Name: 小鱼肾注射液循环系统中微粒的简易有效管理与可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 了解如何通过肾脏注射将荧光微粒导入成年斑马鱼循环系统，并利用活体成像技术在鱼鳃中实现可视化。该方法支持重复测量血液pH值，为鱼类生理学研究提供微创且高效的实验手段。

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作者非常感谢俄罗斯伊尔库茨克国立大学的 Bogdan Osadchiy 和 Evgenii Protasov 在视频方案制备过程中提供的帮助。本研究由俄罗斯科学基金会（#15-14-10008）和俄罗斯基础研究基金会（#15-29-01003）资助。

所有实验操作均按照欧盟动物实验指令2010/63/EU进行，并已获得伊尔库茨克国立大学生物研究所动物实验研究委员会的批准。
1. 微胶囊的制备
注意：采用带相反电荷的聚电解质逐层组装的方法制备载有荧光染料的微胶囊7,8。所有操作均在室温下进行。
<ol>
	<li>为了合成包裹荧光染料的多孔 CaCO3 微核，将 2 mL 浓度约为 2 mg/mL 的 SNARF-1-葡聚糖溶液（大多数聚合物结合的荧光染料如 FITC-BSA 均可使用）与各 0.6 mL 的 1 mol/L CaCl2 和 Na2CO3 溶液在快速搅拌下混合。 
	注意：请注意不同荧光染料对光漂白的敏感性差异；若使用对光敏感的荧光探针（如 SNARF-1），操作和储存微粒时应尽可能避免光照。</li>
	<li>搅拌 5–10 秒后，将悬浮液转移至 2 mL 微量离心管中，在 10,000–12,000 g 条件下离心 15 秒，以沉淀 CaCO3 微核。</li>
	<li>弃去上清液，用约 2 mL 去离子水洗涤微核，并通过振荡重新悬浮沉淀。</li>
	<li>总共重复离心-洗涤步骤三次。最后一次离心后，弃去上清液。</li>
	<li>将微核置于超声水浴中孵育 1 分钟，以减少其聚集。 
	警告：务必使用耳机保护耳朵。</li>
	<li>为在模板上沉积第一层聚合物，将微核重新悬浮于约 2 mL 含 1 mol/L NaCl 的 4 mg/mL 聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH）溶液中。
	<ol>
		<li>持续振荡，使微核在溶液中保持约 5 分钟。</li>
		<li>离心 15 秒后，弃去含有未结合 PAH 的上清液。通过多次离心和洗涤步骤，用去离子水至少洗涤被包覆的微核三次。最后一次离心后，弃去上清液。</li>
		<li>将微核置于超声水浴中孵育 1 分钟，以减少其聚集。 
		注意：若所用荧光染料为阳离子型，则应从含 1 mol/L NaCl 的聚（对苯乙烯磺酸钠）（PSS）开始（见步骤 1.7）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用约 2 mL 含 1 mol/L NaCl 的 4 mg/mL PSS 溶液重复步骤 1.6，以在模板上沉积第二层聚合物。</li>
	<li>重复步骤 1.6 和 1.7 六次，共沉积 12 层聚合物。 
	注意：在沉积约 3–5 层之前，不建议长时间中断（约 12 小时或更久），因为未包覆的 CaCO3 微核可能发生再结晶。请注意，PSS 包覆会导致微核聚集程度更高，仅当最外层为 PAH 或聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸（PLL-g-PEG）时，才建议进行长时间暂停。</li>
	<li>将包覆后的微核在每微管约 1 mL 的 2 mg/mL PLL-g-PEG 溶液中孵育至少 2 小时。
	<ol>
		<li>通过连续的离心和重新悬浮步骤用水洗涤微核。最后一次离心后，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为获得中空微胶囊，向包覆的微核中加入 2 mL 0.1 mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（用 NaOH 调节至 pH 7.1），以溶解 CaCO3 模板。
	<ol>
		<li>孵育约 5 分钟后，离心微胶囊 45 秒，并弃去含 EDTA 的上清液。</li>
		<li>重复步骤 1.10–1.10.1 两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 45 秒内通过多次离心步骤用 0.9% NaCl 洗涤微胶囊三次，随后进行洗涤步骤。最后一次离心后，弃去上清液。 
