Name: 荧光技术结合测定活细胞中的力敏感蛋白动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解FRET张力传感器与FRAP技术联用方法，用于活细胞中力敏感蛋白（如vinculin）动力学研究。该技术为机械生物学研究提供分子尺度信息，揭示蛋白质响应机械力的行为机制。

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本工作得到了美国国家科学基金会职业奖（NSF-CMMI-14-54257）、美国心脏协会资助（16GRNT30930019）和美国国立卫生研究院资助（R01GM121739-01）的支持，上述资助授予Brenton Hoffman博士，此外Katheryn Rothenberg还获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金。&#160;本内容完全由作者负责，不代表美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的官方观点。

作者无任何利益冲突需要披露。

FRET-FRAP 方法能够直接测量对力敏感的蛋白质动态，这一特性在活细胞内一直难以直接探测。蛋白质动态对分子载荷的敏感性对其作为力传递或力转导分子的功能至关重要。载荷的存在是传递细胞内产生或外界施加的力（称为力传递）以及将这些力转化为可被生物化学检测的信号（称为力转导）所必需的。然而，载荷的变化会影响蛋白质结合状态的持续时间；因此，蛋白质承受载荷的时间越短，力传递给其他蛋白质或转化为可检测生化信号并被感知的机会就越少。FRET-FRAP 方法通过在更广泛的细胞背景下实现对力敏感动态的分子尺度测量，弥合了分子水平与细胞水平之间的鸿沟。此外，该方法允许在通过生化或机械方式扰动细胞内或细胞外环境的同时进行这些测量。该技术适用于任何基于 FRET 的张力传感器，可用于研究多种亚细胞结构及细胞外环境中蛋白质的力学状态。
确保获得理想FRET-FRAP测量结果的关键步骤包括优化成像参数以及进行数据分析与解释。如本实验方案所述，优化成像参数对于限制样品的光损伤至关重要，同时可区分目标结构与动态过程，并为FRET计算提供足够的信号强度。在特定细胞系和目标蛋白的研究初期即确立这些成像参数，将有助于...

