Name: 离心淘洗制备不同细胞周期的原发性急性淋巴细胞白血病细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习使用离心淘洗技术分离原发性急性淋巴细胞白血病细胞至不同细胞周期阶段的方法。该技术基于物理特性实现细胞分离，避免化学干扰，有助于研究抗癌药物的周期依赖性效应，为癌症治疗策略提供重要依据。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）CA109821 项目（资助 TCC）支持。我们感谢贝克曼库尔特公司慷慨提供资金以支付出版费用，并在离心淘析系统的安装与运行方面提供技术支持。我们感谢 Fred Falkenburg 博士提供了最初的原代急性淋巴细胞白血病（ALL）培养细胞。

注意：本方案已针对直径约为 8 µm（G1 期）至 13 µm（G2/M 期）的原代 B-ALL 细胞进行了优化。因此，特定的离心速度和泵流速可能不适用于尺寸范围不同的细胞。然而，可通过沉降速率方程估算合适的洗脱参数。细胞在已描述的无血清限定培养基中培养16，最佳密度为 1 - 3 × 106 个细胞/mL。除使用预冷冰上试管在 4 °C 下收集组分外，所有步骤均在室温下进行，离心机设定温度为 20 °C，最高不超过 24 °C。
1. 漏斗缓冲液与材料的准备
<ol>
	<li>为减少细胞聚集，配制含酚红的汉克斯平衡盐溶液（HBSS），并添加2%胎牛血清（FBS）以在差速离心过程中保护细胞免受机械应力，同时加入1.6 g/L的2-萘酚-6,8-二磺酸二钾盐（NDA），使细胞表面带负电荷，从而减少细胞聚集。
	<ol>
		<li>将1.6 g NDA加入一个50 mL锥形管中。</li>
		<li>在无菌条件下，从1 L瓶中取出35 mL HBSS加入含有NDA的50 mL锥形管中，轻轻旋转混匀直至NDA完全溶解。</li>
		<li>使用0.2 µm滤器将溶解后的NDA转移至一个新的无菌50 mL锥形管中，然后将NDA溶液加入剩余的1 L HBSS中。</li>
		<li>最后，向HBSS中加入21 mL FBS，使终浓度为2%（v/v）。 
		注意：差速离心缓冲液可配制后保存于4 °C，保存期限至HBSS标签所示有效期，或直至指示染料变黄表明pH发生明显变化为止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记用于收集组分的50 mL锥形管，包括标记为洗涤1和洗涤2（W1和W2）、组分1至20（F1&#160;– F20）以及STOP的管子。
	<ol>
		<li>在收集组分前，将这些管子预先置于冰上预冷。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 离心淘析系统的组装
<ol>
	<li>首先，将频闪灯组件安装到离心机中，使电源线从左侧端口引出离心腔。确保频闪闪光灯位于腔体前部，以便在关闭离心机时与观察窗对齐。
	<ol>
		<li>通过先将两个十字头螺丝拧入每个支架顶部的两个孔中，再拧紧每个支架底部的蝶形螺钉，将组件固定到位。</li>
		<li>将电源线插入离心机背面的频闪灯电源接口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来，将转子垂直安装到离心机驱动轴上，并使用T型手柄六角扳手固定。 
	注意：如果离心机无需用于非洗脱分离用途，则可在各次运行之间保留频闪组件和转子在离心机内。</li>
	<li>转子固定后，将包含洗脱分离室、配重块、旋转密封组件和安装板的快速拆卸组件放入转子中。
	<ol>
		<li>一只手均匀下压洗脱分离室，另一只手下压配重块，直至转子中的螺栓卡入安装板上的孔中。</li>
		<li>最后，通过将缆绳一侧的销钉插入旋转密封组件的孔中，并使用位于腔体左侧支架上的一个十字头螺丝（见步骤2.1.1）固定缆绳另一侧的吊环，从而连接固定缆绳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来，使用可调速泵和管路组装流路系统，将缓冲液泵入洗脱分离室，并在缓冲液流出洗脱分离室时进行收集。
	<ol>
