链霉菌发育突变体的视觉和显微评价
2018年9月12日
在这里, 我们提出了新手研究员的协议, 以启动分型药理重要的细菌属链霉菌。
以下技术的总体目标是培训初级研究人员在大学教学实验室和高中课堂环境中使用链霉菌和其他相关物种。表型观察对于进入链霉菌研究领域的许多研究人员来说很重要。该视频介绍了细菌繁殖、储存以及目视和显微镜检查的方法。
此处描述的表型方法使用 Streptomyces coelicolor 作为模型。然而，这些方法适用于大属的所有成员以及密切相关的放线菌。这些技术的主要优点是，它们旨在供高中课堂或本科教学实验室的新手研究人员以及经验丰富的实验室人员使用。
在观看此视频并阅读随附的方案后，新的研究人员应该能够作他们的链霉菌菌株，正确储存它们并开始视觉表征实验。演示这些程序的是我在奥特拜因大学实验室的本科研究生 Garret Kandell 和 Sean Kirk。首先，使用标准方法，例如 Saunders 2012 中演示的象限条纹法，将链霉菌菌株划线到 MS 琼脂平板上并培养成单个菌落。
每 4 到 6 天，挑选一个菌落并将其重新划线到新盘子上。随着菌落年龄的增长，它们变得容易发生随机突变。根据文本方案进行诱变后，与野生型亲本菌株相比，请注意每个突变体的菌落形态。
在表征新的链霉菌物种时，将新的分离株与经过充分研究的物种进行比较，注意基本形状、菌落表面、不透明度、隆起和色素沉着。标记 MS 琼脂平板，并以楔形模式标记野生型和突变型菌株。小心不要让任何菌株接触其他菌株，以避免交叉污染。
记下菌株划到板上的日期和时间。然后将板在 30 摄氏度下孵育。请记住，始终保护您的链霉菌样品免受污染非常重要。
在所有步骤中使用您最好的无菌技术，以尽可能短的时间打开板和试管。将生长的培养皿放在彩色或白色纸上，以使背景均匀化。在纸上写下菌株名称、日期、孵育温度和从第一块板划线开始的时间。
拍摄印版的数码照片，并在纸张背景上写下应变信息，以便将混淆降至最低。通过在 70% 乙醇中清洗镊子，然后将它们通过本生灯火焰以蒸发乙醇来对镊子进行消毒。通过在 70% 乙醇中洗涤盖玻片，然后让它们在无菌培养皿中干燥来消毒盖玻片。
接下来，要准备细菌生长的盖玻片升降机，请使用无菌镊子拿起无菌盖玻片，并将盖玻片放在细菌生长密集的 MS 琼脂平板上。使用镊子轻轻按压盖玻片的背面，以确保细菌孢子和气生菌丝体的充分转移。从板中取出盖玻片，将其以 45 度角放置，使细胞材料面向含有 15 微升 50% 甘油滴的显微镜载玻片表面。
让盖玻片落到甘油上，这将减少气泡。要以不同的时间间隔进行相差显微镜检查，请将准备好的载玻片放在显微镜载物台上，并在盖玻片的中心加入一滴浸油。将 100 倍相位物镜旋转到位，并将聚光镜转盘设置为适当的匹配相位设置。
物镜与油接触后，仅使用微调旋钮聚焦图像。检查多个视野以识别突变菌株和野生型之间的明显和一致的差异。如形成孢子的能力、孢子的大小和形状以及孢子的总数。
使用无菌镊子，像以前一样从 MS 琼脂平板上准备盖玻片升降机，其中细菌生长明显，用镊子轻轻接触盖玻片的背面，以确保细菌孢子和气生丝的充分转移。从板中取出盖玻片并将其放在卡片纸上，使带有细胞材料的一面朝上，以便于和作盖玻片。用冰冷的甲醇淹没盖玻片，静置 5 分钟。
使用 PBS 轻轻分配并去除溶液，将盖玻片洗涤两次。向玻片中加入 15 微升 10 微克/毫升碘化丙啶溶液和/或每毫升 10 微克 WGA-FITC。将盖玻片面朝下放在一滴荧光染料上。
将样品在黑暗或光线昏暗的房间中孵育 15 分钟。荧光染色剂和染色样品的原液应避光。建议研究人员在制备样品时使用弱光条件，并在制备样品后使用暗箱来存放样品。
使用配备有碘化丙啶和 FITC 落射荧光激发立方体的相差或 DIC 显微镜在 100 倍物镜下观察载玻片。根据文本协议分析图像。这里显示的是转座子诱变产生的链霉菌突变体的实例。
颜色较浅的气生菌丝体可能表明孢子形成缺陷引起的灰色色素水平较低。或者没有模糊的外观表明气生菌丝体形成中存在块。通过相差显微镜观察，野生型 S.coelicolor 菌落通常在生长约两天后产生气生菌丝体。
和长长的孢子链经过三天的生长。白色突变体可以延迟孢子形成，显示产生的孢子丰度减少，产生具有形状和/或大小缺陷的孢子，或者只是产生较低水平的成熟灰色孢子色素。此处使用 DIC 和荧光显微镜与 PI 染色显示，将野生型样品中孢子链的规则间隔染色与显示染色体分离缺陷的两个转座子插入突变体的间歇染色模式进行比较。
使用 WGA-FITC 对细胞壁野生型菌株 S.venezuelae 以孢子链中光滑的气生丝形式存在。并表现出通常在孢子形成过程中看到的横向分裂隔膜阵列。与丝状生物一起工作与与众所周知的杆状细菌一起工作非常不同。
这里的视频协议应该作为进入链霉菌研究领域的全新研究人员的重要资源。观看此视频后，您应该对如何开始研究链霉菌属和其他相关细菌有很好的了解。在这些初步实验之后，可以在研究实验室中使用各种技术来了解更多关于您的链霉菌菌株的信息。
例如，一些先进的技术可能是蛋白质标记或基因表达分析，例如实时 PCR 和 RNA seq。初始表型实验用于识别和表征新菌株，并辨别特定基因的典型作用。这些方法已在大学教学实验室中用于鉴定和表征各种链霉菌菌株。
概述
本文介绍了为新手研究人员设计的用于细菌属链霉菌表型分析的协议。它强调了在链霉菌研究中表型观察的重要性，并提供了细菌繁殖和检查的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 遗传学
- 实验室技术
背景
- 链霉菌是一个在药理学上具有重要意义的细菌属。
- 表型分析对于进入这个领域的研究人员至关重要。
- 这些方法适用于教育和研究环境。
- 天蓝色链霉菌作为一个模式生物。
研究目的
- 培训新手研究人员处理链霉菌。
- 提供可操作的细菌操作和表征技术。
- 便于视觉检查细菌菌株。
使用的方法
- 四分区划线法培养链霉菌菌株。
- 细菌生长的显微镜检查。
- 使用荧光染色技术。
- 相差显微镜用于详细观察。
主要结果
- 展示了正确的菌株操作和存储程序。
- 识别了野生型和突变型菌株之间的形态差异。
- 提供了在实验中避免污染的指南。
- 展示了诱变对链霉菌特性的影响。
结论
- 易于理解的协议可以增强新手研究人员的培训。
- 视觉表征对于理解链霉菌生物学至关重要。
