Name: 利用微流控平台的高通量蛋白质表达发生器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习利用微流控平台的高通量蛋白质表达技术，通过PDMS装置与微机械阀控制数千个反应室，实现无需纯化步骤的模块化蛋白质阵列制备。该方法适用于多种蛋白质文库研究。

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本工作得到玛丽·居里国际回归基金的资助。

1. 器件制备
<ol>
 <li>从斯坦福微流控制造中心（<a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu/group/foundry</a>）购买DTPA-D SU-8控制层模具和SPR220-7流体层模具。</li>
 <li>将硅胶模具暴露于三甲基氯硅烷（TMCS）蒸气中10分钟，以促进烘烤步骤后弹性体的脱模9。</li>
 <li>分别按5:1和20:1的比例配制用于控制层和流体层的硅基弹性体与固化剂的混合物（充分混合）。不同比例对于多层之间的正确键合是必要的。</li>
 <li>将5:1的PDMS浇注在控制层上（厚度约5 mm）。对控制层进行脱气处理，并在80 °C下烘烤30分钟。将20:1的PDMS混合物在流体层上以2,600 rpm转速旋涂（Laurell，美国）60秒，随后在80 °C下烘烤30分钟。旋涂速度已优化，以实现在15 psi压力下的阀门驱动。转速越快，形成的层越薄，激活压力越低；反之亦然。我们所使用的器件在控制层最大耐压为25 psi，在流体层为10 psi，超过此压力可能导致器件从基底上脱离。</li>
 <li>将控制层从模具上缓慢分离，注意不要撕裂SU8图案。然后沿器件边缘裁剪，并打孔以接入控制通道。</li>
 <li>在体视显微镜下手动对齐流体层和控制层。首先对齐左上角；按钮阀（控制层）必须位于反应腔室（流体层）的中央。接着对齐第一行，并逐行轻轻释放控制层。确保所有按钮阀均位于反应腔室的中央，且寻址阀和输入阀在正确位置与流道相交。该过程可在局部重复，直至所有行均对齐。最后，从边缘和角落小心抬起PDMS以释放其内部张力。切勿抬得过高，以免造成错位。</li>
 <li>在80 °C下烘烤2小时。</li>
 <li>沿器件边缘裁剪，并将双层器件（芯片）从流体模具上剥离。打孔以接入流体通道（图1）。</li>
</ol>
2. DNA 点样与装置对准
<ol>
 <li>通过组装PCR合成基因。合成基因由T7启动子、核糖体结合位点（RBS）、带有两个表位标签（每端各一个）的开放阅读框（ORF）以及T7终止子4组成。这些基因长度可变，范围从100 bp至至少5,000 bp。</li>
 <li>准备用于点阵的合成基因：配制含聚乙二醇（1.25%）和D-海藻糖二水合物（125 mg/ml）的混合液，并将2 μl该溶液分装至384孔板的每个反应孔中。该溶液可减少DNA向玻璃表面的不可逆结合，并有助于在对准时进行可视化观察10。</li>
 <li>将合成基因转移至384孔板中。通常DNA终浓度范围为10 ng/μl至100 ng/μl。加入dH2O至终体积为20 μl（根据微阵列点样仪和针头类型而定）。</li>
 <li>使用微阵列点样仪将一系列合成基因点样到环氧涂层的玻璃基片上。我们使用Bio Robotics公司的MicroGrid 610仪器和Parallel Synthesis（美国）的SMT-S75硅胶针头。使用这些特定针头进行接触式打印，可在玻璃表面形成直径约100 μm的点样斑点。每针次加载的样品量可支持约100个点样位点。确保列间距和行间距与所用设备匹配。我们使用的设备具有16列和40行，列间距和行间距分别为680 μm和320 μm。</li>
 <li>在体视显微镜下手动将微流控装置与基因阵列对齐。DNA斑点应位于DNA反应室的中央。首先将第一排斑点定位在第一排DNA反应室的下方，开始对齐；然后依次对齐其余各排，最后对整个装置进行微调。完成阵列对齐后，应通过局部抬起的方式释放PDMS中的应力。若PDMS中残留张力，则可能无法与微阵列良好结合。</li>
 <li>最后，将装置置于80 °C加热板上孵育过夜，使其与玻片牢固结合。</li>
</ol>
3. 启动并激活设备
<ol>
 <li>使用 LabVIEW 通过计算机控制控制层中的阀门。LabVIEW 脚本通过电子控制箱（购自 Stanford Microfluidics Foundry）控制一系列电磁微阀。电磁阀歧管连接至压缩空气，用于调节进入装置控制阀的气流和压力。</li>
