续培养。</li>
</ol>
3. 去除非整倍体循环细胞并富集ArCK细胞群
<ol>
	<li>在第6天，即细胞进入第一次有丝分裂后约72小时（步骤2.2；相当于撤除reversine后约66小时，对应约2-3个细胞周期），吸除培养基，用1×PBS洗涤一次，然后更换为含有300 nM nocodazole的培养基。 
	注意：近期研究表明，携带非整倍体核型的RPE-1细胞基因组不稳定，在首次异常有丝分裂后约2-3个细胞周期内会停止增殖10。然而，不同细胞系的这一动力学过程可能存在差异。因此，必须通过预实验确定清除非整倍体循环细胞的合适时间。</li>
	<li>在第7天，即nocodazole处理12小时后，吸除培养基，并向培养板中加入3 mL 1×PBS。通过轻敲培养板边缘使有丝分裂期细胞脱落。每次敲击之间旋转培养板，以确保有丝分裂期细胞被均匀去除。</li>
	<li>为确保完全去除有丝分裂期细胞，建议重复振荡脱落过程多次（推荐3-5次），每次之间吸除并重新加入3 mL 1×PBS。</li>
	<li>振荡脱落后，轻轻吸除附着在盖子或培养板边缘的液体。在10倍显微镜下快速检查培养板，确认几乎无有丝分裂期细胞残留。若在10倍物镜下观察到超过五个有丝分裂期细胞，则需再进行一轮振荡脱落。 
	注意：有丝分裂期细胞呈圆形，振荡后可能部分脱离。在细胞接受下一轮nocodazole处理前，确保完全去除有丝分裂期细胞至关重要。若未彻底清除，可能导致有丝分裂细胞死亡和/或产生四倍体细胞。</li>
	<li>最终振荡脱落后，用5 mL 1×PBS轻轻洗涤细胞一次。向培养板中加入8 mL含330 nM nocodazole的培养基，继续孵育12小时。</li>
	<li>每12小时重复一次nocodazole处理/振荡脱落（步骤3.1–3.5），直至孵育后显微镜下未见有丝分裂期细胞。通常建议进行4–5轮处理/脱落。 
	注意：此处提供的信息基于RPE-1细胞。不同细胞系所需的处理/脱落轮次可能有所不同。为避免细胞长时间且不必要的nocodazole暴露，必须通过预实验仔细确定高效且彻底清除非整倍体循环细胞所需的处理轮次。</li>
	<li>完成4–5轮nocodazole处理/振荡脱落（步骤3.1–3.6）后，加入10 mL常规生长培养基并继续孵育。在进行后续操作或检测前，让细胞静置恢复12–24小时。 
	注意：最终振荡脱落后，培养板上残留的细胞处于细胞周期阻滞状态，且如近期研究所示10，具有复杂的核型。这类细胞被称为ArCK（具有复杂核型的阻滞细胞）。建议在分离后一周内对ArCK细胞群体进行相关检测。</li>
	<li>可选：为评估具有复杂核型的阻滞细胞比例，可使用标准细胞计数仪收集并计数每轮振荡脱落所得的细胞。</li>
</ol>
<img alt="非整倍体细胞处理示意图，包含秋水仙胺处理、有丝分裂阻滞及显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：生成并分离具有复杂核型（ArCK）的非整倍体细胞的方法总览示意图及代表性图像。 (A) ArCK细胞生成与分离流程示意图。 (B) RPE-1 hTERT细胞在处理各阶段的代表性图像。最后一幅图（红色边框）代表分离得到的ArCK细胞。比例尺：100 µm。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. ArCK 细胞群的表征
<ol>
	<li>通过执行以下实验确认ArCK细胞群体分离成功。
	<ol>
		<li>使用 commercially available kit（参见材料表）进行β-半乳糖苷酶染色（衰老标志物）检测。</li>
		<li>利用 commercially available kit（参见材料表）检测促炎性细胞因子（如CCL2）的分泌水平。</li>
		<li>通过Western Blot确认细胞周期抑制因子p53、p21、p16的表达水平升高。 
		注意：为正确设置对照，ArCK细胞群体应与整倍体和非整倍体增殖细胞同时比较。前者指低代次、野生型RPE-1 hTERT细胞，处于指数生长期；后者可通过在RPE-1 hTERT细胞中诱导染色体错误分离，并在首次异常有丝分裂后72小时收集细胞获得。具体操作请参照上述第1.1步开始的实验流程，并在第一次诺考达唑处理前（第3.1步）收集细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行单细胞测序以分析 arrested 细胞的核型。 
	注意：单细胞测序是一种成熟的技术，可用于在单细胞水平上检测细胞群体中的染色体及亚染色体水平的改变13。有关单细胞测序操作的详细步骤可参考其他文献10。</li>
</ol>