细胞外环境富含调控细胞行为的生化和物理信号。特别是，微环境的物理特性可介导细胞生长、迁移和分化等关键细胞功能1,2,3,4。微环境力学特性的失调是多种尚无有效治疗方法的疾病的重要组成部分，例如癌症5、动脉粥样硬化6和纤维化7。要全面理解细胞如何将物理刺激转化为生化可检测信号（该过程称为机械转导），需要阐明介导力传递的分子机制，包括细胞内外以及多种亚细胞结构内部的力传递过程。
在亚细胞结构内部，蛋白质持续发生着动态更替，其与结合伙伴之间的结合与解离取决于相互作用的强度8。为了使力能够成功跨越物理距离传递，必须存在一条连续不断的蛋白质-蛋白质相互作用链，这意味着蛋白质的周转速率必须足够缓慢，以维持并将其所受的力传递给其结合伙伴9。尽管蛋白质-蛋白质相互作用通常由蛋白质结构域之间的多个非共价键组成，但这种相互作用常被概念化为一种可在不同条件下从结合态转变为非结合态的状态10,11。对于特定的蛋白质-蛋白质相互作用而言，外力可能对其相互作用寿命无影响，称为&#34;理想键&#34;；也可能缩短其寿命，称为&#34;滑脱键&#34;；或延长其寿命，称为&#34;捕获键&#34;10。因此，蛋白质所受载荷与其动力学行为之间存在着复杂的关联，我们将这种关系称为力敏感性动力学。
为了理解载荷对键合动力学的影响，研究人员已在单分子水平上开展了一系列信息丰富的实验。通过使用分离的蛋白质或蛋白质片段，结合磁镊、光镊和原子力显微镜等操纵技术，这些研究已证明多种相关蛋白质存在力敏感的蛋白质-蛋白质相互作用11,12。整合素13和钙黏蛋白14均为跨膜蛋白，分别在细胞-基质和细胞-细胞相互作用的形成中起重要作用，其动力学行为均已被证实会因受力而发生改变。在细胞内，黏着斑蛋白（vinculin）以依赖于力学的方式被招募至踝蛋白（talin）15和α-连环蛋白（α-catenin）16，并可与肌动蛋白形成捕获键（catch bond）17，表明在载荷条件下，黏着斑蛋白在黏着斑（FAs）和黏附连接（AJs）中均发挥关键作用。单分子研究能够分离特定的蛋白质-蛋白质相互作用，获得明确的结果，但无法反映细胞环境的复杂性。
标志性实验表明，多种亚细胞结构（包括黏着斑（FAs）和黏附连接（AJs））具有力学敏感性，并会在细胞自身产生或外界施加的力学负荷下表现出增强的组装效应18,19,20,21,22。此外，多个理论模型提示，这种力学敏感性组装可能由力敏感的蛋白质动态过程所驱动23,24,25。为了在活细胞内研究这些力敏感的动态过程，已有若干间接方法被采用。荧光漂白恢复技术（FRAP）及其相关技术为测量细胞内蛋白质动态提供了相对简便的方法26,27,28,29。然而，对蛋白质所受负荷的测量则较为有限。一种典型方法是将暴露于细胞骨架抑制剂（用于降低细胞整体收缩力）的细胞与未暴露的细胞进行蛋白质动态比较8,30,31。从概念上讲，这相当于在高负荷与低负荷状态之间进行比较。但该方法并未对两种状态下蛋白质所承受的负荷进行量化，且抑制剂可能带来非预期的生化效应，例如导致F-肌动蛋白丝上关键结合位点的丢失。另一种针对黏着斑（FAs）的方法是利用牵引力显微镜测量黏着斑对基底施加的总作用力，以估算分子水平的负荷，并分析其与黏着斑内单一蛋白质动态之间的关系32。尽管该方法可实现对总作用力的量化，却无法提供分子特异性的信息。黏着斑由超过200种不同蛋白质组成，其中许多蛋白均可承受力学负荷33。因此，仅测量黏着斑的总力输出可能掩盖了多种力传递通路并存的可能性，也无法可靠地反映特定蛋白质所受的负荷。
与以往的力学生物学方法不同，基于FRET的张力传感器的出现使得能够直接测量活细胞内特定蛋白质所承受的力学载荷34,35,36。本文介绍了一种将基于FRET的张力传感器与基于FRAP的蛋白质动力学测量方法相结合的实验方案，我们将该技术称为FRET-FRAP。该方法可同时测量蛋白质所受力学载荷及其动力学行为，从而实现对活细胞中力敏感性蛋白质动力学的评估（图1）。目前，FRET-FRAP技术已成功应用于机械连接蛋白vinculin的力敏感性动力学研究37。研究人员已开发出多种针对不同亚细胞结构中关键蛋白质的张力传感器。例如，针对黏着斑（FAs）中的vinculin34和talin38,39，黏附连接（AJs）中的cadherin和catenin40,41,42，细胞核LINC复合物中的nesprin43，细胞骨架中的α-actinin44和filamin36，以及糖萼中的MUC-145等均已有相应的传感器被开发46。同样，FRAP技术也已被广泛用于研究局灶性黏附8,31、黏附连接47、肌动蛋白皮层26以及细胞核48中力敏感蛋白的动力学行为。未来，FRET-FRAP技术可广泛适用于上述已有的或新开发的各类张力传感器，从而在多种亚细胞结构和生理背景下实现对力敏感性动力学的测量。为此，我们提供了一个详细且通用的FRET-FRAP技术实施方案，适用于不同生物系统。希望该方案能够推动开展多种实验，深入阐明各类力敏感蛋白在调控力传递及介导细胞行为中的作用。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>60倍物镜，数值孔径1.35</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>自动载物台</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIX3</td><td></td></tr><tr><td>定制二向色镜</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>T450/514rpc</td></tr><tr><td>定制 mTFP1 发射滤光片</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET485/20m</td></tr><tr><td>定制 mTFP1 激发滤光片</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET450/30x</td></tr><tr><td>定制 Venus 激发滤光片</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET514/10x</td></tr><tr><td>DMEM-gfp 活细胞成像培养基</td><td>蓝宝石</td><td>MC102</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td>含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>人纤维连接蛋白</td><td>康宁</td><td>47743-654</td><td></td></tr><tr><td>FRAPPA 校准片</td><td>Andor</td><td></td><td>与 FRAPPA 装置一并提供</td></tr><tr><td>带有515 nm激光器的FRAPPA系统</td><td>安道尔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃底荧光培养皿</td><td>世界精密仪器公司</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>HEK293-T细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>六亚甲基溴化物，Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>JMP Pro 软件</td><td>SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda 10-3 电动滤光轮</td><td>Sutter Instruments</td><td>LB10-NW</td><td></td></tr><tr><td>LambdaLS 弧光灯，配备 300W 无臭氧氙灯泡</td><td>Sutter Instruments</td><td>LS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 的 MetaMorph</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型加湿系统</td><td>Bioptechs</td><td>130708</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ 细胞分选仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>目标加热培养基</td><td>Bioptechs</td><td>150819-13</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 包膜质粒</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRRL 载体</td><td></td><td></td><td>Kam Leong 博士（哥伦比亚大学）惠赠</td></tr><tr><td>psPax2 包装质粒</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 相机</td><td>滨松光子学</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>稳定的Z轴载物台加热器</td><td>Bioptechs</td><td>403-1926</td><td></td></tr><tr><td>Venus 发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-571/72</td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

