通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

本实验的总体目标是利用差速离心淘析法将细胞分离至不同的细胞周期时相。该方法有助于解答癌症治疗领域中的关键问题，因为将细胞分离到不同时相后，可进一步研究抗癌化合物对各时相依赖性的影响。

该技术的主要优势在于，它能够利用细胞的物理特性而非化学扰动，将细胞分离到特定的周期阶段。开始实验时，将频闪装置安装到离心机中，使电源线从左侧端口引出离心腔。调整频闪闪光灯的位置，确保离心机关闭时，闪光灯与观察窗口对齐。

通过拧紧每个支架顶部的两个十字头螺丝来固定组件，然后再拧紧支架底部的旋紧螺丝。将电源线插入离心机背面的频闪灯电源接口。

接下来，将转子垂直安装到离心机驱动轴上，并使用T型手柄六角扳手将其牢固固定。然后，将包含洗脱腔、配重块、旋转密封组件和安装板的组件放置到转子上。均匀下压，一只手放在洗脱腔上，另一只手放在配重块上，直至转子上的螺栓卡入到位。

将电缆一端的插销插入旋转密封组件的孔中，并用支架上的十字头螺钉固定另一端的环眼，以连接锚定电缆。为组装将缓冲液泵入和泵出淘析室的流路系统，需将16号管路连接至可调速泵。

将这段管路的一端从离心室左上方的端口插入，使其进入室内。将接头连接至该管路的自由端，然后将接头插入旋转密封组件的输入孔中。最后，将输出管路通过一个端口插入，将其连接至旋转密封组件顶部的转移管上。

组装好差速离心系统后，将输入管路的另一端放入一个装有5%次氯酸钠溶液的500毫升瓶中，并将输出管路放入一个空的1升废液瓶中，以此对系统进行灭菌。接着启动泵，使次氯酸钠溶液完全流经整个差速离心系统，直至被泵入废液瓶中。

现在启动离心机，使其达到指定的最高速度，以释放气泡和反向压力。达到设定转速后，停止离心机。待转子完全停止后，打开盖子，检查腔室是否有泄漏。

接下来，以与之前所述类似的方式，将无菌水通过系统运行10分钟。用水冲洗后，将水储瓶更换为装有100毫升洗脱缓冲液的无菌玻璃瓶。将进样管插入该瓶中，使其位于瓶底最底部。

启动离心机，使缓冲液流经系统。当储液瓶接近排空且系统中的水完全冲洗干净后，将输出管路从废液瓶移至储液瓶，使缓冲液在系统中持续循环。最后，打开频闪灯，并将分离旋钮调至最左侧。

现在，缓慢向右旋转旋钮，调节观察窗口，使分离室清晰可见，并使频闪灯与转子转速同步。按照文本方案所述准备细胞样品。将重悬的细胞加入含有循环分离缓冲液的储液瓶中。

让细胞进入系统并在分离室内达到平衡。为确保所有细胞均保留在室内，取一滴流出液置于玻片上，在显微镜下观察。若样本中无完整细胞，则表明细胞已成功保留在分离室内。

当所有细胞均进入腔室，且在腔室最亮区域形成包含细胞并达到平衡的清晰边界时，开始收集组分。将输出管转移至预冷的、已标记为 W1 的 50 毫升锥形管，收集 50 毫升漂洗缓冲液至该管中，并置于冰上保存。收集完 W1 组分后，立即将离心机转速降至 821 ×g，并将输出管转移至标记为 W2 的锥形管，在此转速下再收集 50 毫升组分。

继续调节速度并收集组分。确保储液罐中有培养基，并始终将收集的组分置于冰上保存。收集完所有组分后，停止离心机运行，并用一个标记为“stop”的锥形管收集50毫升样品。

收集各组分中的细胞沉淀，并根据需要采用流式细胞术或蛋白质印迹等下游分析方法。图中显示了连续流式分离组分中细胞平均直径的折线图。请注意，细胞直径越大，其洗脱的组分编号越高。

荧光激活细胞分选分析结果显示了20个洗脱组分中各组分细胞的DNA含量。早期组分F1至F5几乎仅包含具有2N DNA含量的细胞，代表处于G1期的细胞。在中间组分F6至F9中可见处于G1期和S期的细胞混合物。而具有4N DNA含量的细胞，即代表处于G2至M期的细胞，则从F10组分开始被观察到。

此处显示的是对处于 G1 期以及 G2 至 M 期细胞合并组分中细胞周期相关蛋白水平进行检测的 Western 印迹结果。与 G1 期合并组相比，G2 至 M 期合并组中磷酸化 Rb 和 Cyclin B1 的水平更高，符合预期。Cyclin D1 信号较弱，但在 G1 期合并组中可检测到，而在 G2 至 M 期合并组中则无法检测到。

熟练掌握后，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在进行该实验时，务必注意控制操作时间，并确保离心淘析系统已正确组装，且所有材料和溶液均已准备就绪。在完成该实验步骤后，可进一步采用其他方法，如细胞周期分析、细胞活力检测以及免疫印迹，以探究治疗化合物是否以依赖细胞周期时相的方式发挥作用。