- 正确的技术确保细菌研究中可靠的结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visual and microscopic phenotyping of Streptomyces developmental mutants provides foundational data for early-stage target validation and mechanistic de-risking in antibiotic discovery. Standardized characterization of mutant strains supports predictive confidence in linking genotype to phenotype, which is critical for prioritizing biosynthetic pathways and functional targets. These methods enable reproducible, scalable workflows that underpin portfolio decisions in natural product R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function through observable phenotypic changes.
- Supports biological de-risking by distinguishing developmental defects from wild-type characteristics.
- Facilitates functional target validation by correlating genetic mutations with developmental outcomes.
- Provides a reproducible framework for triaging candidate strains in natural product pipelines.
Screening & Assay Development
- Establishes validated visual and microscopic criteria for mutant selection in screening campaigns.
- Standardizes phenotypic endpoints for reproducibility across research teams and timepoints.
- Enables quantitative assessment of colony morphology, sporulation, and pigmentation for downstream assays.
- Prepares characterized strains for integration into high-throughput or secondary screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic data with biosynthetic pathway analysis for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of strains with desirable developmental profiles.
- Provides mechanistic insight into gene function relevant to secondary metabolite production.
- Facilitates the identification of translational biomarkers linked to developmental phenotypes when supported by further analysis.
Pipeline & Workflow Integration
Phenotypic evaluation of Streptomyces mutants is positioned at the interface of early discovery and lead identification, providing critical data for hypothesis testing and pathway prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of gene function and developmental pathways.
- Screening: Delivers standardized, reproducible phenotypic endpoints for mutant selection.
- Analytics: Enables quantitative comparison of morphological and microscopic features across strains.
- Translational Research: Lays the groundwork for linking developmental phenotypes to biosynthetic output.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable protocol for ongoing strain characterization and portfolio expansion.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotype-phenotype relationships and target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in strain characterization workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in natural product pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains and biosynthetic pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in sterile technique and basic microbiological methods.
- Needs access to phase contrast or DIC microscopy and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of phenotypic scoring and documentation practices.
- Adaptable to a range of Streptomyces species and related actinomycetes with minor protocol adjustments.
- Dependent on consistent environmental and incubation conditions to ensure reproducibility.