<ol><li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li>
<li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer%3A+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li>
<li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li>
<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li>
<li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress%2C+senescence+and+cell+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li>
<li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668(2015).</li>
<li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754(2016).</li>
<li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).</li>
<li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li>
<li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li>
<li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种用于生成并富集具有复杂核型的停滞细胞（ArCK）的新方法，可实现对发生多条染色体获得或丢失且停止分裂的细胞进行研究。该方法的设计旨在快速、可靠地分离出ArCK细胞。
该实验中最关键的步骤是严格控制药物处理的时间进程，尤其是去除非整倍体增殖细胞的时机。为了获得最佳结果，秋水仙素处理及振摇去除细胞的时间尤为关键，需确保在细胞仍处于变圆且处于有丝分裂阶段时将其从培养板中去除，从而避免有丝分裂细胞死亡或滑入G1期，防止产生四倍体细胞群体。不建议振摇去除细胞的时间偏离推荐的12小时秋水仙素孵育时间超过两小时。
关于ArCK细胞的未来研究有望促进对复杂核型如何影响细胞生理学的深入理解。特别是，最近一项研究表明，免疫系统的细胞能够与ArCK细胞相互作用并触发其免疫清除10。本文所述方法为ArCK细胞的进一步表征提供了良好的起点，包括阐明非转化细胞中免疫清除背后的分子机制，以及研究癌基因转化如何可能绕过这种监视机制，这是该领域的一个关键科学问题14,15。

染色体分离过程中的错误会导致非整倍性，即染色体数目不是单倍体染色体组的整数倍的一种状态1,2,3,4。非整倍体核型会引发复制应激，从而导致进一步的基因组不稳定性5,6,7,8,9,10，增加核型复杂性，并最终导致部分细胞发生细胞周期阻滞10。本文所介绍方法的目的是生成并分离出此类细胞亚群，使其与持续增殖的细胞区分开来。通过使用低成本的组织培养技术，本方案有助于分离并鉴定具有复杂核型的细胞周期阻滞的非整倍体细胞。这类细胞被称为 ArCK（具有复杂核型的阻滞细胞），而与其对应的正常整倍体增殖细胞则作为对照。
本方案是首个为此目的建立的实验方法，可用于分离并进一步研究ArCK细胞系，包括但不限于其诱导的衰老特性及衰老相关分泌表型（SASP）、促炎特征以及与免疫细胞相互作用的能力。本文所述方法已在非转化、永生化的人源细胞中开发完成，但尚未在癌细胞系中进行测试。某些转化细胞可能由于一条或多条信号通路被抑制，而对细胞周期阻滞不敏感；因此，应在其他细胞系中进一步验证该方法的有效性。

<table><tbody><tr><td>DMEM（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良型 Eagle 培养基）&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶核苷（Thymidine）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑（Nocodazole）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>抗-p53 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>抗-p21 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>抗-p16 抗体</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>衰老相关 β-半乳糖苷酶染色试剂盒</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler 人细胞因子阵列试剂盒&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

生成与分离具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

染色体错误分离会导致非整倍性，即细胞含有不平衡的染色体数目。大量证据强烈表明，非整倍性会引发基因组不稳定性，最终产生具有复杂核型并停止增殖的细胞。分离和表征具有复杂核型的细胞，对于研究染色体数目失衡对细胞生理功能的影响至关重要。迄今为止，尚未建立可稳定分离此类非整倍体细胞的方法。本文提供了一种利用常规且低成本的组织培养技术来富集和分析具有复杂核型的非整倍体细胞的实验方案。该方案可用于分析具有复杂核型的非整倍体细胞的多种特征，包括其诱导的衰老相关分泌表型、促炎特性以及与免疫细胞相互作用的能力。由于癌细胞常伴有染色体数目的失衡，因此解析非整倍性如何影响正常细胞的生理功能至关重要，最终目标是揭示其在肿瘤发生中的促进和抑制双重作用。

