Name: 在利什曼原虫、人体细胞和小鼠睾丸中的 Polysome 分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: 学习多聚核糖体分析技术，用于研究利什曼原虫、人体细胞和小鼠睾丸中mRNA与核糖体的结合及蛋白质合成调控机制。该方法通过蔗糖梯度超速离心分离多聚核糖体，为翻译调控研究提供重要工具。

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作者感谢Ching Lee在音频录制方面的帮助。本研究得到了德克萨斯理工大学健康科学中心启动资金以及转化神经科学与治疗学卓越中心（CTNT）资助项目PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW（A.L.K.）的支持；部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01AI099380（K.Z.）支持。James C. Huffman和Kristen R. Baca为STEM教育整合中心（CISER） &amp;#38; 研究）学者，并获得了该项目的支持。

本研究中所有动物处理及组织获取操作均依照德克萨斯理工大学健康科学中心机构动物护理与使用委员会批准的方案进行，符合美国国立卫生研究院动物福利指南，方案编号96005。请根据机构动物护理与使用委员会的指南实施脊椎动物的安乐死并准备组织。若无此类委员会，请参照美国国立卫生研究院动物福利指南。实验使用成年（&#62;60日龄）C57BL/6小鼠。所有动物和组织的获取均遵循德克萨斯理工大学健康科学中心机构动物护理与使用委员会批准的方案，并符合美国国立卫生研究院动物福利指南。实施安乐死时，将一只小鼠放入小型密闭容器中，逐渐用约30%的二氧化碳置换空气，以麻醉动物并最大程度减少其痛苦。在动物呼吸停止后，于组织采集前采用颈椎脱位法确认其死亡。
注意：所有涉及活体 利什曼原虫 在生物安全二级认证实验室的生物安全柜中进行人源培养细胞的操作。
1. 从Leishmania Major、培养的人类细胞及小鼠组织制备胞质裂解物
注意：不同来源材料的裂解液制备存在若干差异。其他步骤，包括蔗糖梯度制备和多聚核糖体组分分离，则完全相同，且不依赖于样品来源。
<ol>
	<li>Leishmania major 细胞质裂解液制备
	<ol>
		<li>接种 Leishmania major (FV1 菌株) 细胞置于 30 mL 1x M199 培养基中29 含10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素混合液（分别为100单位和100 μg/mL） 密度为1x105 cells/mL 
		注意：所有涉及以下内容的步骤 Leishmania major 细胞操作必须在生物安全柜中进行。</li>
		<li>将细胞置于培养箱中，在27 °C下培养至对数生长期（对数中期对应5x106 细胞/mL）。通常需要约两天时间进行培养。</li>
		<li>加入环己酰亚胺 Leishmania major 将培养物置于100 μg/mL的终浓度下，以使核糖体在已翻译的mRNA上停滞。将细胞放回27 °C培养箱中孵育10分钟。</li>
		<li>在放线菌酮处理完成后，将细胞转移至50 mL锥形管中，在4 °C、1,800 × g条件下离心8 min，弃去上清液。</li>
		<li>用 30 mL 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞，在 4 °C 下以 1,800 x g 离心 8 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。用1 mL DPBS重悬细胞。</li>
		<li>取一部分细胞，与3.5%甲醛溶液混合。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞并确定其浓度。将所需数量的细胞转移至微量离心管中。裂解液由 0.5×108-2×108 每毫升细胞数足以进行一次蔗糖梯度加样。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 1,800 x g 离心 8 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>在冰上用 1 mL 含蛋白酶抑制剂和 RNase 抑制剂的裂解缓冲液（20 mM HEPES-KOH，pH 7.4，100 mM KCl，10 mM MgCl₂，1% NP-40）重悬细胞沉淀22 mM DTT，1% NP-40，1×蛋白酶抑制剂混合物&#160;（无EDTA），200单位/毫升RNase抑制剂）</li>