		<li>将来自可调速泵的16号进液管穿过离心腔左上方的端口，使其进入腔内。</li>
		<li>在进液管的自由端连接一个接头，并将该接头插入旋转密封组件侧面的进液孔中。</li>
		<li>将16号出液管穿过端口，并将其连接至旋转密封组件顶部的转移管上。 
		注意：在各次洗脱分离运行之间，流路系统也可保持组装状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，开启离心机并设置实验所需的参数。
	<ol>
		<li>更改转子ID。</li>
		<li>若离心机需要输入时间，请设置为2小时，此时间足以完成一次洗脱分离运行。</li>
		<li>将温度设置为20 °C，最高温度为24 °C。</li>
		<li>将加速度设为最大，减速度设为慢速。</li>
		<li>最后，将转速设为867 × g。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 洗脱系统的预处理
<ol>
	<li>首先，为了对差速离心系统进行灭菌，将储液管插入含有5%次氯酸钠的500 mL塑料瓶中，并将输出管插入一个空的1 L塑料废液瓶中。
	<ol>
		<li>启动泵，将流速设为25 mL/min，使5%次氯酸钠溶液完全流经整个差速离心系统，直至从输出管泵入废液瓶中。</li>
		<li>启动离心机，使其加速至指定最大速度（867 × g），以释放气泡和反向压力。</li>
		<li>停止离心机。待转子完全停止旋转后，打开盖子，检查腔室是否有泄漏。</li>
		<li>若无泄漏，让次氯酸钠溶液在系统中持续流动至少5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来，用高压灭菌水冲洗系统，因为次氯酸钠可能与差速离心缓冲液反应生成沉淀物，导致细胞聚集，并可能对细胞造成损伤。
	<ol>
		<li>将储液管插入装有1 L高压灭菌水的瓶子中，冲洗至少10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用水冲洗后，将差速离心缓冲液引入系统。使用一个已高压灭菌的150 mL玻璃瓶作为差速离心缓冲液和细胞的储液瓶。
	<ol>
		<li>向瓶中加入100 mL差速离心缓冲液，并将储液管移至玻璃瓶内，确保管口位于瓶底最底部。</li>
		<li>启动离心机，使缓冲液流经系统以彻底清除残留的水。</li>
		<li>当储液瓶中的液体即将排空且系统内的水已完全被冲洗干净后，将输出管从废液瓶移回储液瓶，使缓冲液在系统中循环使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，调整观察窗，使在当前转速下能够清晰看到差速离心腔。
	<ol>
		<li>按下离心机外部的频闪灯电源按钮，打开灯光；同时将离心机外部的差速离心调节旋钮完全向左旋转到底。</li>
		<li>通过观察窗观察，缓慢向右旋转旋钮，直至差速离心腔清晰可见，且频闪灯光与转子旋转同步。 
		注意：差速离心系统可保持在此状态下，直至细胞准备完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞样品的制备
<ol>
	<li>计数细胞，并将3亿至4亿个细胞分装至数个50 mL锥形管中，每管加入适量培养基。在1210 × g下离心3分钟。</li>
	<li>吸除培养基，用25 mL洗脱缓冲液轻轻吹打重悬细胞。</li>
	<li>为减少细胞结团，将细胞通过25号针头重复转移两次。
	<ol>
		<li>使用10 mL注射器吸取细胞悬液，连接25号针头，将细胞缓慢推出至无菌50 mL锥形管内壁。重复此操作，直至全部25 mL悬液均通过针头。</li>
		<li>更换新的针头和注射器，重复上述过程一次。 
		警告：使用过的注射器针头应放入锐器盒中。 
		注意：为最大限度减少细胞结团，细胞在进入洗脱系统前必须立即通过针头推注处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将细胞样品引入流式分离系统并收集组分
<ol>