该方法利用一种 体外 用于分离增殖停滞且具有复杂核型的非整倍体细胞的组织培养系统。该细胞群体被称为ArCK（增殖停滞伴复杂核型）细胞。 图1A 图示为实验方案。将野生型周期性RPE-1 hTERT细胞用胸苷同步于G1/S期交界处，并用Mps1抑制剂处理以诱导染色体错误分离。在诱导染色体错误分离72小时后，向细胞中加入纺锤体毒物诺考达唑。诺考达唑处理12小时后，仍具有增殖能力的非整倍体细胞进入有丝分裂，并因微管聚合受阻而停滞于该细胞周期阶段。通过轻柔振摇即可去除这些停滞的细胞。重复振摇3至5次以确保完全清除周期性细胞。 图1B 显示了RPE-1细胞在处理各阶段的代表性图像。
与整倍体和非整倍体增殖细胞相比，ArCK细胞表现出更高水平的细胞周期抑制因子，如p53、p21和p16，如图2A所示。此外，图2B显示，与整倍体对照细胞相比，ArCK细胞呈现β-半乳糖苷酶染色阳性，这是细胞衰老的一个公认标志。
<img alt="使用Western blot检测非整倍体细胞的蛋白表达；β-半乳糖苷酶染色用于细胞核型分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：利用ArCK细胞获得的代表性结果。 (A) 通过Western blot检测整倍体细胞、非整倍体循环细胞和ArCK细胞中细胞周期抑制因子的表达水平。采用Western blot分析检测p53、p21和p16的表达水平，以肌动蛋白（Actin）作为上样对照。 (B) β-半乳糖苷酶染色检测ArCK细胞的衰老水平。检测整倍体细胞和ArCK细胞中与衰老相关的β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性。比例尺为100 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
这种细胞周期阻滞是具有复杂核型的非整倍体细胞的一个显著特征，如图3中单细胞测序的代表性核型分析所示，ArCK细胞表现出多个随机的染色体获得和丢失。该发现与先前的报道完全一致10。
<img alt="染色体拷贝数变异图；相对log2 CNVs；遗传数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：ArCK细胞的代表性单细胞测序结果。 分段图显示了六个代表性ArCK细胞的核型。分段图以对数2尺度展示了从染色体1到X染色体相对于整倍体参考样本的拷贝数（野生型RPE-1为女性来源的二倍体细胞系）。染色体拷贝数增加以红色标出，拷贝数减少以绿色标出。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

非整倍性会导致基因组不稳定，最终产生具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞。本文提供了一种简单便捷的方法，用于分离停止分裂的具有复杂核型的非整倍体细胞。

