离心淘洗制备不同细胞周期的原发性急性淋巴细胞白血病细胞

本议定书描述了使用离心淘洗分离原发性急性淋巴细胞白血病细胞到不同的细胞周期阶段。

该程序的总体目标是使用离心淘析法将细胞分离到不同的细胞周期阶段。这种方法可以帮助回答癌症治疗领域的关键问题。因为将细胞分离成不同的阶段，允许询问抗癌化合物的阶段依赖性影响。

该技术的主要优点是它允许使用物理特性而不是化学扰动将细胞分离成特定相。要开始实验，请将频闪组件安装到离心机中，使电源线通过左侧的端口从腔室中引出。调整频闪灯，使其在离心机关闭时与观察窗对齐。

拧紧每个支架顶部的两个十字头螺钉，将组件固定到位。然后拧紧支架底部的翼形螺钉。将电源线插入离心机背面的频闪电源端口。

接下来，将转子笔直向下放在离心机驱动轮毂上，并用 T 形手柄六角扳手将其牢固固定。然后，将包含淘析室、平衡、旋转密封组件和安装板的组件放在转子上。均匀向下推，将一只手放在淘析室上，另一只手放在平衡器上，直到转子上的螺栓卡入到位。

将位于电缆一端的销钉放入旋转密封组件的孔中。并用其中一个十字头螺钉固定另一端的眼孔，该螺钉固定在支架上以连接锚固电缆。要组装流动系统，将缓冲液泵入和泵出淘析室，请将 16 号管路连接到变速泵。

将此管路的一个自由端插入离心腔室左上角的端口，使其进入腔室。将接头连接到该管的自由端，然后将接头插入旋转密封组件的输入孔中。最后，通过端口插入输出管，以将其连接到旋转密封组件顶部的传输管上。

淘析系统组装完成后，将输入管的另一端自由端放入装满 5% 漂白剂的 500 毫升瓶中，对其进行消毒。并将输出管放入一个空的 1 升废液瓶中。接下来，打开泵，让漂白剂一直流过淘析系统，直到它被泵出到废液瓶中。

现在，打开离心机并使其达到最大指定速度以释放气泡和背压。一旦达到设定速度，停止离心机。转子完全停止后，打开转子盖并检查腔室是否有任何泄漏。

接下来，如前所述，以类似的方式，将无菌水流过系统10分钟。用水冲洗后，用装满 100 毫升淘析缓冲液的无菌玻璃瓶更换储水器。将输入管放入此瓶中，使其位于最底部。

启动离心机，让缓冲液流过系统。当储液瓶接近清空，并且水从系统中完全冲出后，将废液瓶的输出管移至储液槽中，以便缓冲液通过系统持续循环。最后，打开频闪灯，并将淘析法旋钮转到最左侧。

现在，通过缓慢向右转动旋钮来调整观察窗口，以便清楚地看到淘析室，并且频闪灯与转子的速度同步。按照文本方案中的说明准备细胞样品。将重悬的细胞加入含有回收淘析缓冲液的储液瓶中。

让细胞进入系统并在淘析室内达到平衡。为确保所有细胞都保留在腔室中，请在载玻片上滴一滴洗脱液，并在显微镜下观察。如果样品中没有完整的细胞，则确认样品室中的保留。

一旦所有细胞都进入腔室，并且在腔室最白的部分看到一个明显的边界，包含细胞和平衡，开始收集馏分。将输出管移至预冷的 50 mL 锥形管上，标记为 W1。在此管中收集 50 毫升淘析缓冲液并储存在冰上。收集 W1 馏分后不久，将离心速度降低到 821 G，并将输出管移至标有 W2 的锥形管上，并以此速度再收集 50 毫升。

继续改变速度，并收集馏分。确保储液罐中有培养基，并始终将收集的馏分储存在冰上。收集完所有馏分后，停止离心机，将 50 毫升收集在标有 stop 的锥形管中。

沉淀每个组分中收集的细胞，并根据需要使用下游分析，例如流式细胞术或蛋白质印迹。显示了连续淘析馏分中细胞的平均直径的折线图。请注意，细胞直径越大，洗脱的馏分数就越高。

荧光激活细胞分选分析的结果显示 20 个淘析馏分中每个组分中细胞的 DNA 含量。早期组分 F1 至 F5 几乎仅包含具有 2N DNA 含量的细胞，代表 G1 期细胞。G1 期和 S 期细胞混合物，在中间级分 F6 至 F9 中观察到。从 F10 开始观察到具有 4N DNA 含量的细胞，代表 G2 至 M 的细胞。

此处显示的是探测 G1 期和 G2 至 M 期细胞混合组分中细胞周期相关蛋白水平的蛋白质印迹结果。正如预期的那样，与 G1 混合相比，G2 至 M 混合细胞的磷酸化 Rb 和细胞周期蛋白 B 1 水平更高。细胞周期蛋白 D 1 信号较弱，但在 G1 池中可检测到，而在 G2 至 M 池中无法检测到。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住要花点时间，并确保淘析系统已正确组装，并且已准备好所有材料和溶液。在此程序之后，可以进行其他方法，例如细胞周期分析、细胞活力测定和免疫印迹，以询问治疗性化合物如何以细胞周期阶段依赖性方式发挥作用。