一种简便的植物多聚核糖体分析方法

大家好，我是Cecile。我在马赛的LGBP工作。本视频中我们将介绍一种简单的方法，用于从多种植物组织中分离多聚核糖体和单核糖体，以鉴定正在活跃翻译的mRNA，并研究翻译调控机制。

以一个实例为例，我们将向您展示如何从六天大的拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗中分离多聚核糖体，随后提取RNA并分析结果。将种子播种于培养皿中，在4°C条件下放置两天，然后将植物生长六天。

收获幼苗并在液氮中研磨。称取300毫克植物粉末，加入2.4毫升多聚核糖体缓冲液。离心收集植物碎片，将上清液加至蔗糖梯度的顶部。

超速离心梯度，然后从底部到顶部连续读取 OD 值。将组分分别收集为多聚核糖体、单核糖体和上清液组分，并过夜沉淀 RNA。超速离心后，重悬沉淀物并提取 RNA 用于后续分析。在进行多聚核糖体分析前数天，制备蔗糖梯度。

配制 50%、35% 和 20% 的蔗糖溶液，并置于 4 度保存。倒入 50% 蔗糖层，于 -40 度冰箱中冷冻。

6 小时后，加入 35% 的层，并在 -40 °C 冰箱中冷冻过夜。倒入第一个 20% 的层并进行冷冻。在实验当天，从冰箱中取出所需数量的梯度液。

加入最后一层20%蔗糖溶液，并将梯度离心管置于冷室中解冻。准备我们 freshly 采集的植物样品。此处我们使用的是六天大的拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗。

收获液氮冷冻的植物材料并充分研磨。称取300毫克植物粉末，迅速加入2.4毫升新鲜多核糖体缓冲液并匀浆。

将溶液移液至两个1.5毫升离心管中。离心细胞质提取物。吸取上清液。

注意避免带入植物碎片，否则会影响下一步的梯度分布。将上清液小心地加到蔗糖梯度上，避免破坏梯度结构。

将梯度液放入SW 41转子吊桶中，进行离心。为观察多聚核糖体图谱并收集组分，我们使用一种简易系统，该系统由插入梯度液中的毛细管连接至紫外比色皿构成。

通过蠕动泵实现自连接。紫外分光光度计在梯度流经比色皿的过程中持续记录光密度（OD）。组分收集器可收集每管2毫升的组分。

清洗比色皿并将其放入分光光度计中。从离心管中取出密度梯度时不要扰动其结构。叶绿素必须集中在密度梯度的顶部。

将毛细管插入梯度液底部。启动蠕动泵。从底部到顶部收集梯度液，并持续读取光密度（OD）。

收集2毫升的组分。此处为典型的图谱形状。RNA沉淀通过使用盐酸胍和异丙醇进行。

首先，将一份体积的盐酸胍加入50毫升离心管中，然后加入该组分。接着加入1.5份体积的异丙醇和50 µg等量的载体。在-20 °C下过夜沉淀RNA。

将组分转移至40毫升超速离心管中，并用异丙醇平衡管重。离心。弃去上清液，风干沉淀。将沉淀重悬于200微升温热的TE缓冲液中。

通过经典的苯酚-氯仿抽提法进一步提取RNA。此处展示的是六天龄拟南芥幼苗多聚核糖体提取物的代表性图谱。主峰对应于单核糖体，即与单个核糖体结合的mRNA。

图谱的第一部分对应多聚核糖体组分，即与多个核糖体结合的 mRNA。每个峰代表一个新的核糖体与 mRNA 的结合。图谱的最后一部分对应所谓的上清组分，其中含有游离的核糖体亚基和 RNA。

大量60S亚基在单体核糖体峰旁形成一个肩峰。为评估其完整性，可将从各组分中提取的RNA在进行后续实验前通过经典的琼脂糖凝胶电泳进行分析。我们已使用该方案从拟南芥幼苗、幼嫩及衰老的莲座叶，以及从本氏烟、番茄和水稻叶片中分离多聚核糖体，因此该方法应适用于多种植物及组织。

纯化的RNA可用于微阵列分析，以及与多聚核糖体组分相关的小RNA的鉴定。