小鱼肾注射液循环系统中微粒的简易有效管理与可视化

该程序的总体目标是展示一种通过将微粒注射到鱼肾中将微粒引入成年斑马鱼循环系统的技术。通过鱼鳃中的简单活体成像技术，引入的微粒在脉管系统中进一步可视化。例如，该程序可用于通过引入用于 pH 值的微胶囊荧光探针在体内重复测量鱼血 pH 值。

为此，在第一阶段，使用逐层方法将与葡聚糖偶联的 pH 敏感染料 SNARF-1 封装在半透性聚电解质外壳中。荧光染料共沉淀成多孔碳酸钙微核，核涂有多层带相反电荷的不可生物降解聚合物，并顶涂含有聚乙二醇的生物相容性聚合物。接下来，分离碳酸钙核心以获得包含 SNARF-1 的整个微胶囊。

在鱼类麻醉和固定的第二阶段，将制备好的微胶囊直接注射到动物的肾脏中，以将包封的染料输送到鱼类循环系统中。接下来，需要进行最小手术来去除鱼鳃的鳃盖并去除毛细血管。然后，可以通过活体显微镜在体内进行血液中微胶囊的可视化和荧光光谱的记录，以监测血液的 pH 值。

当注射效果正确时，可以在手术后立即在鱼鳃中观察到荧光微胶囊。可以使用与荧光显微镜耦合的光谱仪记录封装探针的荧光光谱。SNARF-1 有两个发射峰，对应于这两个峰的两个波长之间的比率可用于测量 pH 值。

拟议的程序允许将荧光微胶囊输送到鱼循环系统中，并在体内远程监测鱼血中的荧光。在生理学研究的情况下，这种方法的主要优点是重复测量小型实验动物的血液参数，这通常很难进行。如果使用光敏荧光探针，建议在光线较暗的房间内进行整个过程。

在快速搅拌下，将两毫升选定的聚合物结合荧光染料 SNARF-1-葡聚糖溶液与 0.6 毫升一摩尔氯化钙溶液和 0.6 毫升一摩尔碳酸钠溶液混合。在此步骤中，合成了包裹荧光染料的多孔碳酸钙微核。搅拌 5 到 10 秒后，将悬浮液转移到 2 毫升微管中，离心 15 秒以沉淀碳酸钙微核。

弃去上清液，用约 2 毫升去离子水洗涤核心，然后摇动悬浮液。重复离心和洗涤程序 3 次。将悬浮液在超声波浴中孵育 1 分钟，以减少微核的聚集。

将碳酸钙微核重悬于每毫升 4 微克的阳离子聚合物 PAH 溶液中约 2 毫升，以将第一层聚合物沉积在模板上。将微核在 pH 溶液中保持约 5 分钟，并不断摇晃。离心 15 秒后，弃去含有未结合 PAH 的上清液，并通过多个离心和洗涤步骤用水洗涤微芯 3 次。

用每毫升 4 毫克的阴离子聚合物 PSS 溶液重复相同的程序，以将第二个聚合物层沉积在模板上。在添加下一层之前，建议在超声波浴中孵育 1 分钟。依次重复阳离子和阴离子聚合物的沉积 6 次，以获得 12 层微胶囊壳。

接下来，将微核与壳在聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸中孵育至少两个小时。然后，通过顺序离心和重悬用水清洗覆盖的微芯一次。最后，将碳酸钙模板溶解在两毫升 0.1 摩尔 EDTA 溶液中，调节 pH 值约为 7.1，以获得空心微胶囊。

离心 45 秒后弃去上清液，并用 EDTA 重复洗涤两次。离心 45 秒后弃去上清液，加入 2 毫升生理盐水。用生理盐水重复洗涤离心步骤三次。

在荧光显微镜下，在血细胞计数器中研究制备的微胶囊的尺寸分布和浓度。使用 ImageJ 或等效软件对颗粒进行粒度分析。将获得的封装探针置于黑暗中。

要准备光学系统，请根据所应用的荧光染料的特性将所需的一组荧光滤光片放入荧光显微镜上，然后打开荧光灯。将控制杆拉出接目镜。将光纤从一端连接到光谱仪，另一端连接到准直器。

使用适配器，在相机镜筒或荧光显微镜的其他可用端口的焦点上播放准直器。为了校准制备的微胶囊，将约 5 微升的微胶囊悬浮液放在显微镜载玻片上，并在黑暗处干燥液滴。打开光谱仪。

