植物多聚核糖体剖面的简单方法
August 28th, 2016
该方案描述了一种根据结合核糖体的数量从植物组织中提取和分级分离转录物的简单方法。它允许对翻译活性进行全局估计并确定特定 mRNA 的翻译状态。
大家好，我是 Cecile。我在马赛的 LGBP 工作。我们将在本视频中描述的方案是一种从各种植物组织中分离多核糖体和单体的简单方法，以识别主动翻译的 mRNA 并研究翻译调控。
例如，我们将向您展示从 6 天大的拟南芥幼苗中分离多核糖体，随后分离 RNA 并分析结果。将种子播种在盘子上，在 4 度下放置两天。然后在六天内种植植物。
收获幼苗并在液氮中研磨。称量 300 毫克植物粉并加入 2.4 毫升多核糖体缓冲液。离心以收集植物片段并将上清液加载到蔗糖梯度的顶部。
然后，超速离心梯度，从下到上收集梯度，并连续读取 OD。将该级分拉入多核糖体、单体和上清液级分中，并沉淀 RNA 过夜。超速离心，重悬沉淀并提取 RNA 用于后续分析。在进行多核糖体分析前几天，准备蔗糖梯度。
准备 50、35 和 20% 蔗糖溶液，并保持在 4 度。倒入 50% 蔗糖层。将其冷冻在零下 40 度的冰箱中。
6 小时后，加入 35% 的蛋鸡层，并在零下 40 度的冰箱中冷冻过夜。倒入前 20% 层并冷冻。在实验当天，从冰箱中取出必要数量的梯度。
加入最后的 20% 蔗糖层，让梯度在冷藏室中解冻。准备我们新鲜采集的样品。在这里，我们使用的是拟南芥六天大的幼苗。
收获液氮冷冻植物并彻底研磨。重量 300 毫克植物粉。快速加入 2.4 ml 新鲜多核糖体缓冲液并匀浆。
将溶液移液到两个 1.5 ml 试管中。离心胞质提取物。移液上清液。
小心避免植物碎片。他们会在下一步中破坏配置文件。将上清液加载到蔗糖梯度上，而不破坏梯度。
将梯度放入 SW 41 转头桶中。离心机。为了可视化多核糖体谱并收集分数，我们使用一个由毛细管制成的简单系统，该系统插入梯度中。它与 UV 比色皿相连。
它与蠕动泵自连接。紫外分光光度计在梯度通过比色皿时连续记录 OD。馏分收集器允许收集 2 ml 馏分。
清洁比色皿并将其放入分光光度计中。从桶中取出梯度，不要打扰它。叶绿素必须集中在梯度的顶部。
将毛细管浸入梯度的底部。启动蠕动泵。从下到上收集梯度，并连续读取 OD。
收集两毫升级分。这是经典配置文件的形状。通过使用盐酸胍和异丙醇进行 RNA 沉淀。
首先，将一体积的盐酸胍倒入 50 毫升试管中，然后加入馏分。然后加入 1.5 体积的异丙醇和 50 微克等量的信使。在零下 20 度下沉淀 RNA 过夜。
将馏分转移到 40 毫升超速离心管中，并用异丙醇平衡管。离心机。取出上清液并风干沉淀。将沉淀重悬于 200 μL 温热的 TE 缓冲液中。
通过进行经典的苯酚氯仿提取进一步提取 RNA。此处显示了来自拟南芥 6 天龄幼苗的多核糖体提取物的代表性概况。主峰对应于单体，即与单个核糖体相关的 mRNA。
概况的第一部分对应于多核糖体组分，即与许多核糖体相关的 mRNA。每个峰都与新核糖体与 mRNA 的结合相匹配。谱的最后一部分对应于所谓的上清液组分，其中包含游离核糖体亚基和 RNA。
大量的 60S 亚基在单体峰旁边形成肩部。为了评估其完整性，从级分中提取的 RNA 可以在经典的 Aragose 凝胶上运行，然后再用于进一步的实验。我们已经使用该方案从拟南芥幼苗中分离出多核糖体，但也从年轻和年老的莲座丛以及本氏烟草、番茄和水稻叶中分离出多核糖体，因此它应该适用于广泛的植物和组织。
纯化的 RNA 与微阵列分析以及鉴定与多核糖体组分相关的小 RNA 兼容。
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概述
本协议描述了一种简单的方法，用于从植物组织中分离多核糖体和单核糖体，从而可以识别正在翻译的mRNA并研究翻译调控。所提供的示例专注于从六天大的拟南芥幼苗中分离多核糖体。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 翻译调控
- mRNA分析
背景
- 了解翻译活动对于研究基因表达至关重要。
- 多核糖体是同时翻译单个mRNA的核糖体簇，而单核糖体是单个核糖体。
- 该方法提供了对特定mRNA翻译状态的洞察。
- 拟南芥在植物研究中作为模式生物。
研究目的
- 从植物组织中分离多核糖体和单核糖体。
- 识别正在翻译的mRNA。
- 研究植物中的翻译调控。
使用的方法
- 将种子播种在平板上并在冷藏下低温处理两天。
- 在最佳条件下培养幼苗六天。
- 从植物组织中分离多核糖体和单核糖体。
- 分析RNA以确定翻译活动。
主要结果
- 成功从拟南芥幼苗中分离多核糖体。
- 识别正在翻译的mRNA。
- 对植物组织中翻译调控的洞察。
- 展示了该方法在研究翻译方面的有效性。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来研究植物中的翻译。
- 它增强了对基因表达调控的理解。
- 该方法可以应用于各种植物物种。
常见问题
Executive Industry Relevance
Polysome profiling provides a direct snapshot of translational activity, enabling mechanistic de-risking of target hypotheses in plant-based biopharma discovery. By distinguishing actively translated mRNA pools, the method supports target validation and phenotypic screening in agriculturally relevant systems. This approach enhances predictive confidence when prioritizing leads for crop improvement or molecular farming applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mRNA abundance to translational output.
- Operational Value: Clarifies pathway activity through ribosome engagement metrics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with sustained translational engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening in plant expression platforms.
- Operational Value: Enables assay standardization via quantitative OD260 profiling and fraction reproducibility.
- Scalability: Supports platform reuse across Arabidopsis, Nicotiana, tomato, and rice tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical biomarker assessment in plant systems.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by isolating mRNA populations defined by ribosome load.
- Disease-Relevant System: Applicable to crop models used in molecular farming and biopharma production.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing before lead identification and enabling translational continuity into preclinical evaluation in plant-based systems.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in polysome/monosome ratios under experimental conditions.
- Screening: Delivers ribosome-profiling readouts that help compare compound or genetic perturbation effects.
- Analytics: Generates quantitative OD260 tracings and fractionated RNA yields for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery in plant molecular farming pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a fractionation capability applicable across diverse plant tissues and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving translational states of target mRNAs.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sucrose gradient fractionation and continuous OD monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation at the translation level.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on translational activity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and polysome buffer preparation.
- Depends on ultracentrifugation equipment and fraction collection systems with UV monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for gradient preparation and fraction pooling protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to non-model plant systems.
- Involves practical limitations related to RNA integrity during fractionation and extraction steps.