细胞通过一种称为机械转导的过程，将机械刺激转化为生物化学上可检测的信号，从而感知并响应其周围环境中的物理信号。机械转导中的一个关键步骤是细胞内外环境之间力的传递。为了实现力的传递，必须通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用形成持续且连续的物理连接。对于特定的蛋白质-蛋白质相互作用而言，机械负荷可能对相互作用无影响，也可能导致相互作用更快解离，甚至可能稳定该相互作用。理解分子水平上的力学负荷如何决定活细胞中蛋白质的周转，可提供有关蛋白质力学状态的重要信息，进而阐明其在机械转导中的作用。目前用于测量力敏感性蛋白质动态的技术，要么缺乏对蛋白质受力的直接测量，要么依赖于非细胞环境下的测量。本文中，我们描述了一种荧光共振能量转移-光漂白后荧光恢复（FRET-FRAP）技术的操作方案，该技术能够在活细胞内测量力敏感性蛋白质的动态变化。该技术原则上适用于任何基于FRET的张力传感器，有助于在多种亚细胞结构和不同细胞类型中研究力敏感性蛋白质的动态行为。

FRET-FRAP 结合了两种荧光技术，即 FRET 和 FRAP。由于我们关注的是蛋白负载的影响，因此采用了基于 FRET 的张力传感器34,46。这类传感器通常包含一个由两个荧光蛋白（如 mTFP1 和 VenusA206K）通过鞭毛状连接肽相连构成的张力感应模块（图 1A）。当该模块被插入蛋白的头部与尾部结构域之间时，即可测量跨越该蛋白所受的力学负载。在分析 FRET 数据时，使用受体通道采集的图像来评估张力传感器的定位及其浓度，因为该信号不受 FRET 效应的影响（图 1B）。在计算出 FRET 效率后，可通过色度标尺可视化蛋白负载：FRET 效率降低并趋向冷色调表示蛋白负载增加，而 FRET 效率处于红色范围则表明蛋白负载较低（图 1B）。FRAP 成像通过激光对单个亚...

