在利什曼原虫、人体细胞和小鼠睾丸中的 Polysome 分析

该技术的总体目标是研究翻译过程中个体 mRNA 与多核糖体的结合。多核糖体分析是研究 mRNA 与核糖体和多核糖体结合的强大技术。该技术对于蛋白质合成调控、翻译激活和抑制的研究非常重要。

在这里，我们的团队介绍了多核细胞分级分离的技术，并在三种生物体的示例中介绍了馏分分析技术。寄生虫 重型利什曼原虫，培养的人类细胞和动物组织。该方法包括四个主要步骤：裂解物制备、蔗糖梯度制备和超速离心、多核糖体分级分离和样品采集。

馏分分析。收集来自不同来源的细胞，通过针头或 Dounce 匀浆器在裂解缓冲液中裂解。离心用于去除细胞碎片，澄清裂解物。

通过在梯度制造器中混合 10% 和 50% 蔗糖溶液形成连续蔗糖梯度。裂解物上样于梯度的顶部。超速离心分离与不同数量的核糖体相关的 mrNA。

在分馏过程中由 UV 检测器监测，形成不同的吸收剂光谱。裂解物制备。裂解物的制备方法因来源而异。

裂解液制备后，无论样品来源如何，程序都是相同的。主要利什曼原虫细胞质裂解物制备。将利什曼原虫主要细胞以每毫升 100， 000 个细胞的密度置于 30 毫升培养基中。

此步骤在生物安全柜中进行。将装有利什曼原虫培养物的培养瓶放入培养箱中，并在 27 摄氏度下培养细胞，直到对数期。通常需要大约两天的时间才能生长。

利什曼原虫主要细胞在显微镜下很容易看到。将放线菌酮添加到生长的利什曼原虫培养物中，最终浓度为 100 μg/mL，以阻止翻译 mRNA 上的核糖体。将细胞放回 27 摄氏度的培养箱中 10 分钟。

放线菌酮处理完成后，将细胞转移至 50 毫升锥形管中，以 1， 800 g 离心 8 分钟。弃去上清液。用 30 毫升 pbs 洗涤细胞并离心。

弃去上清液，将细胞重悬于 1 毫升 pbs 中。取等分试样的细胞，与甲醛溶液混合。然后通过血细胞计数器计数细胞。

将所需数量的细胞转移到微量离心管中。在 4 摄氏度下以 1， 800 g 离心细胞 8 分钟。然后丢弃上清液。

细胞沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂和 RNAsin 的 1 mL 裂解缓冲液中。将细胞穿过 23 号针头 3 次。通过针头后，裂解物变得透明。

在 4 摄氏度下以 11， 200 g 离心 10 分钟以澄清裂解物。将澄清的裂解物转移到新鲜的微量离心管中，并保持在冰上，直到蔗糖梯度超速离心。从培养的人细胞制备细胞质裂解物。

在 37 摄氏度的培养箱中，用 5% CO2 在培养箱中的大板中培养 HeLa 细胞。向生长的 HeLa 细胞中加入放线菌酮，最终浓度为 100 μg/mL，以阻止翻译 mRNA 上的核糖体。将细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 10 分钟。

吸出培养基，用冷 pbs 在冰上洗涤板两次。向板中加入 500 微升裂解缓冲液并刮擦细胞。将裂解的细胞转移到微量离心管中。

将细胞穿过 23 号针头 3 次。以 11， 200 g 离心 8 分钟以澄清裂解物。离心后，将试管移到冰上，并将上清液转移到新试管中。

取等分试样，稀释，并使用纳米滴测量 260 纳米处的吸光度。如果有多个样品，请将裂解物调整至相同的光密度，并将样品保持在冰上，直到蔗糖梯度超速离心。小鼠睾丸的细胞质裂解物制备。

解剖小鼠睾丸。在白膜上做一个小切口，收集睾丸的半孔小管，并将它们转移到含有 5 毫升 PBS 的锥形管中。用力混合组织。

让组织在冰上沉淀 5 分钟。取出缓冲液，再用 pbs 洗涤两次。将曲细精管转移到 2 mL 试管中，并以 500 g 离心 1 分钟。

去除上清液。向小管中加入 500 μL 裂解缓冲液，并使用移液管破坏组织。将悬浮液转移到小体积 dounce 均质器中。

用玻璃杵敲击 7 到 8 次来破坏组织。将裂解物转移到微量离心管中。将样品在 12， 000 g 和 4 摄氏度下离心 8 分钟以清除裂解物。

将上清液转移到新管中，并保持在冰上。然后，继续进行蔗糖梯度制备。蔗糖梯度制备。

将超速离心管放入微块中，并沿块的上层画线。然后将试管转移到稳定的架子中。取一个 10 毫升注射器，并附有分层装置，并在注射器中加入 10% 蔗糖溶液。

在超速离心管底部轻轻释放它，直到蔗糖溶液达到标记。用 50% 蔗糖溶液填充另一个注射器，然后小心地将其分层装置穿过 10% 蔗糖层插入管底部。从底部开始轻轻释放蔗糖溶液，直到它到达试管上的标记。