	<li>将细胞样品倒入储液罐中，引入到流式分离系统，此时储液罐中已有剩余的流式分离缓冲液在循环。
	<ol>
		<li>让细胞进入系统，并在流式分离室中达到平衡。 
		注意：此过程大约需要 5 分钟，可通过观察窗观察细胞进入分离室的情况来监测进展。为确保所有细胞均已进入分离室，可取一滴流出液，置于玻片上，在显微镜下观察。若样品中无完整细胞，则表明细胞已被保留在分离室内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当所有细胞均已进入分离室，且在分离室最宽处出现明显的细胞平衡界面时，开始收集各组分。
	<ol>
		<li>首先将输出管移至标记为 W1 的 50 mL 离心管，收集 50 mL 流式分离缓冲液作为该组分，同时注意观察储液罐液位，必要时及时补充流式分离缓冲液。 
		注意：为确保所有细胞均已进入系统，首次补充缓冲液前应让储液罐几乎排空。首次补充后，无需再等待储液罐几乎排空。此外，切勿让储液罐完全排空，否则会在系统中产生气泡和反压。</li>
		<li>当 W1 组分收集满 50 mL 后，同时将转速调整为 821 ×g，并将输出管移至标记为 W2 的离心管，以该转速继续收集 50 mL。</li>
		<li>按照表 1 所示继续调整转速并收集各组分。确保储液罐中有足够的缓冲液，并始终将离心管置于冰上。最后，随着转速降低，缓慢向右旋转旋钮调节观察窗视野。</li>
		<li>当全部 20 个组分收集完毕后，停止离心机，并将标记为 STOP 的离心管中收集 50 mL 流出液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 洗脱系统的冲洗
<ol>
	<li>离心机完全停止后，将储液管放入盛有1 L灭菌水的瓶子中，输出管放回废液瓶，以冲洗系统。
	<ol>
		<li>将泵速调至50 mL/min，使水通过系统运行直至耗尽。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭泵，从快接组件上拆下输入和输出软管，并拔出锚定缆绳的插销。
	<ol>
		<li>从转子上取下快接组件。 
		注：根据离心机后续用途，此时可保留淘析系统原样。否则，可按照上述相反顺序拆卸整个组件。淘析腔室可从快接组件上取下，并在每次运行之间使用超声波水浴进行清洗，以去除腔壁上的碎屑和污染物，避免对后续运行产生不利影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 组分分析及 G1 或 G2/M 期细胞群的收集。
注意：为了证明差速离心法的有效性，需对每个组分进行细胞计数、细胞直径和DNA含量分析，并根据代表性结果部分所述，分别收集处于G1期或G2/M期的细胞用于免疫印迹分析。本实验方案部分将介绍如何制备这些细胞群体并将其处理为可用于实验的形式。
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 2000 x g 离心每一份组分 5 分钟，并吸除洗脱缓冲液。</li>
	<li>合并组分，以分别获得 G1 期细胞池和 G2/M 期细胞池。
	<ol>
		<li>对于 G1 期细胞池，将收集自 788 x g 至 661 x g 转速范围（F1 - F5）的组分用总共 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，然后转移至 15 mL 圆底离心管中。对于 G2/M 期细胞池，将收集自 387 x g 至 333 x g 转速范围（F17 - F20）的组分进行重悬。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 2000 x g 离心细胞 5 分钟，并吸除 PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于 10 mL 培养基中，并进行细胞计数。</li>
	<li>从每个细胞池中取一份等分试样，通过碘化丙啶染色和流式细胞术分析 DNA 含量15。 
	注意：每个细胞池的剩余部分可用于后续实验。</li>
</ol>