		<li>将裂解液通过23号针头推注三次。裂解液经针头处理后应变为透明。</li>
		<li>在 11,200 x g、4 °C 条件下离心 10 分钟，以澄清裂解液。将澄清后的裂解液转移至新离心管中，置于冰上保存，直至进行蔗糖梯度超速离心。</li>
		<li>收集400–500 μL裂解液作为输入样品（用于后续分析），立即用液氮冷冻，用于后续蛋白质分析；如需进行RNA分析，则在冷冻前加入RNA纯化试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养的人源HeLa细胞中制备细胞质裂解液
	<ol>
		<li>将HeLa细胞进行分瓶，并以2×10⁶个细胞接种至20 mL含有10%胎牛血清及青霉素/链霉素混合液（青霉素100单位，链霉素100 μg/mL）的DMEM培养基中5 细胞/mL，置于15 cm培养皿中。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下培养HeLa细胞2 孵育20-24小时。根据制造商说明书进行质粒DNA转染。</li>
		<li>转染后在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞24小时2.</li>
		<li>向培养的 HeLa 细胞中加入环己酰亚胺，使其终浓度为 100 μg/mL，以使核糖体停滞在已翻译的 mRNA 上，随后在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 10 分钟2吸弃培养基，用预冷的DPBS在冰上洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入 500 μL 裂解缓冲液（20 mM HEPES-KOH pH 7.4，100 mM KCl，5 mM MgCl₂）2，1 mM DTT，0.5% NP-40，1×蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA），200单位/毫升RNase抑制剂或1毫克/毫升肝素）加入板中，在冰上刮取细胞。</li>
		<li>将裂解后的细胞转移至微量离心管中。调节NP-40浓度至0.5%，并加入MgCl₂2 根据样品体积的增加，调整至 5 mM。</li>
		<li>用23号针头将裂解液推注3至6次。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 11,200 x g 离心 8 分钟，以澄清裂解液。离心后，将上清液转移至新管中。使用分光光度计评估细胞裂解效率，并确定用于梯度加载的样品用量。取 10 μL 样品加入 0.5 mL 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）中，以 0.1% SDS 作为空白对照，在 260 nm 处测定吸光度。预期吸光度值约为 15–20 单位/mL。</li>
		<li>用裂解缓冲液将所有样品稀释至相同的吸光度值，然后进行蔗糖梯度离心。在蔗糖梯度离心前，样品需保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠睾丸细胞质裂解液的制备
	<ol>
		<li>解剖小鼠睾丸。在白膜上做一个小切口，收集睾丸中的曲细精管，并转移至含有5 mL DPBS（添加0.1 mM苯甲基磺酰氟，PMSF）的15 mL锥形管中。</li>
		<li>通过反复倒置剧烈混匀组织。将组织置于冰上，于1 × g条件下静置5分钟。</li>
		<li>移除并弃去含有结缔细胞和组织碎片的浑浊缓冲液。重复此步骤2至3次。剩余的白色沉淀物富含曲细精管和生殖细胞。</li>
		<li>将曲细精管沉淀转移至一个2 mL微量离心管中，以500 x g离心1分钟。弃去上清液。</li>
		<li>加入 500 µL 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM KCl，5 mM MgCl₂）2，1 mM DTT，0.5% NP-40，1×蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA），1 mg/mL肝素或200单位/mL RNase抑制剂）加入到小管中。用移液器反复吹打组织。</li>
		<li>将悬液转移至小型（0.5–1.0 mL）Dounce匀浆器中，用玻璃研杵研磨7到8次以破碎组织。</li>
		<li>将裂解液转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 8 分钟，以澄清裂解液。将上清液转移至新离心管中，置于冰上保存，直至上样到蔗糖梯度中。</li>