	注意：最终用于注射的微胶囊溶液必须保持无菌（例如可通过添加 0.1 mg/mL 氨苄青霉素实现），且所用介质应与研究对象具有生物相容性（如中性 pH 的等渗介质）。</li>
	<li>在荧光显微镜下使用血细胞计数板估算所制备微胶囊的浓度。拍摄一系列微胶囊图像，使用 ImageJ9 或等效软件测量约一百个微胶囊的直径，并通过直方图分析其尺寸分布。</li>
	<li>将所得的包封探针避光保存。 
	注意：在无菌 0.9% NaCl 中经过数次洗涤后，微胶囊可在 4 °C 下保存数月。不建议在储存过程中使微胶囊完全干燥。</li>
</ol>
2. 光学装置的准备及微胶囊化SNARF-1的校准
注意：使用荧光显微镜的两个通道图像可对微胶囊化的SNARF-1进行粗略的pH测量7，但在本方案中，采用了一台连接光纤光谱仪的单通道荧光显微镜。
<ol>
	<li>根据所用荧光染料的特性，将相应的荧光滤光片组安装到荧光显微镜上，并打开荧光灯。
	<ol>
		<li>将显微镜的光路切换杆拉至目镜位置。 
		警告：过强的光线可能损坏光谱仪探测器。因此，在不使用光谱仪时，务必确保切换杆处于“目镜”模式。</li>
		<li>将光纤的一端连接至光谱仪，另一端连接至准直器。通过适配器将准直器置于显微镜相机端口或其他可用端口的焦平面上。</li>
		<li>打开光谱仪，运行光谱仪控制程序，并准备进行测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为校准微胶囊批次，取约 5 µL 微胶囊悬浮液（去离子水中约含 10,000 个微胶囊/µL）滴加至载玻片上，并在避光处干燥（例如，在 35 °C 恒温箱中）。
	<ol>
		<li>为校准包埋在微胶囊中的 SNARF-1 的光谱特性，使用一系列 pH 值在 ~6–9 范围内的缓冲液。将约 10 µL 缓冲液滴加至含有 SNARF-1-葡聚糖的干燥微胶囊上，并加盖盖玻片。</li>
		<li>将载玻片置于显微镜载物台上，使用 ×40 物镜定位微胶囊。</li>
		<li>将显微镜光路切换至相机端口，用光谱仪记录其荧光信号，然后将切换杆恢复至目镜位置。 
		注意：确保光谱信号显著高于背景水平，并确认视野中的微胶囊未处于气泡内（必要时可切换至较低倍数观察）。避免对同一微胶囊长时间照射。SNARF-1 易发生光漂白。</li>
		<li>重复步骤 2.2.3，对不同微胶囊进行 10–15 次测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有记录的光谱计算荧光峰强度比值（例如，使用 R 或 Scilab 软件），并利用以下公式确定各缓冲液的中位比值与介质 pH 之间的回归曲线： 
	<img alt="pH 计算公式，基于吸收比值测定 pH 的方程，用于教学。" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"> 
	注意：SNARF-1 的发射光谱具有两个峰，分别对应质子化和去质子化染料的发射，两峰之间的比值对介质 pH 敏感。本研究中采用 605 nm 与 660 nm 处的荧光强度比值。这些波长的选择取决于所用滤光片组。a 和 b 为通过非线性回归分析确定的系数（例如，使用 R 软件）。数值 0.15 和 1.1 分别为校准过程中观察到的 I605/I660 的最小值和最大值。</li>
	<li>从约 5 只成年鱼中收集约 10 µL 鱼血。将鱼放入含 1 µL/mL 丁香油水悬浮液的培养皿中进行麻醉，待鱼体侧翻且对鳍部夹捏无反应时（通常约 2–3 分钟），将其转移至载玻片上。用采血针剪断鱼尾，从尾静脉采集约 2 µL 鱼血。 
	注意：为防止血液凝固，切口处应使用肝素（5000 U/mL）处理，并使用肝素化玻璃毛细管和微量离心管收集血液。
	<ol>
		<li>用移液器吸取约 10 µL 血液滴加至微电极尖端，使用 pH 计测定 pH 值。</li>
		<li>将血液滴加至含有干燥微胶囊的载玻片上，按照校准缓冲液的方法（步骤 2.2–2.3）记录荧光强度比值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整校准曲线的线性系数，使其与鱼血中的测量结果相匹配（详见 Borvinskaya et al. 20175）。</li>
</ol>
3. 注射前准备
<ol>
	<li>使用锋利的穿刺针取下胰岛素笔（或注射器）尖端的钢针。 