运行光谱仪控制程序，并准备光谱仪进行测量。为了校准微胶囊化 SNARF-1 的光谱特性，请使用一系列具有不同 pH 值的缓冲液。将约 10 微升钠缓冲液滴到含有 SNARF-1 的干燥微胶囊上，并用盖玻片盖住。

将载玻片放在显微镜载物台上。使用约 400 的放大倍率找到微胶囊。将显微镜杆转到相机端口。

用光谱仪注册荧光。确保光谱信号远高于背景水平，并观察微胶囊是否在气泡中。避免长时间照射相同的微胶囊，因为 SNARF-1 对光漂白敏感。

将控制杆转回目镜。计算封装的 SNARF-1 在对应于质子化和去质子化染料的发射峰的波长上的荧光强度比。构建比率依赖培养基 pH 值的校准曲线。

从安乐死的鱼中收集大约 10 微升的血液。通过带有微电极的 pH 计测定其 pH 值。然后，将血液滴到装有干燥微胶囊的载玻片上，并按照校准缓冲液的说明记录荧光强度的比率。

由于您应该考虑血液成分对封装 SNARF-1 读数的影响，因此调整校准曲线的线性系数，使曲线与鱼血中的测量值相匹配。要准备注射针头，请用锋利的柳叶刀去除塑料，从胰岛素注射器的尖端释放一根钢针。将针头插入玻璃微毛细管的一半。

用气体火炬快速、轻柔地焊接它。将玻璃微毛细管连接到显微注射器，并用无菌水冲洗 3 次。确保液体流过针头。

将系统注满水。确保系统中没有气泡。在实验当天，将制备好的微胶囊悬浮液放入无菌盐水中，每微升含有一半至六百万个微胶囊。

用超声波浴重悬一分钟。在随后的注射过程中，定期摇晃样品瓶以重悬微胶囊并防止其聚集。用勺子将鱼从麻醉剂中取出，然后轻轻地将其放在潮湿的海绵上，横向放置，右撇子则头部向左，左撇

在注射前，将 1 到 2 毫米的空气吸入与显微注射器连接的玻璃毛细管中。然后，用大约 2 微升分散的微胶囊加载它。用非惯用手轻轻地将鱼的身体稳定在海绵上。

找到鱼的侧线。将针头放在侧线腹段中点下方 1 毫升处。然后，通过刮擦动作，将鱼鳞移到一边，并进行穿孔。

将针头以与桌面成 45 度角的方式插入针头。将针头推向脊柱，直到它小心地靠在脊柱上。然后，慢慢将大约 1 微升的微胶囊悬浮液释放到肾脏中，然后慢慢抽出针头。

用水流从头到尾冲洗鱼，以去除注射部位溢出的微胶囊。用解剖剪刀去除鱼头上的鳃盖，并剥去鱼鳃。用水冲洗鳃。

用勺子将鱼转移到显微镜载玻片上，然后将其放在荧光显微镜的载物台上。当您执行以下程序时，请确保鱼的鳃不会变干。为此，请使用巴斯德移液器定期用水润湿它们。

将房间调暗，并使用低放大倍率检查鳃以查找荧光微胶囊。找到它后，将镜头切换到更高的幅度，并将其放置在视野的中心。将控制杆转动到已连接光谱仪的端口。

记录频谱信号。将控制杆转回目镜。对不同的微胶囊重复测量几次。

将鱼转移到水族箱中，适当通风以进行恢复。使用重复麻醉或其他固定方法，可以为一个人重复测量程序多次。该图显示了通过封装荧光染料 SNARF-1 对斑马鱼血液和高碳酸血症进行体内测量的代表性示例。

在对照条件下，注射微胶囊后 4 小时内血液 pH 值保持稳定，而在高二氧化碳下暴露 5 分钟会导致鱼血酸化。在执行该程序时，重要的是要尽量减少处理和手术造成的动物压力。通过一些练习，注射和信号记录平均需要大约两到三分钟，因此该协议允许在鱼从轻度麻醉中醒来之前完成作。

在此过程中，请确保鱼的鳃始终湿润。看完这个视频，你应该对如何简单有效地将微粒植入小鱼的循环系统有了很好的了解。正如所证明的，该技术非常方便使用充满荧光探针的微胶囊重复记录成年斑马鱼的血液 pH 值。