 <li>使用内径为 0.02" 的柔性塑料管（Tygon）和不锈钢针（New England Small Tubes Corporation）将装置连接至电磁阀歧管。</li>
 <li>用去离子水（DDW）填充管道，并将针插入控制层的接入孔中。确保每根管道连接到其对应的控制通道。</li>
 <li>在计算机上运行 LabVIEW 程序以激活控制通道。通过 LabVIEW 脚本激活阀门时，施加空气压力，从而推动水进入 PDMS 控制通道。将气压设定为 5 psi。建议首先填充“三明治”结构和寻址阀门，以检测存在缺陷的装置中控制通道之间的串扰。若存在串扰，激活“三明治”控制线将导致颈部或按钮控制线也被激活，类似于电路中的短路。具有串扰的装置为不合格品，不可使用。</li>
 <li>当所有控制通道和阀门均充满去离子水（DDW）后，阀门即完成预启动，可准备阻断其下方的流体通道。将气压升高至 15 psi。阀门的启闭由 LabVIEW 程序通过一组连接至各个电磁阀的开关进行控制。每个开关通过其对应的电磁阀控制一条特定的控制线。在脚本中打开开关按钮，将向相应管道施加气压，气压推动控制线中的 DDW，导致微流控阀门膨胀，从而阻断其下方的通道；关闭控制阀则释放气压，随之解除对相应流体通道的阻断。</li>
 <li>为确保所有阀门处于开启状态，将一根管道连接至其中一个流体入口，并在 4–5 psi 压力下向装置通入空气。这将释放可能粘附在玻璃片上的阀门。</li>
 <li>最后，装置已完成预启动并准备就绪。关闭所有输入阀和“颈部”阀门，以开始表面化学反应。</li>
</ol>
4. 表面化学
<ol>
 <li>为了促进蛋白质阵列在表面的自组装并防止微流控装置内部发生非特异性吸附，需对表面进行化学修饰：</li>
 <li>将含有所需溶液的新管路连接至装置中的一个流道，以使组分流经装置；再将管路的另一端连接至手动多通阀，并开启气压驱动流（5 psi）。</li>
 <li>取40 μl生物素化BSA（1 μg/μl）加入新管中，并将其中约一半溶液以20分钟时间流经装置，BSA将与环氧基表面结合。</li>
 <li>在每一步不同的表面化学反应之间，使用Hepes缓冲液（50 mM）清洗未反应的底物。</li>
 <li>将25 μl链霉亲和素（0.5 μg/μl）溶液流经已结合生物素化BSA的表面，持续20分钟。</li>
 <li>用Hepes缓冲液清洗5分钟。</li>
 <li>关闭“按钮”阀，将剩余的生物素化BSA（如上所述）流经装置，以钝化“按钮”周围区域的表面。</li>
 <li>用Hepes缓冲液清洗5分钟。</li>
 <li>释放“按钮”阀，将30 μl五聚组氨酸-生物素（penta-His-biotin，0.16 μg/μl）溶液以20分钟时间流经装置。抗体将结合至暴露的链霉亲和素上，特异性地在“按钮”下方区域形成抗His标签蛋白阵列。</li>
</ol>
5. 蛋白质表达
<ol>
 <li>利用兔网织红细胞快速偶联转录与翻译反应在芯片上表达蛋白质。芯片上点样的合成基因可表达产生可用于后续实验的蛋白质阵列，例如用于蛋白质结合筛选实验。</li>
 <li>打开“颈”部阀门，将兔网织红细胞快速偶联转录与翻译反应液注入芯片并流经DNA反应室。随后关闭“三明治”阀门，使每个基因与其周围环境隔离。将芯片置于30 °C加热板上孵育2.5小时。表达的蛋白质将通过开放的“颈”部阀门从DNA室自发扩散至反应室，并在“按钮”阀门下方与抗-His抗体结合，从而通过其C端标签将蛋白质固定。</li>
 <li>使用C-myc Cy3抗体对蛋白质进行标记。该抗体将结合于蛋白质N端的相应表位。</li>
 <li>使用微阵列扫描仪（LS Reloaded, Tecan），在532 nm激发激光和575 nm发射滤光片条件下测定蛋白质表达水平。</li>
</ol>
6. 代表性结果
1. 器件制备
根据实验需求，使用 AutoCAD 创建了该装置的图形设计。该设计通过高分辨率照相排版机打印在透明薄膜上。此透明膜在接触式光刻中用作光掩模。采用表面微加工技术，在硅片上制备出由所用掩模上刻写的图案决定的三维模板。
微流控装置通过在硅胶模具上浇铸硅基弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS，SYLGARD 184，Dow Corning，美国）制备而成（图1）。每个装置由两层对齐的PDMS层组成，分别为流体层和控制层。模具首先暴露于三甲基氯硅烷（TMCS，Aldrich）蒸气中10分钟，以促进烘烤步骤后弹性体的脱模。分别以5:1和20:1的比例配制硅基弹性体与固化剂的混合物，用于控制层和流体层的模具。控制层经脱气处理后，在80 °C下烘烤30分钟。流体层最初以2,600 rpm的转速旋涂（Laurell，美国）60秒，并在80 °C下烘烤30分钟。将控制层从其模具上剥离，并打孔以形成控制通道的通路孔。随后，在体视显微镜下手动对齐流体层与控制层，并在80 °C下烘烤2小时。将双层装置从流体模具上剥离，并打孔以形成流体通道的通路孔。