	注意：任何细针（直径 ≤0.33 mm）或玻璃毛细管（通常直径为 1 mm）均可用于制备显微注射针10,11。</li>
	<li>将针头插入玻璃毛细管约一半深度，然后用气体火焰快速而轻柔地焊接固定。</li>
	<li>将玻璃毛细管连接至显微注射仪，并用无菌水冲洗三次，确保液体能顺利流经针头。</li>
	<li>用蒸馏水填充系统。 
	注意：确保系统内无气泡。</li>
</ol>
4. 注射
<ol>
	<li>使用超声波水浴将制备好的微胶囊悬浮液（悬浮于无菌0.9% NaCl或其他用于注射的培养基中，浓度为每微升0.5至600万个微胶囊）重悬1分钟。 
	注意：由于微胶囊容易沉淀，在后续注射过程中，需每隔几分钟通过旋转仪或手动方式轻轻振荡微胶囊瓶，使其保持悬浮状态，防止聚集。</li>
	<li>将鱼放入含有麻醉剂（水中悬浮丁香油，浓度为0.1 mL/L）的培养皿中约2–3分钟，直至鱼体侧翻且对轻微夹捏鱼鳍无反应为止。</li>
	<li>用勺子将鱼从麻醉液中取出，轻轻放置于湿润海绵上，呈侧卧位，头部朝左（适用于右利手者）或朝右（适用于左利手者）。</li>
	<li>注射前，先用显微注射仪连接的玻璃毛细管吸入1–2 mm空气柱，然后吸取约2 µL分散均匀的微胶囊悬液。 
	注意：注射前，微胶囊溶液必须调节至与鱼类饲养环境相同的温度。</li>
	<li>用非优势手轻轻固定鱼体于海绵上。
	<ol>
		<li>找到鱼的侧线， mentally 选择从鳃盖延伸至腹腔末端的一段区域，并确定其中点位置，将针头置于该中点下方1 mm处，朝腹侧方向。</li>
		<li>以轻刮动作将鱼鳞拨开，进行穿刺，针头以与台面成45°角的方向插入体内。</li>
		<li>推进针头直至轻抵脊柱。</li>
		<li>向肾脏内缓慢注入约1 µL微胶囊悬液，然后缓慢退出针头。 
		注意：为更易确定正确的穿刺位置，可通过底部透射光照射鱼体以观察主肾位置，进行练习，如图2A和2B所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用流水从头部至尾部冲洗鱼体，清除注射部位可能残留的微胶囊。</li>
</ol>
5. 体内 可视化
<ol>
	<li>使用解剖剪从鱼头上去除鳃盖，并暴露鱼的鳃组织。用清水冲洗鳃部。</li>
	<li>用勺子将鱼转移至显微镜载玻片上，并置于荧光显微镜的载物台上。 
	注意：在后续操作过程中，务必确保鱼鳃不干燥。为避免此情况，需定期使用巴斯德移液管向鳃部滴加清水（约每1-2分钟一次）。</li>
	<li>关闭室内光源，使用低倍镜（×10物镜）观察鳃部，寻找荧光微胶囊。 
	注意：当该操作用于将某些荧光颗粒引入鱼体循环系统时，建议在注射前先检查多条个体的鳃部是否存在意外的荧光颗粒。野生型斑马鱼的鳃部无自发荧光，但在某些情况下，鳃上可能存在零星的荧光颗粒（如食物残渣或单细胞共生体）。如有必要，可根据其特定形态（例如，食物残渣形状不规则，而微胶囊呈球形）或荧光光谱（i.e., 颜色）来区分这些颗粒。
	<ol>
		<li>切换至高倍物镜（×40），并将单个微胶囊或一组微胶囊置于视野中央。</li>
		<li>将光路切换至连接光谱仪的端口，记录光谱信号。</li>
		<li>将光路切换回目镜。</li>
		<li>对不同微胶囊重复多次测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将鱼转移至具有适当通气装置的水族箱中以恢复。 
	注意：经过少量练习后，每条鱼的注射与信号记录操作大约可在2-3分钟内完成。可对同一条个体多次重复测量，每次使用低剂量、无伤害性的麻醉剂或其他固定方法。如需进行长期观察，应采用持续麻醉系统12。</li>
</ol>

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<li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li>
<li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了演示将微粒注射到斑马鱼肾脏中的过程，我们使用了装载指示性染料的半透性微胶囊。因此，本方案包含了利用带相反电荷的聚电解质逐层组装技术制备微胶囊的操作说明7,8,15,16,17,18（图1A）。该技术的一个优势在于，仅需常规实验室设备即可轻松完成。根据所用条件和化合物的不同，所制备的微胶囊尺寸可在0.5至100 µm之间，其聚电解质壳层厚度为纳米级15。本文所述合成参数可获得弹性微胶囊，其由12层聚合物构成（此外还有一层最终的生物相容性涂层），尺寸约为2–6 µm（图&#160;1...