		<li>取50 μL裂解液作为输入样品，立即在-80 °C冷冻，用于后续蛋白质分析；或在冷冻前加入RNA纯化试剂，用于RNA分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蔗糖梯度制备与超速离心
<ol>
	<li>配制两种蔗糖梯度溶液（20 mM HEPES-KOH，pH 7.4，100 mM KCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT，1×蛋白酶抑制剂混合物），分别含有10%蔗糖或50%蔗糖。（可使用Tris-HCl，pH 7.4，替代HEPES）。根据实验设计加入200单位/毫升RNase抑制剂或1毫克/毫升肝素。将适用于SW 41转子的超速离心管放入标记块中，并沿块的上缘在管壁画线。将离心管转移至稳定的支架中。</li>
	<li>取一支连接有铺层装置的10毫升注射器，用上述配制的10%蔗糖溶液充满注射器。轻轻推动注射器，使溶液缓慢沉降至超速离心管底部，直至液面达到管壁标记处。</li>
	<li>用另一支注射器吸取50%蔗糖溶液，小心地将铺层装置穿过10%蔗糖层插入管底。从底部开始缓慢释放蔗糖溶液，直至液面升至管壁标记处。用提供的盖子密封离心管。</li>
	<li>为制备蔗糖梯度，打开梯度仪设备的ON开关。使用UP或DOWN按钮调节平台水平，并按下DONE键确认。平台水平对梯度线性至关重要。</li>
	<li>平台调平后，按下GRAD键进入梯度菜单。在梯度菜单中选择LIST，然后选择SW 41 Ti转子。使用UP和DOWN按钮从菜单列表中选择所需的蔗糖梯度，按下USE键确认。</li>
	<li>将梯度管支架放置在梯度仪平台上。将离心管放入支架中。每次最多可同时制备6个梯度。按下RUN键。梯度仪将按预设速度和角度旋转离心管，形成线性梯度。梯度制备仅需几分钟即可完成。</li>
	<li>程序完成后，将离心管放入支架中，取下盖子。从超速离心管顶部移除与待加样品体积相等的液体。</li>
	<li>小心地将含有15–20 A260单位多聚核糖体的400–500 μL裂解液加至梯度顶部。将离心管放入转子吊桶中并进行平衡。</li>
	<li>使用SW 41转子，在260,000 × g、4 °C条件下离心2小时。</li>
</ol>
3. 多聚核糖体分级分离与样品收集
注意：尽管裂解液的制备方法因来源不同而有所差异，但所有类型的裂解液在梯度溶液制备和多聚核糖体分离步骤上均采用相同的方案。
<ol>
	<li>超速离心完成后，将装有离心管的转子桶置于冰上。开启馏分收集器和梯度分馏器。 开启点击 扫描 在分馏器菜单上。将装有24个收集管的试管架放入馏分收集器中。</li>
	<li>在分馏器侧面的冲洗储液槽中加满去离子水。按下 冲洗 用钥匙旋转10秒以冲洗分馏器的泵。将装有水的注射器连接至活塞的冲洗接头上，进行校准。</li>
	<li>打开计算机上的 fractionator 软件。按下 校准. 使用 默认 设置并按下 好的准备好从注射器注入水。</li>
	<li>按压 好的 进行校准。立即开始注入水，持续5秒。在此期间，水将流经紫外检测器的流通池，仪器将完成校准。该标志 零点校准完成 将出现。仪器已准备就绪，可进行组分分离。</li>
	<li>取下带有注射器的冲洗接头。将吸头安装到分级器的活塞上。</li>
	<li>打开黄铜空气阀并按压 空气 关闭空气阀，按键10秒以干燥管路和流动池。</li>
	<li>轻轻将梯度管从转子桶中取出，放入试管架中。将试管固定帽套在试管顶端，小心地将试管移入试管固定装置中，并将其锁定在位。</li>
	<li>将收集管置于分级器活塞下方。通常可肉眼观察到多聚核糖体条带。设置所需的分级数量和体积（通常24个组分，每组分500 μL即可）。正确命名文件。按下 好的，然后 转到图表 按钮。在下一个窗口中，按下 开始扫描. 设置将出现，按下 好的收集器将从槽道移至第一管馏分，活塞将进入管中。当活塞到达梯度顶部时，其移动速度将减慢至设定速度，随后开始收集馏分。完成后，活塞退出梯度管。</li>
	<li>打开黄铜空气阀并按压 空气 使用分馏器上的钥匙取出最后一部分馏分。</li>
	<li>将试管从冰上的试管架中移开。</li>
	<li>向每份样品中加入2倍体积的RNA纯化试剂，并在液氮中速冻，保存至进行RNA纯化。或者，若需分析蛋白质，可加入三氯乙酸至终浓度10%，用于浓缩样品以进行Western blot检测（见第8节）。</li>
</ol>
4. 合成RNA的制备 体外 用于RT-qPCR数据分析中mRNA水平的标准化
注意： E. coli OmpA mRNA 在本方案中用于归一化。任何其他与所研究生物体（哺乳动物或 利什曼原虫）可以使用。