染色体错误分离会导致非整倍性，即细胞中染色体数目失衡的一种状态。大量证据强烈表明……

本实验方案的总体目标是提供一种简单的方法，用于生成并分离具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞。该方法可解答非整倍性研究领域中的一些关键问题，例如免疫系统与非整倍体细胞之间的相互作用。该技术的主要优势在于能够获得仅携带复杂核型的细胞群体。开始同步RPE-1 hTERT细胞时，使用 freshly thawed 的细胞，并将其接种至10厘米的组织培养皿中，加入八毫升标准生长培养基。接着，使用血细胞计数板测定细胞数量。然后，将细胞过夜培养。第二天，将标准生长培养基更换为含有5毫摩尔胸腺嘧啶的培养基。在37摄氏度下孵育24小时，使细胞在G1/S期边界同步化。孵育24小时后，用PBS洗涤细胞三次。首先，用10毫升PBS洗涤细胞，然后向洗涤后的细胞中加入标准培养基，在37摄氏度下孵育6小时。接着，加入含有500纳摩尔Mps1抑制剂reversine的培养基。在 37 摄氏度下孵育 12 小时。次日，用 PBS 洗涤细胞三次。然后加入标准生长培养基，并将培养板放回孵箱中。首次异常有丝分裂后约 72 小时，用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。随后加入含有 330 纳摩尔诺考达唑的培养基。在 37 摄氏度下孵育 12 小时。第二天，吸除含有诺考达唑的培养基。然后向培养皿中加入三毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻敲培养皿边缘以振落有丝分裂期细胞。每次轻敲后旋转培养皿，以确保有丝分裂期细胞被均匀去除。初次震荡去除液体后，吸除残留在盖子和培养板边缘的液体。然后在显微镜下以10倍物镜检查培养板。随后用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。接下来，加入含有 330 纳摩尔诺考达唑的培养基。在 37 摄氏度下孵育 12 小时。最后一次振荡收集后，加入 10 毫升标准生长培养基。在进行检测前，将细胞在 37 摄氏度下孵育 12 至 24 小时。保留在培养板上的细胞被称为具有复杂核型的停滞细胞（arrested with complex karyotype）或 ArCK 细胞。本方案描述了一种分离 ArCK 细胞的简单方法，并分析了 ArCK 细胞的若干特有特征，以确认其成功分离。免疫印迹分析显示，ArCK细胞中细胞周期抑制因子p53、p21和p16的水平升高，而整倍体和非整倍体增殖细胞中则无此现象。此外，ArCK细胞衰老相关β-半乳糖苷酶呈阳性，染色呈蓝绿色，而整倍体对照细胞则无此染色。染色体分型图谱显示，ArCK细胞为非整倍体，其特征是存在多个随机的染色体增加和染色体丢失。分割图显示了从染色体一到X染色体的单细胞拷贝数，相对于整倍体参考的log2尺度。在进行此操作时，重要的是确保在每次振脱过程中完全去除所有有丝分裂细胞。完成此操作后，可进行其他方法，如细胞因子检测。这些检测将有助于回答其他问题，例如ArCK细胞与免疫系统细胞相互作用的能力。请注意，诺考达唑具有危险性。使用该试剂时应穿戴适当 的个人防护装备。一旦掌握，该技术可用于在体外高效分离 ArCK 细胞。若操作得当，整个流程可在七天内完成。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

复杂核型细胞周期捕获细胞的生成与分离

核型分析是一种简单且实用的技术，广泛用于检测遗传变异。本文介绍了一种逐步操作的实验方案，用于制备人胚胎干细胞的染色体铺展样本，以监测在培养条件下维持的人胚胎干细胞的染色体状态。...

人类胚胎干细胞核型分析用染色体铺展制备

显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出具有增殖能力的骨骼肌细胞，以获取骨骼肌干细胞。这些细胞具有独特性，可通过克隆化培养获得骨骼肌干细胞系，用于体内移植。...

成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

通过本方案，利用流式细胞术可轻松测定细胞群体的细胞周期位置，或了解信号如何影响细胞增殖。我们报告了一种简单的实验方法，用于对细胞进行染色并定量分析其在细胞周期中的位置。...

哺乳动物细胞周期位置分析

通过联合使用BrdU对核酸进行代谢标记以及碘化丙啶对总基因组DNA染色，可实现对细胞周期各阶段进展及动力学的细微变化进行追踪。该方法无需对增殖细胞进行化学同步化处理，从而避免了非特异性DNA损伤的引入，进而防止对细胞周期进程造成影响。...

利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

染色体可从活细胞（如淋巴细胞或皮肤成纤维细胞）以及包括人类和小鼠在内的生物体中分离。这些染色体标本可进一步用于常规G显带及分子细胞遗传学实验，例如荧光原位杂交 原位...

从培养细胞中制备染色体

尽管增殖性多倍体细胞对于分析多倍体细胞的染色体不稳定性是必需的，但从非转化的人类细胞中构建此类细胞并不容易。本报告描述了从正常人成纤维细胞中建立无二倍体细胞群的增殖性四倍体细胞的相对简便的方法。...

从非转化人成纤维细胞建立增殖性四倍体细胞

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。...

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

本方案描述了使用离心淘析法将原代急性淋巴细胞白血病细胞按不同细胞周期时相进行分离的方法。...

通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。...

结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

本实验方案介绍了一种简便、便捷的方法，利用组蛋白2B-GFP BacMam...

活细胞成像观察有丝分裂过程中的染色体分离

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

学习生成并分离细胞周期捕获的复杂核型细胞的方法。该技术使用RPE-1 hTERT细胞同步化和shake-off技术，可在七天内获得ArCK细胞，用于研究非整倍体与免疫系统的相互作用。

生成与分离具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞

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