将微米级颗粒施用于动物体内，在药物和疫苗递送1、血管系统成像2、转基因细胞移植3以及微型光学传感器植入4,5等领域中是一项重要任务。然而，将微米级颗粒植入小型实验动物的血管系统操作较为困难，尤其对于结构精细的水生生物而言更是如此。对于斑马鱼等常用研究模型，建议通过视频实验方案来明确这些操作流程。
心脏内和毛细血管微注射需要经过培训的专业人员以及专门的显微外科设施，以将微小物体递送至斑马鱼血液中。此前，有研究建议采用眼后手动注射3&#160;作为递送完整细胞的一种简便且有效的方法。然而，根据我们的经验，由于眼部毛细血管网络区域较小，要通过该技术达到理想的注射效果需要大量练习。
本文介绍一种通过手动注射将微粒高效且稳定地植入成年斑马鱼肾脏组织（富含毛细血管和肾血管）从而进入循环系统的方法。该技术基于斑马鱼肾脏细胞移植的视频实验方案6，但省略了具有创伤性且耗时的显微外科操作步骤。本方法具有低死亡率（0–20%）和高成功率（70–90%）的特点，且仅需常规设备即可实施。
提出方案的一个重要部分是在鳃毛细血管中观察植入的微粒（如果微粒具有荧光性或带有颜色），这可以用于验证注射质量，对注射微粒的数量进行粗略的相对评估，并直接从循环血液中检测生理测量所需的光谱信号。作为所述技术可能应用的一个示例，我们展示了以下实验方案 体内 使用微胶囊化荧光探针 SNARF-1 测量斑马鱼血液 pH 值，最初由 Borvinskaya 提出 等 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-葡聚糖，70000 分子量</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>荧光探针。任何其他合适的聚合物结合的荧光染料均可作为微胶囊填充物</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素偶联物（FITC-BSA）</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>荧光探针</td></tr><tr><td>罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖（RITC-葡聚糖）</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>荧光探针</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>用于形成 CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 模板</td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>用于形成 CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 模板</td></tr><tr><td>聚（烯丙胺盐酸盐），分子量 50000（PAH）</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>阳离子聚合物</td></tr><tr><td>聚（苯乙烯磺酸钠），分子量 70000（PSS）</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>阴离子聚合物</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸 [20 kDa] 接枝聚乙二醇 [5 kDa]，接枝度 g = 3.0 至 4.5（PLL-g-PEG）</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>最终使用的聚合物，用于提高微胶囊的生物相容性</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>用于溶解所用聚合物</td></tr><tr><td>水净化系统</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>用于制备去离子水</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Stegler</td><td></td><td>用于 CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 模板的制备</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus 移液器，1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于溶液的加样</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus 移液器，10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于溶液的加样</td></tr><tr><td>移液器吸头，体积范围 200 至 1000 &amp;micro;L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>用于溶液的加样</td></tr><tr><td>移液器吸头，体积范围 0.1–10&amp;nbsp;&amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>用于溶液的加样</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge Microspin 12，高速离心机</td><td>BioSan</td><td></td><td>用于微胶囊的离心-洗涤步骤</td></tr><tr><td>微量离心管，2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>用于微胶囊的合成与储存</td></tr><tr><td>摇床 Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>用于减少微胶囊的聚集</td></tr><tr><td>超声清洗仪</td><td></td><td></td><td>用于减少微胶囊的聚集</td></tr><tr><td>耳机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于保护耳朵免受超声波影响</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>用于溶解 CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 模板</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>用于制备 pH 缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>用于制备 pH 缓冲液</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>用于调节 EDTA 溶液和缓冲液的 pH</td></tr><tr><td>恒温箱</td><td></td><td></td><td>用于在载玻片上干燥微胶囊</td></tr><tr><td>血细胞计数板（血球计数室）</td><td></td><td></td><td>用于检测所制备微胶囊的粒径分布和浓度</td></tr><tr><td>荧光显微镜 Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>用于活体观察鱼类血液中的微胶囊</td></tr><tr><td>SNARF-1 荧光滤光片组（应根据显微镜型号选择；此处提供示例）</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>用于带有荧光探针的微胶囊的可视化</td></tr><tr><td>光纤光谱仪 QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>用于在显微镜下对微胶囊进行校准</td></tr><tr><td>光纤 QP400-2-VIS NIR，400 &amp;mu;m，2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>用于连接光谱仪与显微镜端口</td></tr><tr><td>准直器 F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>用于连接光谱仪与显微镜端口</td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>用于在显微镜下对微胶囊进行校准</td></tr><tr><td>盖玻片，22 × 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>用于在显微镜下对微胶囊进行校准</td></tr><tr><td>玻璃毛细管 Intra MARK，10 &amp;micro;L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>用于采集鱼类血液</td></tr><tr><td>丁香油</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>用于鱼类麻醉</td></tr><tr><td>11 号采血针</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>用于切割鱼尾以及从胰岛素自动注射器尖端释放钢针</td></tr><tr><td>肝素，5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>用于处理在鱼类血液采集过程中所有与血液接触的表面</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH 计，配备微电极</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>用于测定鱼类血液的 pH 值</td></tr><tr><td>胰岛素笔用针头 Micro-Fine Plus，0.25 × 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>用于注射操作。任何细针（&amp;Oslash; 0.33 mm 或更小）均可适用</td></tr><tr><td>玻璃毛细管，1 × 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te GmbH &amp;amp; Co</td><td>9201075</td><td>用于注射操作</td></tr><tr><td>气体喷灯</td><td></td><td></td><td>用于将钢针焊接至玻璃毛细管</td></tr><tr><td>显微注射仪 IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>用于精确加样微胶囊悬浮液</td></tr><tr><td>培养皿，60 mm × 15 mm，聚苯乙烯材质</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>用于对麻醉状态下的鱼类进行操作</td></tr><tr><td>塑料勺</td><td></td><td></td><td>用于对麻醉状态下的鱼类进行操作</td></tr><tr><td>湿润海绵</td><td></td><td></td><td>用于对麻醉状态下的鱼类进行操作</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>用于去除鱼头上的鳃盖</td></tr><tr><td>巴斯德移液管，3.5 mL</td><td>BRAND</td><td>Z331767</td><td>用于湿润鱼鳃</td></tr></tbody></table>

利用肾脏注射法在小型鱼类循环系统中简便高效地施用和可视化微粒

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

将微米级颗粒系统性地注入活体生物体内，可用于血管可视化、药物和疫苗递送、转基因细胞移植以及微型光学传感器的植入。然而，在生物和兽医实验室中常用的实验小动物身上进行静脉内微注射操作非常困难，且需要经过专业培训的技术人员。本文展示了一种通过向鱼类肾脏注射，将微粒高效导入成年斑马鱼（Danio rerio）循环系统中的可靠方法。为在血管系统中可视化所引入的微粒，我们提出了一种在鱼鳃中进行的简单活体成像技术。体内监测斑马鱼血液pH值是通过注射包封的荧光探针SNARF-1实现的，以展示该技术的潜在应用之一。本文详细描述了pH敏感性染料的微胶囊化过程，并阐述了快速注射及在体内记录荧光信号时对所得微胶囊进行可视化的基本原理。该注射方法具有较低的死亡率（0–20%）和高操作成功率（70–90%），且仅需常规实验设备即可实施。所有所述操作均可推广应用于其他小型鱼类物种，如孔雀鱼和青鳉鱼。

所得结果来自本方案所述的三个主要类别之一：通过包封荧光染料形成荧光微粒（图1），将微胶囊注射至肾脏，随后在鳃部毛细血管中进行进一步观察（图 2 和 3）以及，最后， 体内 利用SNARF-1荧光光谱记录监测血液pH水平（图4).
采用逐层自组装方法，通过在包埋染料的模板CaCO3微球表面依次涂覆多层带相反电荷的聚合物（PAH和PSS），并在最外层修饰一层生物相容性聚合物（PLL-g-PEG），是一种简单且经济高效的封装多种荧光探针（如SNARF-1-葡聚糖、FITC-BSA或其他探针）的方法（图1A）。该方法最...