<ol>
	<li>通过标准PCR反应，从含有OmpA基因的质粒中制备包含SP6启动子序列的OmpA DNA片段30。</li>
	<li>配制100 µL反应混合液：80 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、16 mM MgCl2、2 mM 亚精胺、10 mM DTT、3 mM ATP、3 mM CTP、3 mM UTP、3 mM GTP、0.5 U/μL RNase抑制剂、1 μg OmpA PCR DNA、3 μL SP6 RNA聚合酶、0.005 U/μL焦磷酸酶。</li>
	<li>在40 °C下孵育2小时。</li>
	<li>使用RNA纯化试剂盒纯化RNA。</li>
	<li>用分光光度计测定浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。</li>
</ol>
5. 从梯度组分中分离RNA及cDNA制备
注意：如果使用了RNase抑制剂作为核糖核酸酶抑制剂，则可直接按照本方案进行RNA纯化。然而，肝素作为核糖核酸酶抑制剂时会抑制cDNA合成过程中所用的逆转录酶。因此，若裂解缓冲液和梯度中使用了肝素，则需要对RNA进行额外纯化。如果使用了肝素，请参见第6部分以准备用于cDNA合成的RNA。
<ol>
	<li>解冻含有RNA纯化试剂的样品，加入20 ng合成RNA作为内参对照，用于RT-qPCR结果的标准化。除一处修改外，其余步骤均按照试剂盒说明书进行RNA制备。在异丙醇沉淀前加入1 µL RNA级糖原（20 µg）。将RNA沉淀溶解于20–25 µL无RNase的水中。 
	注：糖原作为载体有助于避免RNA损失，并在纯化过程中便于观察RNA沉淀。OmpA mRNA将用于后续RT-qPCR反应的归一化处理。</li>
	<li>使用分光光度计测定RNA浓度，以确保获得足够的产量。将含有40S、60S和单体核糖体的RNA组分等体积混合，作为前多聚核糖体（prepolysomes）。将含有2–4个核糖体的组分合并为轻度多聚核糖体（light polysomes），含有5–8个核糖体的组分合并为重度多聚核糖体（heavy polysomes）。</li>
	<li>从合并的组分中取5–10 µL RNA，使用试剂盒并按照制造商推荐的方法反转录合成cDNA。</li>
	<li>向20 µL cDNA中加入80 µL无核酸酶的水。将cDNA样品在-20 °C下冷冻保存。</li>
</ol>
6. 从肝素污染中纯化 RNA
注意：肝素会抑制逆转录酶等核酸处理酶的活性。因此，当裂解缓冲液和/或梯度液中使用肝素时，需采用此附加纯化步骤。
<ol>
	<li>向纯化的 RNA 样品中加入 LiCl，使其终浓度为 1 M。</li>
	<li>混匀样品，并在冰上孵育 1 小时。</li>
	<li>在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。</li>
	<li>用移液器尽可能彻底地移除上清液。</li>
	<li>将沉淀在空气中干燥约 5 分钟。</li>
	<li>用初始体积的无 RNase 水重新悬浮沉淀。</li>
	<li>在 260 nm 处进行分光光度测定，以确定 RNA 的浓度。通常样品损失极小。</li>
</ol>
7. mRNA 分布的 RT-qPCR 及数据分析
<ol>
	<li>将10.2 μL水、20 μL SYBR Green、4.8 μL基因特异性引物（每对2.5 μM）、5 μL cDNA混合均匀，每孔加入10 μL，每个样本设三个复孔，加入384孔板中。</li>
	<li>用粘性封板膜紧密封盖，于1,800 × g离心5分钟。</li>
	<li>使用实时PCR仪，按照表1所示条件设置qPCR反应。</li>
	<li>根据循环阈值（CT）值，采用比较CT法（ΔΔCT）31计算mRNA在前多核糖体、轻度多核糖体和重度多核糖体组分中的分布百分比（%），方法如文献32所述，仅作一处修改：在RT-qPCR数据分析中使用合成RNA（此处为OmpA）进行数据归一化。该合成RNA提供归一化对照，可用于计算相对mRNA水平，并在密度梯度的不同组分间进行比较。</li>
</ol>
8. 通过蛋白质印迹法分析多聚核糖体组分中的蛋白质
<ol>
	<li>从100%（w/v）的储存液中，向选定的组分（500 μL）加入三氯乙酸（TCA），使其终浓度为10%，冰上放置至少15分钟，然后在微量离心机中离心5分钟，弃去上清液，用预冷的丙酮洗涤两次，最后溶于25 μL SDS-PAGE上样缓冲液中，用于电泳。</li>
	<li>上样至SDS-PAGE凝胶，进行标准电泳，随后将蛋白转移至PVDF膜，进行Western印迹分析33。</li>
</ol>