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</ol>

Anisha Kothari 目前就职于&#160;圣犹达儿童研究医院细胞与分子生物学系

我们已描述了一种利用逆流离心（CCE）获取处于细胞周期不同阶段的原代急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的方法。在最佳条件下，可高效获得几乎纯的处于G1期的细胞群体，以及高度富集的处于G2/M期的细胞群体；如有需要，也可获得S期高度富集的细胞。本文所示结果来自一种原代ALL培养物（具体为ALL-5），在另一独立培养物ALL-215中也获得了基本相同的结果。此外，迄今为止检测的所有其他原代ALL培养物在异步生长期间均具有相似的密度范围，因此在进行CCE时很可能表现出类似效果。我们先前的研究还表明，其他白血病细胞系（包括HL60和K562）也可通过CCE分离为不同的细胞周期阶段19,20。该操作中的关键步骤包括：确保运行开始前细胞呈单分散状态且无聚集；优化反流速率和转子转速条件；确保系统各组件清洁且无碎片残留；以及避免将气泡引入流路中。CCE最适合那些在细胞周期进程中细胞体积显著增大的细胞。对于特定的悬浮细胞群体，可通过初步并简便地分析DNA含量与侧向散射光（后者依赖于细胞大小）之...

培养的细胞通常以不同步的方式生长，单个细胞处于细胞周期的不同阶段。某些生物体表现出天然的同步细胞周期，或可通过特定的生理刺激实现同步。例如，黏菌多头绒泡菌（Physarum polycephalum）的巨大原生质团内的细胞核以高度同步的方式进行分裂1，而绿藻四尾栅藻（Desmodesmus quadricauda）的细胞可通过交替光照与黑暗周期实现同步2。尽管这些生物体具有独特的实验优势，但它们不足以充分模拟哺乳动物细胞的复杂性。人工同步哺乳动物细胞群体的能力对于深入理解细胞周期调控机制以及细胞周期检查点的分子基础至关重要。常用的方法包括血清剥夺、化学阻断与释放，或利用细胞的物理特性3,4。撤除血清常导致细胞进入静息状态，重新添加血清则促进细胞重新进入G1期5。化学抑制剂包括过量胸苷或羟基脲等试剂，可将细胞阻滞在G1/S边界，或使用微管抑制剂将细胞通常阻滞在M期3,4。利用物理特性的方法包括有丝分裂震荡法，该方法可用于富集有丝分裂期细胞，因为这些细胞的贴附性低于间期细胞6。然而，所有这些技术均可能存在局限性。例如，并非所有细胞类型在缺乏血清或存在化学抑制剂的条件下都能维持存活能力，且在未预先使用有丝分裂抑制剂进行同步的情况下，通过有丝分裂震荡法获得的细胞产量有限。
除了早期胚胎细胞周期（细胞在分裂过程中逐渐变小7）外，大多数细胞在周期进程中会经历生长期并增大体积。这一特性被反流离心淘析技术（CCE）所利用，该技术可用于分离大小不同、因而处于不同细胞周期时相的细胞8,9。在CCE过程中，细胞受到两种相反方向的力的作用：离心力使细胞远离旋转轴，而流体速度（反流）则推动细胞向旋转轴方向移动（图1）。细胞在淘析腔内达到一个受力平衡的位置，此时两种力相等。决定平衡位置的关键因素是细胞直径和密度。当缓冲液流速增加，反流拖拽力超过离心力时，系统建立新的平衡，导致腔内细胞位置发生变化。所有细胞均向腔体出口方向移动，较小的细胞首先离开腔体，而较大的细胞则保留在腔内，直到反流速率进一步提高至足以促使其排出。随着反流速率逐级增加，从淘析腔中依次逸出的细胞可被收集为不同的组分，每个组分包含大小依次递增的细胞。除了逐步增加反流速率进行淘析外，通过逐步降低离心力（即降低离心转速）也可实现相同效果。淘析过程需根据细胞类型、所用淘析缓冲液及具体仪器设备进行优化。在此条件下，细胞沉降速率最适宜用斯托克斯定律（Stokes Law）描述：SV = [d2(ρp-ρm)/18η].ω2r，其中SV = 沉降速率；d = 颗粒直径；ρp = 颗粒密度；ρm = 缓冲液密度；η = 缓冲液黏度；ω = 转子角速度；r = 颗粒的径向位置。因此，SV与细胞直径和密度成正比，由于直径以平方项出现，其影响远大于密度；而密度在细胞周期中通常保持相对恒定。
CCE 的一个重要优势在于，细胞不会经历化学处理或营养剥夺的严苛条件，且能够以极高的得率几乎不受干扰地回收。其要求是目标细胞在通过细胞周期时直径需显著增加，至少增大30%。主要缺点是专用离心机、转子及配件的成本较高。尽管如此，利用 CCE 制备特定细胞周期阶段富集细胞的能力，已极大地推动了从酵母到哺乳动物细胞等多种生物体的细胞周期研究9,10。此外，近年来的技术进展进一步拓展了 CCE 的应用，包括分离健康组织与癌组织中的细胞、分离异质混合物中的不同细胞类型，以及用于免疫治疗中特定细胞类型的制备9。
我们的主要研究兴趣在于理解微管靶向药物（MTAs）（如长春碱类和紫杉烷类）的作用机制。这些药物曾被认为仅在有丝分裂期发挥作用，通过阻断纺锤体微管功能来抑制细胞分裂11,12，但近期证据表明它们也可能作用于间期微管13,14。我们近期报道了原发性急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞在使用长春新碱及其他MTAs处理后，会以细胞周期依赖的方式在G1期或M期发生死亡15。利用CCE技术将ALL细胞分离至不同细胞周期阶段，对于得出该结论起到了关键作用。本文中，我们详细描述了该技术的操作细节，并提供了将CCE应用于制备处于不同细胞周期阶段的原发性ALL细胞的实用建议。