本文演示了将荧光微粒快速、微创注射至小型鱼类循环系统的基本原理及方法 体内 鱼类血液中微粒的可视化

微米级颗粒在活体内的系统性给药可用于血管系统成像、药物和疫苗递送、……

本实验的总体目标是演示一种通过向成年斑马鱼肾脏注射将微粒引入其循环系统的技术。通过一种简单的体内成像技术对斑马鱼鳃部进行观察，可进一步在血管系统中可视化这些引入的微粒。例如，该方法可用于通过引入包埋型荧光pH探针，在活体条件下对斑马鱼血液pH值进行重复测量。为此，首先采用逐层自组装方法，将与葡聚糖结合的pH敏感性染料SNARF-1包封在半透性聚电解质壳内。将荧光染料共沉淀至多孔的碳酸钙微核中，随后在微核表面交替包覆多层带相反电荷的非生物降解性聚合物，并在外层涂覆含有聚乙二醇的生物相容性聚合物。接着，溶解碳酸钙微核，从而获得完整包封SNARF-1的微胶囊。在鱼类麻醉与固定的第二阶段，将制备好的微胶囊直接注射到动物的肾脏中，以将包封的染料递送至鱼类的循环系统。接下来，需进行最小程度的手术以移除鳃盖，并暴露鱼鳃毛细血管。随后，可通过活体显微镜在体实时观察血液中的微胶囊，并记录荧光光谱，以监测血液pH值。当注射操作正确时，可在操作后立即观察到鱼鳃中的荧光微胶囊。可通过与荧光显微镜联用的光谱仪记录包封探针的荧光光谱。SNARF-1 具有两个发射峰，利用对应这两个峰的波长比值可测定 pH 值。该方案可将荧光微胶囊递送至鱼类循环系统，并远程监测活体鱼类血液中的荧光信号。在生理学研究中，该方法的主要优势在于能够对小型实验动物进行多次重复的血液参数测量，而这类操作通常难以实现。若使用光敏性荧光探针，建议在避光环境中进行整个操作过程。在快速搅拌下，将2毫升选定的聚合物结合荧光染料（此处为SNARF-1-葡聚糖）溶液与0.6毫升1摩尔的氯化钙溶液和0.6毫升1摩尔的碳酸钠溶液混合。在此步骤中，合成包封荧光染料的多孔碳酸钙微核。振荡5至10秒后，将悬浮液转移至2毫升微量离心管中，离心15秒，使碳酸钙微核沉淀。弃去上清液，用约两毫升去离子水洗涤微核，振荡重悬。重复离心和洗涤步骤三次。将悬浮液置于超声波水浴中孵育一分钟，以减少微核的聚集。将碳酸钙微核重悬于约两毫升浓度为每毫升四微克的阳离子聚合物PAH溶液中，以在模板上沉积第一层聚合物。将微核置于该pH溶液中，持续振荡约五分钟。经过15秒离心后，弃去含有未结合PAH的上清液，并通过多次离心和洗涤步骤，用纯水洗涤微核三次。用4毫克/毫升的阴离子聚合物PSS溶液重复上述步骤，以在模板上沉积第二层聚合物层。在添加下一层之前，建议在超声波浴中孵育1分钟。依次重复阳离子和阴离子聚合物的沉积过程六次，以获得具有12层结构的微胶囊壳。接下来，将带有外壳的微核与聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸在室温下孵育至少两小时。然后，通过连续的离心和重悬步骤，用纯水洗涤包被后的微核一次。最后，将碳酸钙模板溶解于2毫升浓度为0.1摩尔的EDTA溶液中（pH值调节至约7.1），以获得中空微胶囊。45秒离心后弃去上清液，用EDTA洗涤两次。45秒离心后弃去上清液，加入2毫升生理盐水。用生理盐水重复离心洗涤步骤三次。在荧光显微镜下使用血细胞计数板检测所制备微胶囊的粒径分布和浓度。使用 ImageJ 或同等软件对颗粒进行粒径分析。将获得的包封探针避光保存。准备光学系统时，根据所用荧光染料的特性，将相应的荧光滤光片组安装到荧光显微镜上，并打开荧光灯。将杠杆拉出至目镜端。将光纤一端连接到光谱仪，另一端连接到准直器。使用适配器，将准直器安装在荧光显微镜的相机筒或其他可用端口的焦平面上。为校准制备好的微胶囊，取约五微升微胶囊悬浮液滴加到显微镜载玻片上，并在避光处干燥液滴。打开光谱仪。