利什曼原虫、人细胞和小鼠睾丸中的多聚核糖体分析

该技术的总体目标是研究翻译过程中单个 mRNA 与多聚核糖体的结合情况。多聚核糖体分析是一种研究 mRNA 与核糖体及多聚核糖体结合的有力技术。该技术对于蛋白质合成调控、翻译激活与抑制的研究具有重要意义。

本团队在此介绍了多聚核糖体分离及组分分析的技术，以三种生物样本为例：寄生虫利什曼原虫（Leishmania major）、培养的人源细胞以及动物组织。该方法主要包括四个步骤：裂解液制备、蔗糖梯度制备与超速离心、多聚核糖体组分分离以及样品收集。

组分分析。收集不同来源的细胞，洗涤后在裂解缓冲液中通过针头或Dounce匀浆器裂解。通过离心去除细胞碎片，从而澄清裂解液。

通过梯度混合器将10%和50%的蔗糖溶液混合，形成连续蔗糖梯度。将裂解液加在梯度顶部。超速离心可分离与不同数量核糖体结合的mRNA。

在组分分离过程中，通过紫外检测器进行监测，形成不同的吸收光谱。裂解液制备：根据来源不同，裂解液的制备方法存在一些差异。

裂解液制备完成后，无论样品来源如何，后续操作步骤均相同。利什曼原虫（Leishmania major）胞质裂解液的制备：将利什曼原虫（Leishmania major）细胞置于30毫升培养基中，细胞密度为每毫升100,000个细胞。

该步骤需在生物安全柜中进行。将含有利什曼原虫培养物的培养瓶放入培养箱中，在 27 摄氏度下培养细胞至对数生长期。通常需要约两天时间。

在显微镜下可清晰观察到利什曼原虫 major 细胞。向培养好的利什曼原虫培养物中加入环己酰亚胺，使其终浓度为 100 微克/毫升，以阻止核糖体从已翻译的 mRNA 上解离。将细胞重新置于 27 摄氏度培养箱中孵育 10 分钟。

完成放线菌酮处理后，将细胞转移至50毫升锥形管中，在1,800 ×g条件下离心8分钟。弃去上清液。用30毫升PBS洗涤细胞，然后离心。

弃去上清液，并将细胞重悬于一毫升 PBS 中。取一份细胞 aliquot，与甲醛溶液混合，然后用血细胞计数板计数细胞。

将所需数量的细胞转移至微量离心管中。在4°C条件下，以1,800 g离心8分钟，随后弃去上清液。

将细胞沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂和RNAsin的1毫升裂解缓冲液中。用23号针头吹打细胞三次。经过针头吹打后，裂解液变得透明。

在 4 °C 条件下以 11,200 ×g 离心 10 分钟，以澄清裂解液。将澄清后的裂解液转移至新的微量离心管中，并置于冰上，直至进行蔗糖梯度超速离心。培养的人源细胞胞质裂解液的制备。

在37摄氏度、5% CO2条件下，于培养箱中于大培养皿中培养HeLa细胞。向培养好的HeLa细胞中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100微克/毫升，以使核糖体停滞在已翻译的mRNA上。在37摄氏度、5% CO2条件下孵育细胞10分钟。

吸弃培养基，用预冷的 PBS 在冰上洗涤细胞板两次。向细胞板中加入 500 µL 裂解缓冲液，刮取细胞。将裂解后的细胞转移至微量离心管中。

用23号针头将细胞反复吹打三次。在11,200 g离心8分钟以澄清裂解液。离心后将离心管置于冰上，将上清液转移至新管中。

取一份等分试样，稀释后使用纳米滴定仪在260纳米处测定吸光度。若有多个样品，将裂解液调整至相同的光密度，并在蔗糖梯度超速离心前将样品置于冰上保存。从小鼠睾丸中制备细胞质裂解液。

解剖小鼠睾丸。在白膜上做一个小切口，收集睾丸中的生精小管，并将其转移至含有5 mL PBS的锥形管中。剧烈混匀组织。

将组织置于冰上静置五分钟。弃去上清液，再用 PBS 洗涤两次。将曲细精管转移至一个 2 毫升离心管中，在 500 ×g 条件下离心一分钟。

弃去上清液。向小管中加入 500 µL 裂解缓冲液，用移液器吹打裂解组织。将悬液转移至小容量玻璃匀浆器中。

用玻璃匀浆器研磨7到8次以破碎组织。将裂解液转移至微量离心管中。在4°C条件下，以12,000 g离心8分钟，以澄清裂解液。

将上清液转移至新离心管中，并置于冰上保存。随后，进行蔗糖梯度的制备。蔗糖梯度的制备。

将超速离心管放入微量离心块中，并沿离心块上缘画线标记。然后将离心管转移至稳定的离心管架中。取一支10 mL注射器，连接分层装置，并用10%蔗糖溶液充满注射器。

轻轻将溶液释放至超速离心管底部，直至蔗糖溶液达到管壁标记处。用另一支注射器吸取50%蔗糖溶液，并小心将分层装置穿过10%蔗糖层插入管底。从底部开始缓慢释放蔗糖溶液，直至液面升至管壁标记处。

