利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

以下实验方案的总体目标是测量细胞周期的动力学与进程。首先，用溴脱氧尿苷（BrdU）对细胞进行脉冲-追踪标记，BrdU 会取代胸腺嘧啶掺入细胞 DNA 中。随后，使用抗 BrdU 抗体对细胞进行免疫染色，并在染色后立即通过流式细胞术进行分析。

只有处于S期的细胞才会被标记，随着标记细胞在细胞周期中进展至G2期，在有丝分裂完成后其DNA含量会表现为4N，并可被检测到。随后，DNA含量减少至2N。因此，通过流式细胞术获得的荧光图谱分析可用于确定细胞周期进程的动力学特征。

与使用化学试剂进行细胞同步的其他方案相比，该技术的主要优势在于不会对细胞分裂机制产生意外的生理干扰。我们最初采用该方法是由于此前尝试利用化学同步法研究细胞周期进程速率时，得到了影响分析结果的意外数据。该方法有助于回答细胞生物学领域中的一些关键问题。

例如，不同类型细胞之间生长速率差异的基础是什么？首先通过脉冲-追踪标记法用BrdU标记细胞来开展本实验。每个时间点各取一个10厘米培养皿进行标记，并为以下每项对照各准备一个培养皿。

仅使用BRDU，仅使用PI，BRDU阴性，PI阴性，每块培养板接种五乘以十的五次方个MCF7细胞于含补充物的DMEM培养基中，培养24至48小时，使细胞恢复并贴壁。当细胞融合度达到60%时，更换为含有10微摩尔的全新DMEM培养基。

将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下用BrdU孵育一小时，以使BrdU掺入DNA中。确保留出一块未处理的培养板作为阴性对照或一小时后的零时间点。移除脉冲标记培养基，并用PBS对两到八小时时间点的细胞进行短暂漂洗。

加入新鲜的培养基，然后将其放回培养箱中。随后立即按照下一节所述方法收获零小时和一小时时间点的培养板。收获细胞时，吸除培养基，并用缓冲液清洗培养板。

用 PBS 清洗一次，然后用胰蛋白酶处理细胞，使其从培养板上脱落，并在 DMEM 中收集，于 390 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。随后，用 1 至 5 毫升冰预冷的 PBS 重悬细胞，在 390 × g 离心 5 分钟，离心后弃去上清液，将细胞重悬于 100 微升冰预冷的 PBS 中。

含1% FBS的冷PBS。FBS有助于防止细胞聚集。该操作步骤中最关键的环节之一是确保从收获的细胞中获得单细胞悬液。

为了确保事实准确。为此，可以逐滴将细胞直接加入乙醇中。接下来，为固定细胞，需使用移液器将细胞逐滴加入5 mL冰冻的固定液中。

将70%乙醇加入15毫升锥形管中。将细胞在冰上孵育30分钟，或在4摄氏度下过夜保存。此步骤是暂停收集不同时间点样本的理想节点，样本可在乙醇中保存数天，以便后续统一进行BRDU和碘化丙啶染色的其余实验步骤。

从四摄氏度取出细胞，以 390 ×g 离心五分钟。离心后吸除大部分固定液，保留约 50 微升。然后涡旋振荡。

在涡旋振荡的同时加入试剂以松解沉淀并使DNA变性。逐滴缓慢加入1 mL 2 N HCl-Triton X-100，然后将样品在室温下孵育30分钟。以390 × g离心5分钟使细胞沉淀，随后吸除并弃去上清液。

然后将细胞沉淀重悬于1毫升0.1摩尔的四硼酸钠溶液中。离心后，再次吸去并弃去上清液。随后将细胞沉淀重悬于75微升BRDU染色液中。

混合后于室温孵育45分钟，孵育期间避光。随后以相同方式离心收集细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1毫升含5 µg/mL碘化丙啶的PBS中。运行PI阳性样本时，通过流式细胞仪绘制前向散射光对侧向散射光的图谱，以确认细胞大小分布的正确性。

这两个参数均应以线性刻度绘制。同时查看FL3-H对FL2-W的散点图，以比较PI染色与荧光脉冲宽度。该图用于设定门控，以分离出被认为处于细胞周期正常分布模式的细胞亚群。

通常，这种分布模式表现为两个细胞簇，分别对应 PI 染色的二倍体（2N）和四倍体（4N）DNA 含量，代表细胞周期中的 G1 期和 G2 期。位于这两个簇之间的成串细胞代表正在进行 DNA 复制，即细胞周期 S 期的特征。创建一个散点图，以 Y 轴对数尺度显示 FL1-H 或 FITC 标记的门控细胞，X 轴以线性尺度显示 PI 信号。

该图将用于通过各种控件设置其余参数，并用于收集数据。进行分析时，将仅含PI染料的样本放入流式细胞仪的加样口，调节增益使G1峰位于x轴约200处。在PI染色的直方图中观察将更易于可视化。

接下来将仅含BRDU的样本放入上样孔并运行。调节增益，使细胞的两个群体（BRDU阳性与BRDU阴性）均显示在图中。理想情况下，BRDU阴性细胞应位于10¹处或略低于该位置。

最后一个对照是 BDU/PI 阴性样品。运行此阴性对照以确保细胞不出现在任何上方或右侧象限中。在设置好各个图的参数后，流式细胞仪即完成校准，可进行 BrdU 和 PI 染色细胞的检测。每个样品至少采集 10,000 个经 PI 门控的细胞数据。

然后使用 FlowJo 或 Fax Diva 等软件，以 PI 与 FL 两色图中圈选 PI 阳性细胞为基础，绘制 FITC 对 PI 的散点图，以区分增殖周期中的细胞群体。接下来，设置第二个圈门以分离 BRDU 阳性细胞群。

然后，通过绘制含有G1期或G2期DNA含量的BrdU阳性细胞数量随时间变化的曲线，以比较两种结直肠癌细胞系HT 29和LS 180的细胞周期进展动力学。在撤除BrdU脉冲后，每小时收集一次细胞，持续八小时。

比较两条曲线的动力学特征，LS 180 细胞在 BRDU 处理后 4 小时出现明显的 G1 期峰，而 HT 29 细胞系在同一时间点则无此峰。这表明 LS 180 结直肠癌细胞系的细胞周期进程在 G2 期推进加快。基于此可建立乳腺癌细胞系的细胞周期分布谱型。

MC七细胞每小时收集一次，持续八小时。在去除BrdU脉冲后，根据其荧光信号对免疫标记和DNA复染的细胞进行分选。

如图所示，CF7 细胞的增殖速率明显慢于所测试的两种结直肠癌细胞系中的任意一种。观看本视频后，您应能充分理解如何通过 DNA 代谢标记结合时间点收获法来追踪细胞周期动力学。