运行光谱仪控制程序，并准备光谱仪以进行测量。为校准微胶囊化SNARF-1的光谱特性，使用一系列不同pH值的缓冲液。将约10微升的钠缓冲液滴加到含有SNARF-1的干燥微胶囊上，并盖上盖玻片。将载玻片放置在显微镜载物台上。使用约400倍的放大倍数定位微胶囊。将显微镜的杠杆切换至相机端口。使用光谱仪记录荧光信号。确保光谱信号远高于背景水平，并观察微胶囊是否未处于气泡中。避免对同一微胶囊长时间照射，因为SNARF-1对光漂白敏感。将杠杆转回目镜位置。计算封装的SNARF-1在质子化与去质子化染料发射峰波长处的荧光强度比值。根据该比值与介质pH值的依赖关系，绘制校准曲线。从安乐死的鱼类中采集约10微升血液。使用微电极通过pH计测定其pH值。然后将血液滴加到载玻片上含有干燥微胶囊的区域，并按照校准缓冲液的方法记录荧光强度的比值。由于需要考虑血液成分对包埋的SNARF-1检测信号的影响，应调整校准曲线的线性系数，使曲线与鱼血中的测量值相匹配。准备注射用针头时，用锋利的穿刺针去除胰岛素注射器前端的塑料部分，取出钢针。将该钢针插入玻璃微毛细管中至一半深度。使用燃气火炬快速而轻柔地进行焊接。将玻璃微毛细管连接至显微注射器，并用无菌水冲洗三次。确保液体能够顺利通过针头。用水填充系统，确保系统内无气泡。在实验当天，取已制备的微胶囊悬浮液，该悬浮液为含有无菌生理盐水的溶液，每微升含五十万至六百万个微胶囊。使用超声波清洗仪重悬1分钟。在后续注射过程中，定期振荡小瓶以重新悬浮微胶囊，防止其聚集。用勺子将鱼从麻醉液中取出，轻轻将其侧向放置在湿润的海绵上，若为右手操作则鱼头朝左，若为左手操作则鱼头朝右。注射前，用连接显微注射仪的玻璃毛细管吸入一到两毫米的空气。然后，加入约两微升分散的微胶囊。用非惯用手轻轻将鱼体固定在海绵上。找到鱼的侧线。将针头置于侧线腹部节段中点下方一毫升处。然后，通过刮擦动作将鱼鳞拨开，进行穿刺。将针头以与台面成45度角的方向插入动物体内。推动针头朝向脊柱，直至其轻轻接触脊柱。然后，缓慢向肾脏内注入约一微升的微胶囊悬浮液，并缓慢撤出针头。用流水从头部到尾部冲洗鱼类，以清除注射部位溢出的微胶囊。使用解剖剪去除鱼头的鳃盖，暴露鱼鳃。用水冲洗鳃部。使用勺子将鱼转移到显微镜载玻片上，并将其置于荧光显微镜的载物台上。进行以下操作时，务必确保鱼的鳃部不干燥。为此，需定期使用巴斯德移液管加水润湿鳃部。将房间变暗，使用低倍镜观察鳃部以寻找发出荧光的微胶囊。找到后，切换至高倍镜，并将目标移至视野中央。转动转接杆，使光路连接至光谱仪所在的端口。记录光谱信号。将杠杆转回目镜位置。对不同的微胶囊重复测量多次。将鱼转移至具有适当通气条件的水族箱中以恢复。通过重复使用麻醉剂或其它固定方法，可对同一个体进行多次测量。图中显示了利用包埋型荧光染料SNARF-1对斑马鱼血液及高碳酸血症进行活体测量的代表性示例。在对照条件下，注射微胶囊后四小时内血液 pH 值保持稳定，而暴露于高浓度二氧化碳五分钟则会导致鱼血酸化。操作过程中，应尽量减少因操作和手术给动物带来的应激反应。经过一定练习后，注射和信号记录平均仅需两到三分钟，因此本方案可在鱼类从轻度麻醉中苏醒前完成所有操作。在操作过程中，务必始终保持鱼类的鳃部湿润。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小型鱼类的循环系统中进行简单而有效的微粒植入。如视频所示，该技术非常适用于利用装载荧光探针的微胶囊对成年斑马鱼进行重复的活体血液 pH 值记录。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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