2. 设备描述
 该装置的容量范围可从500到10,000个单元细胞（图2）。装置由两层组成：流体层（灰色）和控制层（彩色）。控制层包含多种具有不同功能的阀门。流体层中的每个单元细胞由一个DNA室和一个反应室组成，并由三种类型的微机械阀门进行控制：‘颈’阀、‘按钮’阀和‘三明治’阀（图2A）。沉积在DNA室内的点状“合成基因”被‘颈’阀（绿色）阻隔在反应室之外。反应室中表面结合蛋白的捕获和机械清洗由‘按钮’阀（蓝色）完成。‘三明治’阀（红色）确保每个反应在各自的单元细胞中独立进行。寻址阀门可将装置分割为最多8个独立区域，用于不同条件的检测。此外，控制层包含输入阀门，可使选定的液体流入流体层。PDMS控制通道中充满去离子水（DDW）。当阀门被激活时，压力升高（15 psi），导致PDMS膨胀。在膜足够薄的位置（即控制通道与流体通道交叉处），这种膨胀足以完全阻断流体通道。单元细胞的平均高度为10 μm，平均体积小于1 nl。
3. 蛋白质表达与检测
使用兔网织红细胞快速偶联转录与翻译反应（Promega）在装置上表达蛋白质。所表达的蛋白质形成可用于结合筛选的蛋白质阵列（图3）。将12.5 μl表达混合物加载至装置中，随后通过打开“颈部”阀门将其充满至DNA腔室。接着关闭“三明治”阀门，使每个单元腔室与其相邻腔室相互隔离，并将装置置于加热板上于30 °C孵育2.5小时。表达的蛋白质从基因腔室扩散至反应腔室，其C端His标签可与位于“按钮”阀门下方固定的抗His抗体（Qiagen）结合，从而将蛋白质固定于表面。蛋白质通过C-myc Cy3（Sigma）进行标记，该标记物结合于蛋白质N端的相应表位并使其显色。使用微阵列扫描仪（LS Reloaded, Tecan），采用532 nm激光和575 nm滤光片测定蛋白质表达水平。最终获得的蛋白质阵列显示出不同水平的蛋白质表达。通常，约20%的基因文库无法表达至可检测水平。未观察到蛋白质大小与表达水平之间的相关性3。通过未点样DNA的腔室测定背景信号水平。因此，相应蛋白质腔室的信号来源于噪声或标记抗体的非特异性吸附。
<img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="经TMCS处理的静态平衡过程流程图；显示表面处理中温度的影响" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 芯片制备。 （A）模具用TMCS蒸气处理10分钟。（B）将PDMS浇铸在对照和流体硅模具上。（C）将对照和流体模具在80 °C下烘烤30分钟。（D）将对照层从模具上剥离，裁剪至合适尺寸，并打孔形成对照入口。（E）在体视显微镜下将对照层与流体层对齐，然后在80 °C下烘烤2小时。在PDMS器件制备的同时，将一系列合成基因微阵列点样到环氧涂层的玻璃基底上（CEL Associates）。（F）随后将器件与DNA微阵列对齐，使“合成基因”被捕获于DNA反应室中。
<img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="芯片实验室微流控示意图；DNA反应室、阀门控制、基因点样装置。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. PING装置的照片。 （A）该装置由两层对齐的PDMS层（控制层和流体层）组成。流体层包含平行的DNA通道和反应室（灰色），由控制层中的微机械阀门（“按钮”、“三明治”和“颈”）进行控制。（B）将这两层与一张打印好的微阵列对齐，使每个DNA腔室对应一个单独的点位，从而消除任何潜在的污染。
<img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="DNA 微阵列示意图，展示转录和翻译过程及荧光蛋白检测。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 使用微流控芯片制备的蛋白质微阵列的荧光图像。 打印的斑点基因在装置内（DNA 反应室中）表达为蛋白质，并通过其C端His标签被捕获至表面（位于反应室中“按钮”阀下方）。蛋白质表达通过其N端C-myc标签及特异性荧光抗体进行检测。不同的信号强度表示不同的蛋白质表达水平。未打印斑点的反应室作为背景信号的对照。