<table><tbody><tr><td>汉克斯平衡盐溶液</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>1 L 瓶装</td></tr><tr><td>胎牛血清 Plus</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL 瓶装</td></tr><tr><td>2-萘酚-6,8-二磺酸二钾盐</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g 粉末</td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>每箱 500 个</td></tr><tr><td>PES 膜 0.22 &amp;micro;m 滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>每包 250 个</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI 带 Elut. 非 IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>可兼容洗脱系统的离心机</td></tr><tr><td>JE 5.0 洗脱转子套件</td><td>Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>转子套件，包含转子、T 型手柄六角扳手、快速拆卸组件（不含洗脱室）、固定缆线和频闪组件</td></tr><tr><td>洗脱室，标准型，4 mL，&quot;A&quot;</td><td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>标准洗脱室&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 易装泵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 可调速驱动器</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm 铂固化硅胶泵管，L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G × 1.5 精密滑动针头</td><td>BD</td><td>305127</td><td>无菌，一次性使用针头</td></tr><tr><td>10 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td>无菌，一次性使用注射器</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase 染色缓冲液</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>碘化丙啶/RNase 染色缓冲液</td></tr><tr><td>cyclin B1 (GNS1) 小鼠单克隆 IgG 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyclin D1 (DCS-6) 小鼠单克隆 IgG 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L)-HRP 偶联物</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG (H+L)-HRP 偶联物</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

实现细胞同步化的能力对于深入理解细胞周期调控机制至关重要。常用的技术包括血清剥夺、使用可将细胞阻滞在不同细胞周期时相的化学试剂，或利用有丝分裂细胞黏附性降低的特性进行振摇收集。然而，这些方法均存在一定的局限性。例如，血清饥饿法对正常细胞效果较好，但对因癌基因激活或抑癌基因缺失而导致细胞周期检查点功能受损的肿瘤细胞效果较差。同样，经化学药物处理的细胞群体可能带有药物诱导的损伤，并表现出与应激相关的改变。一种可规避上述问题的技术是逆流离心淘析法（counterflow centrifugal elutriation, CCE），该方法通过施加两种相反的作用力——离心力和流体速度，依据细胞的大小和密度实现分离。由于细胞在周期进程中通常会增大体积，因此CCE可用于将细胞按不同的细胞周期时相进行分离。本文中，我们将该技术应用于原发性急性淋巴细胞白血病细胞。在最佳条件下，可高效获得几乎纯的处于G1期的细胞群体，以及高度富集的处于G2/M期的细胞群体。这些细胞群体非常适合用于研究抗癌药物作用机制的细胞周期依赖性及其他相关应用。我们还展示了标准操作流程的某些修改如何导致性能下降，并讨论了该技术的局限性。本文提供的详细方法将有助于推动该技术在其他类型细胞中的应用与探索。

将3 - 4 × 108个原代急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞进行差速离心淘析，收集为两个洗涤组分和二十个主要组分，具体操作如实验方案所述。表1展示了代表性数据，列出了各组分中的细胞总数及相应的转子转速。总体回收率通常超过80%。对各组分细胞直径的测量证实，随着淘析进程的推进，细胞直径逐渐增大（图2）。这些结果为两次独立实验的平均值，反映了数据具有高度可重复性。随后，各组分细胞经碘化丙啶染色并进行流式细胞术分析以测定DNA含量（图3）。早期组分（F1 - F5）几乎仅包含具有2N DNA含量的细胞，代表G1期细胞；中间组分（F6 - F9）中可见G1期与S期细胞的混合物；从F10组分开始出现具有4N DNA含量的细胞；后期组分则主要为具有4N DNA含量的细胞，代表G2/M期细胞。这些结果结合图2的数据，证实了细胞大小与细胞周期时相之间存在关联。
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本方案描述了使用离心淘析法将原代急性淋巴细胞白血病细胞按不同细胞周期时相进行分离的方法。