然后用提供的盖子密封离心管。准备蔗糖梯度时，打开梯度生成仪，使用上升或下降按钮调节平板水平，然后按“完成”。

平衡好梯度平板后，进入梯度菜单列表，选择 SW41 转子，然后选择所需的蔗糖梯度。

用于按压。将磁力底座试管架放在梯度混合器上，然后将试管放入支架中。

可同时制备最多六个梯度。按下运行。梯度生成器以程序设定的速度和角度旋转试管，形成线性梯度。

制备梯度仅需几分钟。当过程完成后，将试管放入试管架中。用蔗糖梯度的超速离心管，从管顶移除与样品体积相等的液体体积。

小心地将 500 µL 裂解液加至顶部。将离心管放入转子吊桶中并平衡。在 4 °C 条件下，以 260,000 ×g 离心 2 小时。

多聚核糖体分级分离与样品收集。超速离心后，将离心管置于转子套管中并放在冰上。打开组分收集器和分级分离仪。

在分部收集器菜单上点击“扫描”。将装有收集管的架子放入分部收集器中。在分部收集器侧面的清洗储液罐中加入去离子水至满。

按下冲洗键持续十秒钟以冲洗泵。将装有水的注射器连接至活塞上的冲洗接头，用于校准。在计算机上打开组分收集软件。

按下校准。使用默认设置，然后按确定。准备好从注射器注入水。按确定以进行校准。

立即开始注水，持续五秒。将显示“零点校准完成”提示。取下带有注射器的冲洗适配器，并在分馏器的活塞上安装一个吸头。

打开黄铜气阀，按下空气键持续十秒钟，以干燥空气管路和流动池。关闭气阀。从转子桶中取出梯度管，并将其放入支架中。

将管盖盖在离心管顶部，并小心地将离心管放入离心管架中并锁定。将管架置于活塞下方。通常可通过肉眼观察到多聚核糖体条带。

设置所需的组分数和体积参数。为文件命名后点击“确定”，然后点击图形按钮。在下一个窗口中，点击“开始扫描”。

设置界面将出现，点击“确定”按钮。收集器会从导流槽移动到第一个组分位置，活塞将进入收集管。当活塞到达梯度顶部时，其移动速度会减慢至您设定的速度，并开始收集组分。通常情况下，我们以每管500 µL的体积收集24个组分。

当操作完成后，活塞将从梯度管中移出。打开黄铜空气阀，按下分馏器上的空气键以收集最后的组分。

运行结束后，您将看到梯度的吸光度图谱。对组分进行分析。所获得的组分可用于RNA和蛋白质分析。

RNA可通过电泳分析，随后进行Northern印迹，或用于cDNA合成，再通过RT-qPCR反应分析单个mRNA与多聚核糖体的结合情况。下一代测序可用于在转录组水平上分析mRNA的翻译状态。对于多聚核糖体组分的蛋白质分析，需用三氯乙酸沉淀蛋白质以实现浓缩。

然后通过蛋白质印迹法（Western Blotting）或在蛋白质组水平上通过质谱法（Mass Spec）对蛋白质进行分析。结果：本文展示了三种生物体——利什曼原虫、培养的人源细胞和小鼠组织——的多聚核糖体分级分离与分析结果。

采用多聚核糖体分馏技术研究Sherp和微管蛋白mRNA在翻译过程中与核糖体的结合情况，以及利什曼原虫（Leishmania major）的相关特性。分馏过程的吸光度图谱呈现出典型特征，包括核糖体亚基40S和60S、单体核糖体80S以及多聚核糖体的明显峰形。各分馏组分的等分试样被合并为三组。

前多聚核糖体、轻度多聚核糖体和重度多聚核糖体。通过实时定量PCR检测mRNA的相对水平。数据表明，微管蛋白mRNA正处于活跃翻译状态。

由于其主要与重多聚核糖体和轻多聚核糖体相关。而Sherp mRNA的翻译活性较低，主要存在于前多聚核糖体和轻多聚核糖体中。

因此，该实验明确展示了该技术研究单个 mRNA 参与翻译过程的能力。此图显示了 HeLa 细胞多聚核糖体分级分离的典型吸光度图谱。蛋白质通过加入 10% 三氯乙酸沉淀浓缩。

通过蛋白质印迹法检测了小亚基核糖体蛋白 RPS6 和大亚基核糖体蛋白 RPL11。它们的分布与吸光度光谱上的明显峰位置高度一致。在本图中，我们展示了通过电泳检测从小鼠睾丸分馏的多聚核糖体中核糖体 RNA 的一个示例。结论。

多聚核糖体分析是一种多功能技术，可用于分析不同条件下多种模式生物中单个mRNA的翻译状态，检测核糖体相关蛋白，并研究翻译调控机制。