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<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

蔗糖梯度离心结合各组分的RNA和蛋白质分析，是一种用于研究特定mRNA或全转录组的翻译状态，以及在正常生理或疾病状态下调控翻译机制的蛋白质因子作用的强有力方法。多聚核糖体分析是一种特别适用于研究锥虫等动基体类生物中翻译调控的实验技术。 利什曼原虫 其中转录调控基本缺失，基因表达的调控主要在翻译过程中进行。
本文介绍了一种用于三种模型的多聚核糖体分离方案：Leishmania 寄生虫、培养的人源细胞和小鼠组织。本研究中所用不同生物体的多聚核糖体分离步骤基本相同；然而，裂解液的制备存在一些差异。Leishmania 细胞在液体培养基中生长，通过离心收集，并在裂解前进行细胞计数，以确保在梯度中上样量相等。人源细胞可在培养板上直接洗涤并裂解，上样量的均一性通过光密度进行控制。小鼠组织需要使用Dounce匀浆器进行有效裂解，而对于利什曼原虫和人源细胞，仅需通过23号针头反复吹打即可完成裂解。
所使用的所有试剂均应无RNase和蛋白酶。我们比较了肝素和RNase抑制剂在细胞质裂解液中对...

细胞中基因表达的调控受转录、转录后及翻译后机制的共同控制。深度RNA测序技术的进步使得在全基因组范围内以前所未有的精度研究稳态mRNA水平成为可能。然而，近期研究发现，稳态mRNA水平并不总是与蛋白质产量相关联1,2单个转录本的命运非常复杂，取决于多种因素，如内部/外部刺激、应激 等等蛋白质合成过程中基因表达的调控为应对环境变化提供了另一层表达控制机制，对于快速响应变化的条件至关重要。多聚核糖体（或称多核糖体） &#34;多核糖体&#34;）分析，即分离和可视化活跃翻译的核糖体，是一种研究蛋白质合成调控的强有力方法。尽管其最早的实验应用可追溯至20世纪60年代3多核糖体分析目前是蛋白质翻译研究中最重要的技术之一4单个mRNA可被多个核糖体翻译，从而形成多聚核糖体。使用环己酰亚胺可使转录本在核糖体上停滞。5 通过蔗糖梯度超速离心进行多聚核糖体分馏，可分离含有不同数量多聚核糖体的mRNA6,7,8,9对多聚核糖体组分进行RNA分析，可实现全基因组范围内个体mRNA翻译状态变化的检测，并可用于不同生理条件下的动态监测4,7,10该方法还被用于揭示5'UTR和3'UTR序列在调控mRNA可翻译性中的作用11，研究miRNA在翻译抑制中的作用12，揭示核糖体生物合成中的缺陷13，并理解核糖体相关蛋白在人类疾病中的作用14,15在过去十年中，基因表达在翻译水平上的调控作用日益凸显，凸显了其在人类疾病中的重要性。在癌症、代谢性疾病和神经退行性疾病中，翻译调控的证据已十分充分。15,16,17,18例如，eIF4E依赖性翻译调控的失调会导致与自闭症相关的功能缺陷15 FMRP 参与调控与自闭症相关的 mRNA 上核糖体的停滞14因此，多聚核糖体分析是研究多种人类疾病中翻译调控缺陷的重要工具。
在不同生理条件下对多聚核糖体组分进行蛋白质分析，可解析与核糖体相关因子在翻译过程中的功能。多聚核糖体分析技术已广泛应用于多种物种，包括酵母、哺乳动物细胞、植物和原生动物10,19,20,21。诸如Trypanosoma和Leishmania等原生动物寄生虫对基因表达的转录调控极为有限。它们的基因组以缺乏启动子调控转录的多顺反子基因簇形式组织22。相反，在锥虫类物种中，发育相关的基因表达主要在蛋白质翻译和mRNA稳定性水平上进行调控23,24。因此，理解在缺乏转录调控的情况下翻译控制机制，对这些生物体尤为重要。多聚核糖体分析是研究Leishmania中基因表达转录后调控的有力工具25,26,27,28。
近年来，通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测单个mRNA水平、利用高通量测序分析全转录组，以及蛋白质组学技术的发展，使多聚核糖体分析（polysomal profiling）的分辨率和优势达到了新的高度。结合深度RNA测序与蛋白质组学分析对单个多聚核糖体组分进行研究，可进一步拓展这些方法的应用，实现全基因组水平上对细胞翻译状态的监测。这有助于鉴定在不同生理和病理条件下调控翻译过程的新分子因子。本文介绍了一种通用的多聚核糖体分析方案，已在三种不同模型系统中应用：寄生虫Leishmania major、培养的人源细胞以及动物组织。我们提供了针对不同生物来源样品制备裂解液的建议，梯度条件的优化策略，RNase抑制剂的选择，以及在本研究中如何应用RT-qPCR、Western blot和RNA电泳技术对多聚核糖体组分进行分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>梯度混合器</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>活塞式梯度分部收集器</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>组分收集器</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>尼康倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/Ts2</td><td></td></tr><tr><td>2720 梯度 PCR 仪</td><td>Applied Biosystems by Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>II 级 A2 型生物安全柜</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco 超低温冰箱</td><td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>SW41 超速离心转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>摆桶式转子</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>固定角转子</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex 实时荧光定量 PCR 仪 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax 软件&amp;nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪用双腔计数载片</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>开口顶聚碳酸酯离心管（14 mm × 89 mm）</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD 3 mL 注射器，23 号针头，1 英寸</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 表面培养皿，14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 表面培养皿，9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 快速流 90 mm 滤器装置，500 mL，0.2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl2×6H2O）</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40（NP-40）</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>重组 Rnasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮（Cycloheximide）</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>抗 RPL11 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>核糖体蛋白 S6（C-8）抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1× M199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>凝胶加样缓冲液 II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸（TCA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;prime;-三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP）</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>5'-三磷酸胞苷二钠盐水合物（CTP）</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-三磷酸尿苷三钠盐水合物（UTP）</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-三磷酸鸟苷钠盐水合物（GTP）</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸酶</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