<ol><li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+Microfluidic+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li>
<li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanoliter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li>
<li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li>
<li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li>
<li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li>
<li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li>
<li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li>
<li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supports+for+microarray+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+recognition+JMR%22%5BJournal%5D)">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li>
<li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428(2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了一种利用微流控平台高通量生成蛋白质芯片的方法。该芯片的制备基于DNA模板的微阵列打印， 体外 微流控装置内DNA的蛋白表达 
我们新型的微流控平台相较于目前常用的方法具有多项重要优势，使其成为蛋白质组学领域一种前景广阔且通用的工具。其中一个优势在于膜结合蛋白。 体外 在微粒体膜存在下利用哺乳动物网织红细胞裂解物进行蛋白质合成11 提供膜蛋白所需的“类天然”环境。此外，微流控技术可在极小体积下实现蛋白质表达，且无需进行蛋白质纯化，而这正是传统方法中最常见的瓶颈。事实上，通过匹配蛋白质的优化条件，可进一步提升其性能。 体外 将细胞裂解液加入蛋白质中，例如 E. coli 用于细菌蛋白的裂解液。
微流控技术能够在极小体积下实现蛋白质表达。在我们的具体示例中，反应腔室体积为 1 nl。小体积具有两个优势：显而易见的是试剂消耗量更低，并能够处理稀有材料（例如膜蛋白）；另一个重要优势是，在如此小的体积中利用抗体将蛋白质富集在表面，可使相...

