复杂核型细胞周期捕获细胞的生成与分离

该方案的总体目标是提供一种简单的方法来生成和分离具有复杂核型的细胞周期停滞细胞。这种方法可以为非整倍体研究领域的关键问题提供答案，例如免疫系统与非整倍体细胞的相互作用。这种技术的主要优点是它产生的细胞群仅包含复杂的核型。

为了开始 RPE-1 hTERT 细胞的同步，使用新鲜解冻的细胞，并使用 8 毫升标准生长培养基将它们分配到 10 厘米的组织培养皿中。接下来，使用血细胞计数器确定细胞数量。然后，将细胞孵育过夜。

第二天，用含有 5 毫摩尔胸苷的培养基替换标准生长培养基。在 37 摄氏度下孵育 24 小时，以同步 G1S 边界的细胞。24 小时后，用 PBS 洗涤细胞 3 次。

然后，向洗涤后的细胞中加入标准生长培养基，并在 37 摄氏度下孵育 6 小时。首先，用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。然后，加入含有 500 纳摩尔 Mps1 抑制剂反向的培养基。

在 12 摄氏度下孵育 37 小时。第二天，用 PBS 洗涤细胞 3 次。然后，添加标准生长培养基并将板放回培养箱中。

在第一次异常有丝分裂后约 72 小时，用 10 ml PBS 洗涤细胞。然后，加入含有 330 纳摩尔诺考达唑的培养基。在 12 摄氏度下孵育 37 小时。

第二天，吸出诺考达唑培养基。然后向培养皿中加入 3 毫升 PBS，轻敲板的侧面以抖落有丝分裂细胞。在每次敲击之间旋转板，以均匀去除有丝分裂细胞。

初次摇晃后，吸出粘附在板盖和边缘的任何液体。然后，在显微镜下以 10 倍放大倍率检查板。然后用 5 毫升 PBS 洗涤细胞。

接下来，加入含有 330 纳摩尔诺考达唑的培养基。在 12 摄氏度下孵育 37 小时。最后一次摇晃后，加入 10 毫升标准生长培养基。

在进行检测之前，将细胞在 37 摄氏度下孵育 12 至 24 小时。留在板上的细胞称为复杂核型或 ArCK 细胞停滞。该方案描述了一种分离 ArCK 细胞的简单方法，并分析了 ArCK 细胞特有的几个特征以确认它们的分离。

在免疫印迹分析中，ArCK 细胞显示细胞周期抑制剂 p53、p21 和 p16 水平升高，而整倍体和非整倍体循环细胞则没有。此外，ArCK 细胞衰老相关 β-半乳糖苷酶呈阳性，其染色呈蓝绿色，而整倍体对照细胞则不是。分割图显示 ArCK 细胞是非整倍体，其特征是多个随机染色体增加和染色体丢失。

分割图显示从染色体 1 到 X 的单个细胞的拷贝数，相对于整倍体参考对数 2 尺度。在尝试此过程时，请务必确保在每次摇晃期间去除所有有丝分裂细胞。执行此程序后，可以进行其他方法，例如细胞因子测定。

这些检测将有助于回答其他问题，例如 ArCK 细胞与免疫系统细胞相互作用的能力。不要忘记诺考达唑是危险的。使用该试剂时应穿戴适当的个人防护装备。

一旦掌握，该技术可用于在体外有效分离 ArCK 细胞。如果执行得当，此过程可以在 7 天内完成。