利什曼原虫、人细胞和小鼠睾丸中的多聚核糖体分析

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

在快速变化的环境中，蛋白质在正确的时间以正确的量表达，是细胞正常功能和存活的基础。长期以来，基因表达研究主要集中于转录水平。然而，mRNA的稳态水平与蛋白质的合成量相关性较差，且mRNA的可翻译性在不同条件下差异显著。在某些生物体中，例如寄生虫Leishmania，蛋白质表达主要在翻译水平上进行调控。近期研究表明，蛋白质翻译的失调与癌症、代谢性疾病、神经退行性疾病及其他人类疾病密切相关。多聚核糖体分析（polysome profiling）是一种研究蛋白质翻译调控的有力方法，可用于检测单个mRNA的翻译状态，或在全基因组范围内分析翻译过程。该技术的基本原理是将细胞质裂解液通过蔗糖梯度离心，从而分离多聚核糖体、核糖体、核糖体亚基以及游离的mRNA。本文介绍了一种通用的多聚核糖体分析方案，已在三种不同的模型系统中应用：寄生虫Leishmania major、培养的人源细胞以及动物组织。其中，Leishmania细胞在悬浮液中自由生长，培养的人源细胞以贴壁单层形式生长，而小鼠睾丸则代表动物组织样本。因此，该技术已针对上述各类样本来源进行了优化适配。多聚核糖体组分的分析方案包括：通过RT-qPCR检测特定mRNA水平，通过Western blot检测蛋白质，以及通过电泳分析核糖体RNA。该方法还可进一步拓展，例如通过深度RNA测序（RNA-seq）在转录组水平上分析mRNA与核糖体的结合情况，或通过质谱分析各组分中与核糖体结合的蛋白质。该方法可轻松调整并适用于其他生物模型。

本研究中，我们描述了多聚核糖体分析技术在三种不同来源中的应用：寄生性Leishmania major、培养的人源细胞以及小鼠睾丸组织。Leishmania细胞在液体悬浮培养基中自由生长，培养的人源细胞则以贴壁单层形式在培养板上生长，而小鼠睾丸代表一种组织样本。该方法可轻松调整用于其他类型的悬浮自由生长细胞、不同类型的组织、其他生物体或不同类型的培养细胞。该技术流程主要包括四个步骤：裂解液制备、蔗糖梯度制备及超速离心、多聚核糖体分级分离与样品收集，随后对各组分进行分析。来自不同来源的细胞被收集、洗涤后，通过针头反复抽吸或使用Dounce匀浆器在裂解缓冲液中裂解。通过离心去除细胞碎片，从而澄清裂解液。梯度分级分离的示意图见图1A。通过梯度混合仪将10%和50%的蔗糖溶液混合，形成连续的蔗糖梯度。将裂解液加于梯度顶部。超速离心可分离与不同数量核糖体结合的mRNA，并在分级过程中通过紫外检测器监测，形成特征性的吸光度谱图。收集的各级分可用于RNA和蛋白质分析（<strong class...

多核糖体分析技术的总体目标是分析蛋白质合成过程中单个mRNA或转录组mRNA的翻译活性。该方法对于研究健康状态及多种人类疾病中的蛋白质合成调控、翻译激活与抑制具有重要意义。