同步细胞的能力对于深入理解细胞周期调控至关重要。常用的技术包括血清饥饿法……

本实验的总体目标是利用差速离心淘析法将细胞分离至不同的细胞周期时相。该方法有助于解答癌症治疗领域中的关键问题，因为将细胞分离到不同时相后，可进一步研究抗癌化合物对各时相依赖性的影响。该技术的主要优势在于，它能够利用细胞的物理特性而非化学扰动，将细胞分离到特定的周期阶段。开始实验时，将频闪装置安装到离心机中，使电源线从左侧端口引出离心腔。调整频闪闪光灯的位置，确保离心机关闭时，闪光灯与观察窗口对齐。通过拧紧每个支架顶部的两个十字头螺丝来固定组件，然后再拧紧支架底部的旋紧螺丝。将电源线插入离心机背面的频闪灯电源接口。接下来，将转子垂直安装到离心机驱动轴上，并使用T型手柄六角扳手将其牢固固定。然后，将包含洗脱腔、配重块、旋转密封组件和安装板的组件放置到转子上。均匀下压，一只手放在洗脱腔上，另一只手放在配重块上，直至转子上的螺栓卡入到位。将电缆一端的插销插入旋转密封组件的孔中，并用支架上的十字头螺钉固定另一端的环眼，以连接锚定电缆。为组装将缓冲液泵入和泵出淘析室的流路系统，需将16号管路连接至可调速泵。将这段管路的一端从离心室左上方的端口插入，使其进入室内。将接头连接至该管路的自由端，然后将接头插入旋转密封组件的输入孔中。最后，将输出管路通过一个端口插入，将其连接至旋转密封组件顶部的转移管上。组装好差速离心系统后，将输入管路的另一端放入一个装有5%次氯酸钠溶液的500毫升瓶中，并将输出管路放入一个空的1升废液瓶中，以此对系统进行灭菌。接着启动泵，使次氯酸钠溶液完全流经整个差速离心系统，直至被泵入废液瓶中。现在启动离心机，使其达到指定的最高速度，以释放气泡和反向压力。达到设定转速后，停止离心机。待转子完全停止后，打开盖子，检查腔室是否有泄漏。接下来，以与之前所述类似的方式，将无菌水通过系统运行10分钟。用水冲洗后，将水储瓶更换为装有100毫升洗脱缓冲液的无菌玻璃瓶。将进样管插入该瓶中，使其位于瓶底最底部。启动离心机，使缓冲液流经系统。当储液瓶接近排空且系统中的水完全冲洗干净后，将输出管路从废液瓶移至储液瓶，使缓冲液在系统中持续循环。最后，打开频闪灯，并将分离旋钮调至最左侧。现在，缓慢向右旋转旋钮，调节观察窗口，使分离室清晰可见，并使频闪灯与转子转速同步。按照文本方案所述准备细胞样品。将重悬的细胞加入含有循环分离缓冲液的储液瓶中。让细胞进入系统并在分离室内达到平衡。为确保所有细胞均保留在室内，取一滴流出液置于玻片上，在显微镜下观察。若样本中无完整细胞，则表明细胞已成功保留在分离室内。当所有细胞均进入腔室，且在腔室最亮区域形成包含细胞并达到平衡的清晰边界时，开始收集组分。将输出管转移至预冷的、已标记为 W1 的 50 毫升锥形管，收集 50 毫升漂洗缓冲液至该管中，并置于冰上保存。收集完 W1 组分后，立即将离心机转速降至 821 ×g，并将输出管转移至标记为 W2 的锥形管，在此转速下再收集 50 毫升组分。继续调节速度并收集组分。确保储液罐中有培养基，并始终将收集的组分置于冰上保存。收集完所有组分后，停止离心机运行，并用一个标记为“stop”的锥形管收集50毫升样品。收集各组分中的细胞沉淀，并根据需要采用流式细胞术或蛋白质印迹等下游分析方法。图中显示了连续流式分离组分中细胞平均直径的折线图。请注意，细胞直径越大，其洗脱的组分编号越高。荧光激活细胞分选分析结果显示了20个洗脱组分中各组分细胞的DNA含量。早期组分F1至F5几乎仅包含具有2N DNA含量的细胞，代表处于G1期的细胞。在中间组分F6至F9中可见处于G1期和S期的细胞混合物。而具有4N DNA含量的细胞，即代表处于G2至M期的细胞，则从F10组分开始被观察到。此处显示的是对处于 G1 期以及 G2 至 M 期细胞合并组分中细胞周期相关蛋白水平进行检测的 Western 印迹结果。与 G1 期合并组相比，G2 至 M 期合并组中磷酸化 Rb 和 Cyclin B1 的水平更高，符合预期。Cyclin D1 信号较弱，但在 G1 期合并组中可检测到，而在 G2 至 M 期合并组中则无法检测到。熟练掌握后，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在进行该实验时，务必注意控制操作时间，并确保离心淘析系统已正确组装，且所有材料和溶液均已准备就绪。在完成该实验步骤后，可进一步采用其他方法，如细胞周期分析、细胞活力检测以及免疫印迹，以探究治疗化合物是否以依赖细胞周期时相的方式发挥作用。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

离心淘洗制备不同细胞周期的原发性急性淋巴细胞白血病细胞

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原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

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体内 异种移植患者来源的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞（PDX-ALL）

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急性淋巴细胞白血病诱导化疗后白血病复发的小鼠模型

学习使用离心淘洗技术分离原发性急性淋巴细胞白血病细胞至不同细胞周期阶段的方法。该技术基于物理特性实现细胞分离，避免化学干扰，有助于研究抗癌药物的周期依赖性效应，为癌症治疗策略提供重要依据。

通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

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