<table><tbody><tr><td>PDMS- SYLGARD 184</td><td>Dow Corning USA</td><td>ESSEX-DC</td><td></td></tr><tr><td>氯三甲基硅烷（TMCS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C72854</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂涂层玻璃基片</td><td>CEL Associates USA</td><td>VEPO-25C</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>海藻糖二水合物（D-trehalose dihydrate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的牛血清白蛋白（Biotinylated-BSA）</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>PIR-29130</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素（Neutravidin）</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>31050</td><td></td></tr><tr><td>五聚组氨酸生物素化探针（penta-His-biotin）</td><td>Qiagen</td><td>34440</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td><a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;amp;bsp=13384" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biological Industries</a></td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>TNT-T7</td><td>Promega Corp.</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>c-myc Cy3 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>控制箱</td><td>Stanford Microfluidics Foundry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>模具</td><td>Stanford Microfluidics Foundry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>New England Small Tubes Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon 微孔管</td><td>Tygon</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>微阵列点样仪</td><td>Bio Robotics</td><td>MicroGrid 610</td><td></td></tr><tr><td>硅胶针头</td><td>Parallel Synthesis</td><td>SMT-S75</td><td></td></tr></tbody></table>

基于微流控平台的高通量蛋白质表达仪

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

快速发展的领域（如系统生物学）需要开发和应用新技术，以实现对大型系统的高通量和高保真度测量。微流控技术有望满足其中诸多需求，例如在芯片上进行高通量筛选实验，涵盖生化、生物物理以及基于细胞的检测方法1自微流控装置问世以来，该领域已取得巨大发展，推动了微流控大规模集成技术的进步2,3该技术可在具有邮票大小占地面积的单个装置上集成数千个微机械阀门（图1我们开发了一种用于生成的高通量微流控平台 体外 蛋白质阵列表达图2）名为PING（蛋白质相互作用网络生成器）。这些阵列可作为多种实验的模板，例如蛋白质-蛋白质 4蛋白质-RNA5 或蛋白质-DNA6 相互作用。
该装置由数千个反应腔室组成，可使用微阵列仪对每个腔室进行独立编程。将打印的微阵列与微流控装置对齐后，可使每个腔室仅包含一个点样位点，从而消除潜在的污染或交叉反应。此外，采用标准的微阵列点样技术制备微阵列具有高度模块化的特点，可实现蛋白质7、DNA8、小分子甚至胶体悬浮液的阵列化。微流控技术对生物科学的潜在影响十分显著。已有多种基于微流控的检测方法为生物系统的结构与功能研究提供了新的见解，而微流控领域将继续推动生物学的发展。

我们介绍一种用于蛋白质阵列表达的微流控方法。该装置由数千个由微机械阀门控制的反应腔室组成。微流控装置与打印有基因文库的微阵列相结合，这些基因在芯片上进行转录和翻译，从而生成可用于实验的蛋白质阵列。