在快速变化的环境中，蛋白质在正确的时间以适当的量表达是细胞正常功能和存活的基础。对于……

该技术的总体目标是研究翻译过程中单个 mRNA 与多聚核糖体的结合情况。多聚核糖体分析是一种研究 mRNA 与核糖体及多聚核糖体结合的有力技术。该技术对于蛋白质合成调控、翻译激活与抑制的研究具有重要意义。本团队在此介绍了多聚核糖体分离及组分分析的技术，以三种生物样本为例：寄生虫利什曼原虫（Leishmania major）、培养的人源细胞以及动物组织。该方法主要包括四个步骤：裂解液制备、蔗糖梯度制备与超速离心、多聚核糖体组分分离以及样品收集。组分分析。收集不同来源的细胞，洗涤后在裂解缓冲液中通过针头或Dounce匀浆器裂解。通过离心去除细胞碎片，从而澄清裂解液。通过梯度混合器将10%和50%的蔗糖溶液混合，形成连续蔗糖梯度。将裂解液加在梯度顶部。超速离心可分离与不同数量核糖体结合的mRNA。在组分分离过程中，通过紫外检测器进行监测，形成不同的吸收光谱。裂解液制备：根据来源不同，裂解液的制备方法存在一些差异。裂解液制备完成后，无论样品来源如何，后续操作步骤均相同。利什曼原虫（Leishmania major）胞质裂解液的制备：将利什曼原虫（Leishmania major）细胞置于30毫升培养基中，细胞密度为每毫升100,000个细胞。该步骤需在生物安全柜中进行。将含有利什曼原虫培养物的培养瓶放入培养箱中，在 27 摄氏度下培养细胞至对数生长期。通常需要约两天时间。在显微镜下可清晰观察到利什曼原虫 major 细胞。向培养好的利什曼原虫培养物中加入环己酰亚胺，使其终浓度为 100 微克/毫升，以阻止核糖体从已翻译的 mRNA 上解离。将细胞重新置于 27 摄氏度培养箱中孵育 10 分钟。完成放线菌酮处理后，将细胞转移至50毫升锥形管中，在1,800 ×g条件下离心8分钟。弃去上清液。用30毫升PBS洗涤细胞，然后离心。弃去上清液，并将细胞重悬于一毫升 PBS 中。取一份细胞 aliquot，与甲醛溶液混合，然后用血细胞计数板计数细胞。将所需数量的细胞转移至微量离心管中。在4°C条件下，以1,800 g离心8分钟，随后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂和RNAsin的1毫升裂解缓冲液中。用23号针头吹打细胞三次。经过针头吹打后，裂解液变得透明。在 4 °C 条件下以 11,200 ×g 离心 10 分钟，以澄清裂解液。将澄清后的裂解液转移至新的微量离心管中，并置于冰上，直至进行蔗糖梯度超速离心。培养的人源细胞胞质裂解液的制备。在37摄氏度、5% CO2条件下，于培养箱中于大培养皿中培养HeLa细胞。向培养好的HeLa细胞中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100微克/毫升，以使核糖体停滞在已翻译的mRNA上。在37摄氏度、5% CO2条件下孵育细胞10分钟。吸弃培养基，用预冷的 PBS 在冰上洗涤细胞板两次。向细胞板中加入 500 µL 裂解缓冲液，刮取细胞。将裂解后的细胞转移至微量离心管中。用23号针头将细胞反复吹打三次。在11,200 g离心8分钟以澄清裂解液。离心后将离心管置于冰上，将上清液转移至新管中。取一份等分试样，稀释后使用纳米滴定仪在260纳米处测定吸光度。若有多个样品，将裂解液调整至相同的光密度，并在蔗糖梯度超速离心前将样品置于冰上保存。从小鼠睾丸中制备细胞质裂解液。解剖小鼠睾丸。在白膜上做一个小切口，收集睾丸中的生精小管，并将其转移至含有5 mL PBS的锥形管中。剧烈混匀组织。将组织置于冰上静置五分钟。弃去上清液，再用 PBS 洗涤两次。将曲细精管转移至一个 2 毫升离心管中，在 500 ×g 条件下离心一分钟。弃去上清液。向小管中加入 500 µL 裂解缓冲液，用移液器吹打裂解组织。将悬液转移至小容量玻璃匀浆器中。用玻璃匀浆器研磨7到8次以破碎组织。将裂解液转移至微量离心管中。在4°C条件下，以12,000 g离心8分钟，以澄清裂解液。将上清液转移至新离心管中，并置于冰上保存。随后，进行蔗糖梯度的制备。蔗糖梯度的制备。将超速离心管放入微量离心块中，并沿离心块上缘画线标记。然后将离心管转移至稳定的离心管架中。取一支10 mL注射器，连接分层装置，并用10%蔗糖溶液充满注射器。轻轻将溶液释放至超速离心管底部，直至蔗糖溶液达到管壁标记处。用另一支注射器吸取50%蔗糖溶液，并小心将分层装置穿过10%蔗糖层插入管底。从底部开始缓慢释放蔗糖溶液，直至液面升至管壁标记处。然后用提供的盖子密封离心管。准备蔗糖梯度时，打开梯度生成仪，使用上升或下降按钮调节平板水平，然后按“完成”。平衡好梯度平板后，进入梯度菜单列表，选择 SW41 转子，然后选择所需的蔗糖梯度。用于按压。将磁力底座试管架放在梯度混合器上，然后将试管放入支架中。可同时制备最多六个梯度。按下运行。梯度生成器以程序设定的速度和角度旋转试管，形成线性梯度。制备梯度仅需几分钟。当过程完成后，将试管放入试管架中。用蔗糖梯度的超速离心管，从管顶移除与样品体积相等的液体体积。小心地将 500 µL 裂解液加至顶部。将离心管放入转子吊桶中并平衡。在 4 °C 条件下，以 260,000 ×g 离心 2 小时。多聚核糖体分级分离与样品收集。超速离心后，将离心管置于转子套管中并放在冰上。打开组分收集器和分级分离仪。在分部收集器菜单上点击“扫描”。将装有收集管的架子放入分部收集器中。