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。

细胞通过一种称为机械转导的过程，感知其环境中的物理信号，并将机械刺激转化为生物化学上可检测的信号以作出响应。

该方法可以解答力学生物学领域的一些关键问题，例如力如何在细胞内以及细胞与其环境之间传递和感知。该技术的主要优势在于，它能够获取有关蛋白质在活细胞天然环境中响应机械力的分子尺度信息。尽管该方法已专门用于研究局灶性黏附蛋白vinculin，但也可应用于其他对机械力敏感的蛋白质，例如talin、cadherins或nesprin。该方法的可视化演示至关重要，因为正确的成像设置虽具挑战性，但对分析成功十分必要。首先，按照文本方案中的详细说明，在目标细胞类型中稳定表达张力传感器构建体。为准备用于接种细胞的基底，需准备四个35毫米玻璃底培养皿。在细胞培养超净台中，于15毫升锥形管内配制4毫升浓度为10微克/毫升的纤连蛋白（fibronectin）无菌磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。轻轻倒置混匀一次，于细胞培养超净台中静置5分钟。随后，将1毫升纤连蛋白溶液加入每个玻璃底培养皿中。将纤连蛋白溶液在室温下孵育一小时，或在 4°C 过夜。然后吸除纤连蛋白溶液，并用 PBS 洗涤一次。在培养皿中保留 1 mL PBS，直至细胞准备接种。计数细胞后，将30,000个细胞接种至每孔含纤维连接蛋白包被的玻璃培养皿中，加入适量的完全培养基，终体积为1.5毫升。接种后让细胞贴壁伸展4小时。在细胞贴壁2小时时，吸除生长培养基，并用成像培养基冲洗一次。留下 1.5 毫升成像培养基。在开始校准之前，按照文本方案中的描述预热显微镜。为了校准 FRAP 激光，首先打开激光配置窗口。将照明设置调整为适合样品激光曝光的相应FRAP照明设置。然后将照明设置调整为仅对受体荧光染料成像的合适照明条件。在坐标系设置下选择需要校准的物镜。取消勾选“手动单击校准点”，勾选“校准期间显示图像”。将停留时间设置为 10,000 微秒，脉冲次数设置为 100。现在将校准载玻片（由溴化乙锭密封在载玻片与盖玻片之间制成）放入载物台适配器中，盖玻片一侧朝下。使用受体照明设置聚焦于载玻片表面，该表面可识别为具有最亮信号的焦平面。涂层中的微小缺陷将可见，有助于聚焦。移动载玻片至成像平面内荧光均匀的区域。首次校准时点击“创建设置”，后续校准则点击“更新设置”。软件将启动校准程序，自动进行漂白并检测漂白点的位置。通过评估最终图像来确保校准成功，最终图像应为一个3×3的漂白点阵列，各点应分布均匀且聚焦清晰。将校准图像保存以供日后参考。取下校准载玻片并妥善保存。每次实验开始前应进行校准，但样品之间无需重复校准。准备用于活细胞成像的显微镜系统，最好配备加热载物台和物镜，以及二氧化碳控制装置。平衡系统20分钟。随后将表达张力传感器的细胞样本之一放入显微镜样品 holder 中进行成像。让细胞平衡10分钟。为确保成像细胞的健康状态，需在成像腔室内维持37摄氏度的温度。使用蠕动泵以每分钟15毫升的流速向样品通入加湿的5%二氧化碳，以维持pH值。打开多维采集（Multi-Dimensional Acquisition，MDA）工具，使用FRET成像参数（包括不同的滤光片组）进行设置。将此MDA以“MDA_FRET_日期”为名称保存至实验文件夹中。再设置另一个包含FRAP成像参数的MDA，包括不同的滤光片组、时间序列设置，以及在预漂白采集后通过Journal程序触发激光脉冲的设置。将此 MDA 保存到实验文件夹中，命名为 MDA_FRAP_日期。在屏幕顶部的工具栏中，选择“Journal”（日志），然后点击“Start Recording”（开始记录）。打开 MDA 窗口，加载 MDA_FRET_日期 状态，然后点击“Acquire”（采集）。然后加载 MDA_FRAP_date 状态并点击采集。采集结束后，在屏幕顶部的工具栏中选择“日志”->“停止记录”。将此日志保存到实验文件夹中，命名为 FRETFRAP_date，并将其添加到工具栏以便快速访问。关闭 MDA 窗口。在“采集”下的图像采集界面中导航样本，以最短曝光时间并结合中性密度滤光片进行采集，以识别目标细胞。通过进入“设备”中的“聚焦”来设置连续自动聚焦。手动调节焦距，直至到达正确的成像平面。点击“设置连续对焦”，并等待系统进行调整。系统调整完成后，点击“开始连续对焦”。然后寻找一个张力传感器在目标结构上定位清晰的细胞，并拍摄一张图像。绘制一个矩形感兴趣区域（ROI），以标示漂白的位置。保存该 ROI 的位置。现在初始化 FRETFRAP_date 期刊，这将开始采集 FRET 图像，随后初始化 FRAP 时间序列。重复这些步骤，直到获得 10 到 15 组图像。然后按照文本方案中详述的方法分析 FRET-FRAP 数据。此处展示的是在对黏着斑进行分割和掩膜以分离后，对纽蛋白张力传感器进行FRET成像的代表性结果。可在细胞内观察到纽蛋白受力的空間分布差异。FRAP成像与分析可能受到黏着斑稳定性的影响。在成像期间快速移动的黏着斑可能难以准确追踪。这种情况通常表现为荧光漂白后恢复（FRAP）曲线中存在不连续性，导致曲线无法解读。对于野生型纽蛋白（vinculin），蛋白负荷与周转速率之间存在负相关关系，表明纽蛋白可被机械力稳定。在纽蛋白（vinculin）中引入突变以影响其与踝蛋白（talin）的结合，会导致相关性发生逆转，表明无法与踝蛋白结合的纽蛋白会因受力而变得不稳定。在进行该操作时，需注意正确制备样品，确保细胞以内源性水平表达传感器，并谨慎选择成像参数。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如免疫荧光、测量细胞尺度动态变化，或使用不同抑制剂处理细胞，以回答更多问题，例如目标蛋白如何与其他亚细胞组分相互作用以协调对力学刺激的响应。

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