利用微流控平台的高通量蛋白质表达发生器
August 23rd, 2012
我们提出了一个表达的蛋白质阵列微流控方法。该装置由反应室的数以千计的由微机械阀控制。的微流体装置相配合以印刷的微阵列的基因库。然后，这些基因的转录和翻译的片上，所得的蛋白质阵列中准备实验使用。
该程序的总体目标是创建一个不需要纯化步骤的模块化蛋白质阵列，使其与任何蛋白质文库兼容。这是通过首先通过组装 PCR 生成合成基因来实现的。接下来，将合成基因排列在环氧树脂载玻片上。
要制造微流体装置，请使用带有硅胶控制和流动模具的 PDMS。然后将微流控装置与斑点 DNA 阵列对齐。最后，兔网织红细胞裂解物流入微流控装置并表达蛋白质。
最终，可以通过荧光抗体标记获得显示数千种蛋白质表达的结果。与蛋白质微阵列等现有方法相比，使用基于微流体的技术有几个优势。我们对 DNA 进行微阵列，然后使用细胞在设备上制造蛋白质。
因此，我们不需要蛋白质纯化，并且蛋白质永远不会干燥。它们在整个实验过程中保持新鲜。微流体技术还提供更高的灵敏度 要制造微流体装置，请将硅胶控制和流动模具暴露在氯三甲基硅烯蒸汽中 10 分钟，以促进弹性体释放。
烘烤步骤后，分别为控制和流模准备 5 比 1 和 20 比 1 两种不同比例的硅基弹性体和固化剂混合物。将 5 比 1 的 PDMS 倒入控制层。对控制层进行脱气，并在 30 摄氏度下烘烤 80 分钟。
接下来，以 2， 600 RPM 的速度将 20 比 1 的 PDMS 混合物旋涂在流动层上 60 秒，然后在 80 摄氏度下烘烤 30 分钟。慢慢地将控制层与模具分开，注意不要剥落 SU 8 模型。然后用手术刀在设备周边切开，用钝针打孔，在显微镜下进入控制通道。
从左上角开始手动对齐流向层和控制层，并将按钮阀定位在反应室中间的控制层上。接下来，对齐第一行并逐行轻轻释放控制层。确保所有按钮阀都位于反应室的中间，并且地址阀和输入阀在正确的位置穿过流道。
在本地重复该过程，直到所有行都对齐。完全对齐后，小心地从侧面和角落提起 PDMS 中，释放 PDMS 中的任何张力。然后在烘烤后将设备在 80 摄氏度下烘烤两个小时。
切开周边，从流模打孔中剥离两层装置，以进入流道，为装置生成 DNA 构建体。进行 PCR 以产生由 T 7 启动子、核糖体结合位点、两端具有不同表位标签的开放阅读框和 T 7 终止子组成的合成基因。为了准备用于排列的合成基因，制备聚乙二醇和 D 二水合丙糖的混合物 每个反应将 2 微升分配到 384 的孔中。
孔板。将合成基因添加到 384 孔板中。然后加入蒸馏水至最终体积为 20 μL。
接下来，使用微阵列点，将一系列合成基因放在环氧树脂涂层的玻璃基板上。在立体镜下，手动将微流体装置与基因阵列对齐，DNA 点位于 DNA 室的中间。然后将其余行对齐。
最后对整个设备进行微调，以减轻 PDMS 上的任何压力，并确保其与微阵列良好结合。在本地提升它。最后，通过在 80 摄氏度的热板上孵育过夜，将设备粘合到载玻片上。
本部分使用 Food Dyes 进行可视化。控制层中的阀门使用实验室视图从计算机启动。实验室视图脚本通过电子控制箱控制一系列电磁微型阀。
电磁阀歧管连接到压缩空气，压缩空气控制进入设备上控制阀的气流和压力。使用内径为 0.02 英寸的柔性塑料管和不锈钢销，将设备连接到电磁阀歧管。用双蒸水填充试管，然后将销钉插入控制层的检修孔中。
确保每个管子都连接到其相应的控制通道。要激活控制通道，请运行实验室视图应用程序，将气压设置为 5 PS。然后，我通过从实验室视图脚本激活阀门来施加气压。这会将水推入 PDMS 控制通道，以识别有缺陷设备的控制通道之间的潜在串扰。