在分部收集器侧面的清洗储液罐中加入去离子水至满。按下冲洗键持续十秒钟以冲洗泵。将装有水的注射器连接至活塞上的冲洗接头，用于校准。在计算机上打开组分收集软件。按下校准。使用默认设置，然后按确定。准备好从注射器注入水。按确定以进行校准。立即开始注水，持续五秒。将显示“零点校准完成”提示。取下带有注射器的冲洗适配器，并在分馏器的活塞上安装一个吸头。打开黄铜气阀，按下空气键持续十秒钟，以干燥空气管路和流动池。关闭气阀。从转子桶中取出梯度管，并将其放入支架中。将管盖盖在离心管顶部，并小心地将离心管放入离心管架中并锁定。将管架置于活塞下方。通常可通过肉眼观察到多聚核糖体条带。设置所需的组分数和体积参数。为文件命名后点击“确定”，然后点击图形按钮。在下一个窗口中，点击“开始扫描”。设置界面将出现，点击“确定”按钮。收集器会从导流槽移动到第一个组分位置，活塞将进入收集管。当活塞到达梯度顶部时，其移动速度会减慢至您设定的速度，并开始收集组分。通常情况下，我们以每管500 µL的体积收集24个组分。当操作完成后，活塞将从梯度管中移出。打开黄铜空气阀，按下分馏器上的空气键以收集最后的组分。运行结束后，您将看到梯度的吸光度图谱。对组分进行分析。所获得的组分可用于RNA和蛋白质分析。RNA可通过电泳分析，随后进行Northern印迹，或用于cDNA合成，再通过RT-qPCR反应分析单个mRNA与多聚核糖体的结合情况。下一代测序可用于在转录组水平上分析mRNA的翻译状态。对于多聚核糖体组分的蛋白质分析，需用三氯乙酸沉淀蛋白质以实现浓缩。然后通过蛋白质印迹法（Western Blotting）或在蛋白质组水平上通过质谱法（Mass Spec）对蛋白质进行分析。结果：本文展示了三种生物体——利什曼原虫、培养的人源细胞和小鼠组织——的多聚核糖体分级分离与分析结果。采用多聚核糖体分馏技术研究Sherp和微管蛋白mRNA在翻译过程中与核糖体的结合情况，以及利什曼原虫（Leishmania major）的相关特性。分馏过程的吸光度图谱呈现出典型特征，包括核糖体亚基40S和60S、单体核糖体80S以及多聚核糖体的明显峰形。各分馏组分的等分试样被合并为三组。前多聚核糖体、轻度多聚核糖体和重度多聚核糖体。通过实时定量PCR检测mRNA的相对水平。数据表明，微管蛋白mRNA正处于活跃翻译状态。由于其主要与重多聚核糖体和轻多聚核糖体相关。而Sherp mRNA的翻译活性较低，主要存在于前多聚核糖体和轻多聚核糖体中。因此，该实验明确展示了该技术研究单个 mRNA 参与翻译过程的能力。此图显示了 HeLa 细胞多聚核糖体分级分离的典型吸光度图谱。蛋白质通过加入 10% 三氯乙酸沉淀浓缩。通过蛋白质印迹法检测了小亚基核糖体蛋白 RPS6 和大亚基核糖体蛋白 RPL11。它们的分布与吸光度光谱上的明显峰位置高度一致。在本图中，我们展示了通过电泳检测从小鼠睾丸分馏的多聚核糖体中核糖体 RNA 的一个示例。结论。多聚核糖体分析是一种多功能技术，可用于分析不同条件下多种模式生物中单个mRNA的翻译状态，检测核糖体相关蛋白，并研究翻译调控机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

在利什曼原虫、人体细胞和小鼠睾丸中的 Polysome 分析

感染THP1细胞的寄生虫拯救与转化实验 体外 与 Leishmania donovani...

一种针对THP1人急性单核细胞白血病细胞系内Leishmania donovani无鞭毛体的抗利什曼原虫药物筛选的寄生虫拯救与转化实验

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本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。...

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雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

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利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

本文描述了利用 pLEXSY 系统构建表达 eGFP 基因的稳定整合转基因L. panamensis和L.

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本文通过生物发光成像和PCR技术，对经腹腔（IP）或牙龈内（IG）途径感染L. infantum-Luc的金黄地鼠进行纵向评估。在感染后第1天（1 dpi）、感染后第1周（8 dpi）和感染后第3周（22 dpi）对动物进行评估，并于感染后第50天（50th...

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

学习多聚核糖体分析技术，用于研究利什曼原虫、人体细胞和小鼠睾丸中mRNA与核糖体的结合及蛋白质合成调控机制。该方法通过蔗糖梯度超速离心分离多聚核糖体，为翻译调控研究提供重要工具。

利什曼原虫、人细胞和小鼠睾丸中的多聚核糖体分析

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