然后用提供的盖子密封试管。要准备蔗糖梯度，请打开梯度制作器设备。然后使用向上或向下按钮调平板，然后按 Done。

调平板后，按 grad。转到梯度菜单列表并选择 SW41 转子。然后选择所需的蔗糖梯度。

按使用。将磁力架基管支架放在梯度制造器上。然后将试管转移到支架中。

最多可以同时准备六个梯度。按 run。渐变生成器以程序的速度和角度旋转管子，形成线性渐变。

准备梯度只需几分钟。该过程完成后，将试管放在架子上。用蔗糖梯度从超速离心管顶部去除等于样品体积的体积。

小心地将 500 μL 裂解物加载到顶部。将试管放入转子桶中并平衡。在 4 摄氏度下以 260， 000 g 离心 2 小时。

多核糖体分级分离和样品采集。超速离心后，将试管放入转子桶中，置于冰上。打开馏分收集器和分馏器。

单击 Fractionator 菜单上的 scan。将带有收集管的架子放入馏分收集器中。用去离子水填充分馏器侧面的冲洗水箱。

按住冲洗键 10 秒钟以冲洗泵。将装有水的注射器的冲洗适配器连接到活塞上以进行校准。在计算机上打开 Fractionator 软件。

按 calibrate。使用默认设置并按 Ok.Be 键，准备从注射器中注入水。按 Ok 进行校准。

立即开始注入水，持续 5 秒钟。将出现 Zero calibration completed 标志。用注射器取下冲洗适配器，并将尖端连接到分馏器的活塞上。

打开黄铜空气阀，按住 air 键 10 秒钟以干燥空气管和流通池。关闭空气阀。从转子吊篮中取出梯度管，并将其放在支架上。

将试管支架盖盖到试管顶部，小心地将试管移至试管支架中并锁定。将支架放在活塞下方。通常，多核体带可以通过肉眼看到。

为馏分编号和体积引入所需的设置。为文件命名并按 Ok，然后转到 graph 按钮。在下一个窗口中，按 start scan（开始扫描）。

将出现设置，然后按 Ok.收集器将从装订线移动到第一个馏分，活塞将移动到管中。当活塞到达梯度的顶部时，它会减慢到您选择的速度，并收集分数。通常，我们收集 24 个馏分，每个级分 500 微升。

完成后，活塞将移出梯度管。打开黄铜空气阀。按分馏器上的 air 键检索最后一个馏分。

在运行结束时，您将看到梯度的吸光度曲线。馏分分析。获得的馏分可用于 RNA 和蛋白质分析。

RNA 可以通过电泳和 Northern 印迹进行分析，或用于 cDNA 生产，然后进行 RT-qPCR 反应，以分析单个 mRNA 与多核糖体的结合。下一代测序可用于在转录组尺度上分析 mRNA 的翻译状态。对于多核糖体组分的蛋白质分析，用三氯二酸沉淀蛋白质以浓缩它们。

然后通过 Western Blotting 或蛋白质组水平的质谱分析蛋白质。结果。在这里，我们介绍了多核糖体分级分离的结果和对三种生物体的实例分析。利什曼原虫、培养的人类细胞和小鼠组织。

多核糖体分级分离用于研究 Sherp 和微管蛋白 mRNA 在翻译过程中与核糖体和重型利什曼原虫的关联。分馏的吸光度图具有独特的形状，核糖体亚基 40S 和 60S、单体 80S 和多核糖体的典型峰。将馏分的等分试样合并为三组。

前多核糖体、轻多核糖体和重多核糖体。通过实时定量 PCR 研究 mRNA 相对水平。数据表明微管蛋白 mRNA 是主动翻译的。

因为它主要与重多核糖体和轻多核糖体有关。虽然 Sherp mRNA 的翻译不太活跃。它主要与前多核糖体和轻多核糖体相关。

因此，该实验清楚地证明了该技术研究单个 mRNA 参与翻译的能力。该图显示了 HeLa 细胞多核糖体分级分离的典型吸光度图。通过用 10% 三氯乙酸沉淀来浓缩蛋白质。

Western Blot 检测小亚基核糖体蛋白 RPS6 和大亚基核糖体蛋白 RPL11。它们的分布与吸光度光谱上的不同峰密切相关。在该图上，我们提出了一个通过电泳在小鼠睾丸的分级多核糖体中检测核糖体 RNA 的实例。结论。

多核糖体分析是一种多功能技术，可用于分析单个 mRNA 的翻译状态，检查核糖体相关蛋白，并研究不同条件下不同模式生物的翻译调控。