快速发展的领域（如系统生物学）要求开发和应用新技术，以实现高通量和……

本实验的总体目标是构建一种模块化蛋白质阵列，无需纯化步骤，因而可与任何蛋白质文库兼容。该目标首先通过组装PCR生成合成基因来实现，随后将合成基因点样到环氧基载玻片上。使用PDMS与硅胶控制和流动模具制备微流控装置。然后将微流控装置与点样DNA微阵列对齐。最后将兔网织红细胞裂解液注入微流控装置，表达蛋白质。最终可以获得通过荧光抗体标记显示的数千种蛋白质的表达结果。与现有的蛋白质微阵列等方法相比，基于微流控的技术具有多个优势。我们在芯片上微阵列DNA，然后利用细胞系统在装置上合成蛋白质。因此，我们无需进行蛋白质纯化，且蛋白质始终不会干燥，整个实验过程中均保持新鲜状态。微流控技术还具有更高的灵敏度。为制备微流控装置，需将硅胶控制层和流道模具暴露于三甲基氯硅烷蒸气中10分钟，以促进弹性体脱模。烘烤步骤完成后，分别按5:1和20:1的比例将硅基弹性体与固化剂混合，用于控制层和流体层模具。将5:1的PDMS倒入控制层中。对控制层进行脱气处理，并在80°C下烘烤30分钟。接下来，将20:1的PDMS混合物以2,600 RPM转速在流体层上旋涂60秒，然后在80摄氏度下烘烤30分钟。缓慢将控制层从模具上分离，注意不要剥离SU-8图形。随后使用手术刀在显微镜下沿器件边缘切割，并用钝针打孔以接入控制通道。从左上角开始，手动对准流体层和控制层，将控制层上的按钮阀置于反应室的中央。接着，对齐第一行，并逐行轻轻放下控制层。确保所有按钮阀均位于反应室的中央，且寻址阀和输入阀在正确位置与流体通道相交。局部重复此过程，直至所有行均对齐。完全对齐后，从 PDMS 的侧面和角落小心地将其抬起，以释放其中的任何张力。然后在烘烤后于 80 摄氏度下烘烤该装置两小时。沿外周切割并从流动模具的穿孔处剥离双层装置，以接触流道，从而为该装置生成DNA构建体。进行PCR以合成包含T7启动子、核糖体结合位点、开放阅读框（两端带有不同表位标签）以及T7终止子的合成基因。为准备将合成基因点样至阵列，配制聚乙二醇与D-甘油醛-3-磷酸二水合物的混合物，并将每反应2微升分装至384孔板的孔中。孔板。将合成基因加入384孔板中，然后加入蒸馏水至终体积为20 µL。接下来，使用微阵列点样器将一系列合成基因点样到环氧基修饰的玻璃基底上。在体视显微镜下，手动将微流控装置与基因阵列对齐，使DNA点位于DNA腔室的中央位置，然后依次对齐其余各行。最后对整个装置进行微调，以消除PDMS上的任何应力，并确保其与微阵列良好粘合。局部抬起装置。最后，将装置置于80摄氏度的加热板上孵育过夜，使其与玻片牢固粘合。本节使用食用染料以实现可视化。控制层中的阀门通过计算机使用 LabVIEW 进行驱动。LabVIEW 脚本通过电子控制箱控制一系列电磁微阀。电磁阀歧管连接至压缩空气，用于控制进入装置上控制阀的气流和压力。使用内径为0.02英寸的柔性塑料管和不锈钢针，将装置连接到电磁阀歧管。用双蒸水充满管道，并将针插入控制层的通路孔中。确保每个管子都连接到其对应的控制通道。为激活控制通道，运行 LabVIEW 应用程序，将气压设置为 5 PSI，然后通过 LabVIEW 脚本激活阀门施加气压。这会将水压入 PDMS 控制通道，以检测有缺陷器件的控制通道之间是否存在潜在的串扰。首先填充三明治结构和地址阀门。毕竟，控制通道和阀门内部充满水，需对阀门进行预充液，以阻断其下方的流动通道。首先将空气压力增加至 15 PSI，然后通过连接至各个电磁阀的一组开关，在实验室视图程序中进行操作。通过打开所有开关按钮来启动全部阀门，确保所有阀门均处于开启状态。将一根管子连接到其中一个流量输入口，并以4至5 PSI的压力向装置通入空气。这将使玻璃载片上粘连的阀门松脱。该装置现已完成预处理，可进行可视化操作。本节使用黄色食用染料来观察试剂，无色溶液代表“嬉皮士”，以促进蛋白质阵列在表面的自组装，并防止微流控装置内的非特异性吸附。首先将一根新管子连接所需溶液后接入装置的任一流通通道，以化学方式修饰表面。然后将管子的另一端连接至手动多通阀，并打开气压驱动流。在新离心管中加入40 µL生物素化的BSA，并将其中约一半样品以50 mmol/L HEPES缓冲液为流动相，流经装置20分钟。每步之间均使用50 mmol/L HEPES缓冲液冲洗，以去除未反应的底物。接下来，将25 µL链霉亲和素以50 mmol/L HEPES缓冲液为流动相，流经装置20分钟。在生物素化的 BSA 上用 HEPES 缓冲液冲洗五分钟，以清洗按钮周围表面，关闭按钮阀门并流过剩余的生物素化 BSA，然后再次用 HEPES 缓冲液冲洗五分钟。最后，为了在按钮下方形成抗 His 标签阵列，打开按钮阀门并注入 30 微升 Penta-His 生物素溶液，反应 20 分钟，从而在装置上形成蛋白质阵列。打开颈部阀门并流过兔网织红细胞裂解液。通过装置将快速偶联的转录和翻译反应溶液注入DNA室。接着，关闭三明治阀，将每个基因与其环境隔离，并将装置置于30摄氏度的加热板上孵育2.5小时。然后用C mix SI三抗体标记蛋白质的末端终止位点。最后，使用配备532纳米激光器和575纳米发射滤光片的微阵列扫描仪，测定蛋白质水平。该图显示了蛋白质芯片上不同蛋白质的表达水平。通常，基因文库中有20%的基因无法表达至可检测水平。背景信号水平是通过未点样DNA的反应室确定的。因此，相应蛋白质反应室中的信号来源于噪声或标记抗体的非特异性吸附。如果操作得当，设备验证需要四小时，芯片实验需要五小时。

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