首先填充三明治和地址阀。毕竟，控制通道和阀门充满了水，灌注阀门以堵塞它们下面的流道。首先将气压增加到 15 PSI，然后在实验室视图中通过一组连接到各个电磁阀的开关进行查看程序。
通过打开所有开关按钮来激活所有阀门，以确保所有阀门都打开。将管子连接到其中一个流量输入，然后以 4 到 5 PSI 的速度将空气流入设备。这将从载玻片上释放任何粘性阀门。
该设备现已准备就绪，可用于可视化目的。黄色食用染料用于可视化本节中的试剂，无色溶液代表嬉皮士，以促进蛋白质阵列在表面上的自组装并防止微流体装置内的非特异性吸收，首先将带有所需溶液的新管连接到装置中的流道之一，从而对表面进行化学改性。然后将管子的自由侧连接到手动歧管并打开气压流。
将 40 μL 生物素浸渍的 BSA 加载到新试管中，其中大约一半的 BSA 流过设备 20 分钟。使用 50 毫摩尔嬉皮士洗去每个步骤之间任何未反应的底物。接下来，将 25 μL 链霉亲和素流淌 20 分钟。
在生物素浸泡的 BSA 上，用 hees 洗涤 5 分钟以吃掉按钮周围的表面，关闭按钮阀并流出剩余的生物素化 BSA，然后再次用豌豆洗涤 5 分钟。最后，要在按钮下方创建抗嘶嘶声标签阵列，松开按钮阀并流出 30 μL Penta 嘶嘶声生物素 20 分钟，以在设备上形成一系列蛋白质。打开颈部瓣膜，流出兔网织红细胞。
通过设备将快速偶联的转录和翻译反应溶液导入 DNA 腔室。接下来，关闭夹心阀，将每个基因与其环境分离，并将设备在 30 摄氏度的热板上孵育 2.5 小时。然后用 C mix SI three 抗体标记蛋白质的末端。
最后，使用带有 532 纳米激光器和 575 纳米发射滤光片的微阵列扫描仪。确定蛋白质水平。该图显示了蛋白质阵列上不同水平的蛋白质表达。
通常 20% 的基因文库无法表达到可检测的水平。使用未用 DNA 点样的腔室测定背景水平。因此，来自相应蛋白室的信号是由于标记抗体的噪声或非特异性吸收引起的。
如果执行得当，该设备验证需要 4 小时，芯片实验需要 5 小时。
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概述
本研究提出了一种微流控技术，用于蛋白质阵列的表达，利用一个由微机械阀门控制的具有数千个反应室的装置。集成印刷的微阵列基因库允许在芯片上进行转录和翻译，从而生成一个即用型蛋白质阵列。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 蛋白质表达
- 基因库
背景
- 蛋白质阵列对各种生物学分析至关重要。
- 传统方法通常需要纯化步骤，限制了兼容性。
- 微流控装置可以简化蛋白质表达的过程。
- 组装PCR用于生成用于阵列的合成基因。
研究目的
- 创建不需要纯化步骤的模块化蛋白质阵列。
- 提高与任何蛋白质库的兼容性。
- 使用微流控技术提高蛋白质表达的效率。
使用的方法
- 通过组装PCR生成合成基因。
- 在环氧树脂载玻片上阵列合成基因。
- 使用PDMS制造微流控装置。
- 将兔网状细胞溶质流入装置以进行蛋白质表达。
主要结果
- 成功创建了一个功能性的微流控装置。
- 在芯片上无需纯化即可表达蛋白质。
- 该方法展示了与各种蛋白质库的兼容性。
- 有效地实现了在芯片上的转录和翻译。
结论
- 这种微流控技术简化了蛋白质阵列的创建。
- 它消除了纯化的需求，提高了可用性。
- 该技术可应用于多种蛋白质库进行研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
