代谢标记和流式细胞仪测定细胞周期进程的动力学

以下程序的总体目标是测量细胞周期的动力学和进程。第一个细胞是用 romo、deoxy、uridine 或 BRDU 标记的脉冲追踪，它们被掺入细胞的 DNA 中以代替胸苷。然后用抗 BRDU 的抗体对细胞进行免疫染色，并在染色后立即通过流式细胞术进行分析。

只有 S 期的细胞被标记，因为标记的细胞通过细胞周期进展到 G 2。它们在有丝分裂后被检测到具有 4 个 NDNA 含量。DNA 含量减少到 2 N.因此，流式细胞术产生的荧光图谱分析可用于确定细胞周期进程的动力学。

与其他使用化学物质进行细胞同步的方案相比，该技术的主要优点是没有可能无意中影响细胞分裂机制的生理扰动。当我们尝试使用化学同步来研究细胞周期进程速率时，我们首次使用了这种方法，结果出乎意料，干扰了我们的分析。这种方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题。

例如，不同细胞类型之间生长速率差异的基础是什么？通过脉冲 Chase 用 BRDU 标记细胞来开始此协议以执行此作。首先为每个时间点标记一个 10 厘米的板，并为以下每个控件标记一个板。

BRDU 仅 PI 仅 BRDU 阴性 PI 阴性 种子 每板用 5 乘以 10 至第五。补充 DMEM 中的 MCF 7 个细胞将板孵育 24 至 48 小时，以使细胞恢复和附着。一旦细胞达到 60%conf 流度，用含有 10 微摩尔的新鲜 DMEM 替换培养基。

BRDU 将细胞在 37 摄氏度、5%CO2 下孵育 1 小时，以允许 BRDU 掺入 DNA。确保一个板未处理，以作为 1 小时后的阴性对照或零时间点。去除脉冲标记培养基，并用 PBS 短暂冲洗细胞至 2 至 8 小时的时间点。

加入新鲜的生长培养基并将它们放回培养箱中。然后立即收获 0 小时和 1 小时的时间点板，如下一节所述。要收获细胞，请吸出培养基并冲洗板。

用 PBS 后，胰蛋白酶观察细胞，将其从板中分离出来，并将它们收集在 DMEM 中，以 3 个 90 倍 G 的速度离心 5 分钟。丢弃上清液。然后用 1 至 5 毫升冰冷的 PBS 冲洗细胞，离心后以 3 个 90 倍 G 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 100 微升冰中。

含 1% FBS 的冷 PBS。FBS 有助于防止细胞聚集。该程序最重要的方面之一是确保您从收获的细胞中获得单细胞悬液。

为了事实。为此，您可以将细胞直接逐滴加入乙醇中。这很关键接下来要固定细胞，使用移液器将细胞滴加到 5 毫升的冰代码中。

70% 乙醇装在 15 毫升锥形管中。将细胞在冰上孵育 30 分钟或在 4 摄氏度下储存过夜。这是一个理想的步骤，可以停止从各个时间点收集样品，将样品在乙醇中放置几天，从而允许它们通过方案的其余部分同时处理以进行 BRDU 和碘化丙啶染色。

从 4 摄氏度中取出细胞，并以 3 个 90 倍 G 离心 5 分钟。离心后吸出大部分固定剂，留下约 50 微升。然后漩涡。

在涡旋时松开沉淀以使 DNA 变性。缓慢滴加 1 毫升两种普通 HCL Triton X 100，然后在室温下孵育样品 30 分钟。通过以 3 个 90 倍 G 的速度离心样品 5 分钟来沉淀细胞，然后吸出并弃去上清液。

然后将细胞沉淀重悬于 1 毫升 0.1 摩尔的四硼酸钠中。离心后，细胞再次吸出并丢弃上清液。然后将细胞沉淀重悬于 75 微升 BRDU 染色中。

混合，在室温下孵育 45 分钟，孵育后避光。像以前一样通过离心使细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升 PBS 中，每种碘化物每 5 微克。当通过流式细胞仪运行 PI 阳性样品时，会创建前向散射与侧向散射图，以确保细胞大小分布正确。

这两个参数都应该绘制在线性刻度上。同时查看 FL 3 H 与 FL 2 W 的曲线，以查看 PI 染色与荧光脉冲宽度的关系。此图用于创建步态，以分离被认为在细胞周期的正态分布模式内的细胞分数。

通常，这种分布模式的特征是来自 PI 染色的 2 个 N 和 4 个 NDNA 含量的两个细胞簇，分别代表细胞周期的 G 1 和 G 两个阶段。位于这两个簇之间的一串细胞代表了细胞周期 S 期正在进行的 DNA 复制。创建一个图，显示门控单元，其中 FL 为 1 H 或 FITC，Y 轴为对数刻度，PI 为 X 轴线性刻度。

此图将用于使用各种控件设置其余参数以及收集数据。对于分析，将仅 PI 染色样品放在流式细胞仪的加载端口中，调整增益以将 G 1 置于 x 轴上约 200 的位置。这将更容易在 PI 染色的直方图中可视化。

接下来，将仅 BRDU 样品放入加载端口并运行。调整增益，使两个细胞群 BRDU 阳性和 BRDU 阴性出现在图上。理想情况下，BRDU 阴性细胞位于 10 或以下

最后一个控件是 BDU 斜杠 PI 负样本。运行此阴性对照以确保细胞不会出现在任何上象限或右象限中。一旦设置了各种图的参数，流式细胞仪就会被校准并准备好处理 BRDU 和 PI。染色细胞从每个样品的至少 10， 000 个 PI 门控细胞中收集数据。

然后使用 FlowJo 或传真 diva 等软件，创建一个 FITC 与 PI 的图，其中细胞从 PI 与 FL 两个 W 图中门控为 PI 阳性。区分骑行人群。接下来，生成第二个门以隔离 BRDU 阳性群体。

然后，为了跟踪细胞周期进程的时间进程，将 G 1 或 G 2 含量的 BRDU 阳性细胞的数量绘制为时间的函数，以比较细胞进程的周期。两种结直肠细胞系 HT 29 和 LS 180 之间的动力学。去除 A-B-R-D-U 脉冲后 8 小时内每小时收集一次细胞。

比较两种曲线的动力学，LS 180 细胞在 t 等于 BRDU 后 4 小时出现 G 1 峰，而 HT 29 细胞系的相应时间点缺乏该峰。这表明细胞周期的 G 两个阶段的细胞周期进程加速。在结直肠细胞系 LS 180 中生成乳腺癌细胞系的循环曲线。

每小时收集 MC 7 个细胞，持续 8 小时。在移除 BRDU 脉冲后。然后根据免疫标记和 DNA 复染细胞的荧光信号对细胞进行分类。

从这里可以看出，CF 7 细胞的循环速度明显慢于测试的两种结直肠细胞系中的任何一种。观看此视频后，您应该对 DNA 的代谢标记与时间点收获相结合如何跟踪细胞周期动力学有了很好的了解。