荧光技术结合测定活细胞中的力敏感蛋白动力学

这种方法可以回答机械生物学领域的关键问题，例如力如何在细胞内以及细胞之间及其环境之间传播和感知。这项技术的主要优点是，它允许访问分子量表信息，了解蛋白质如何对活细胞原生环境中的机械力的反应。虽然这种方法已特别应用于研究焦粘附蛋白文库林，它也可以应用于其他机械敏感的蛋白质，如塔林，卡德林或内斯帕林。

此方法的可视化演示至关重要，因为正确的成像设置是困难的，但对于分析的成功是必要的。从所需单元类型中张力传感器构造的稳定表达式开始此过程，如文本协议中详述的。要准备细胞播种的基板，请获取四个 35 毫米玻璃底盘。

在15毫升锥形管中的细胞培养罩中工作，在无菌磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中，每毫升纤维素制造4毫升10微克。轻轻反转管一次混合，让溶液在细胞培养罩中坐五分钟。然后移液一毫升纤维素溶液到每个玻璃底盘。

将纤维素溶液留在餐具上一小时，在室温下或在四摄氏度下过夜。然后吸气纤维素溶液，并用PBS冲洗一次。在盘子上留一毫升PBS，直到细胞准备好播种。

计算细胞后，将3万个细胞种子播种到每个纤维素涂层的玻璃盘中，用适当的完整培养基，最终体积为1.5毫升。允许细胞在播种后扩散四小时。在两个小时的传播中，吸气生长介质，并用成像介质冲洗一次。

留下 1.5 毫升的成像介质。在开始校准之前，如文本协议中所述，预热显微镜。要校准 FRAP 激光器，请先打开激光配置窗口。

将照明设置设置为适当的 FRAP 照明设置，以激光照射样品。然后将"照明"设置设置为仅用于成像接受器荧光的照明设置。在坐标系设置下选择要校准的目标。

取消选中 手动单击校准点并在校准过程中检查显示图像。将停留时间设置为 10，000 微秒，将脉冲数设置为 100。现在，将由溴化乙基基密封的校准滑块放入舞台适配器中，盖板滑侧向下。

使用接受器照明设置聚焦在幻灯片表面，可识别为具有最亮信号的焦点平面。涂层中的小缺陷将可见，有助于对焦。将幻灯片移动到成像平面上荧光均匀的区域。

单击第一次校准的创建设置或后续校准的更新设置。该软件将初始化校准过程，自动漂白和检测漂白点的位置。通过评估最终图像确保校准成功，最终图像将是一个三按三格的漂白点网格，应均匀分布并聚焦。

保存校准图像供将来参考。拆下校准幻灯片并安全地存放。应在开始每个实验之前执行校准，但不需要在样本之间执行校准。

为活细胞成像准备显微镜设置，最好有加热阶段和目标，以及二氧化碳控制。允许平衡 20 分钟。现在，将表达张力传感器的细胞生成样本之一放入显微镜支架中进行成像。

让单元格平衡 10 分钟。为确保成像细胞的健康，在成像室中保持37摄氏度的温度。使用近光泵以每分钟 15 毫升的速度将加湿的 5% 二氧化碳通过样品，以保持 pH。

打开多维采集工具（MDA）并设置其F FRET成像参数，包括不同的滤波器集。保存此 MDA 到实验文件夹，名称为MDA_FRET_date。使用 FRAP 成像参数设置另一个 MDA，包括不同的滤波器集、延时设置和日志，以在预漂白采集后脉冲激光。

保存此 MDA 到实验文件夹，名称为MDA_FRAP_date。在屏幕顶部的工具栏中，选择"日记本""开始录制"。打开 MDA 窗口，加载MDA_FRET_date，然后按"获取"。

然后加载MDA_FRAP_date，然后按"获取"。在采集结束时，在屏幕顶部的工具栏中，选择"日志"，停止录制。将此日志保存到实验文件夹，FRETFRAP_date并将其添加到工具栏中，以便于访问。

关闭 MDA 窗口。使用"获取"下的图像采集导航样本，以最少的曝光时间和中性密度滤波器获取样本，以识别感兴趣的细胞。通过导航到"设备、对焦"设置连续自动对焦。

手动聚焦样品，直到到达正确的成像平面。单击"设置连续对焦"并等待系统调整。系统调整后，单击"开始连续对焦"。

然后找到一个表示张力传感器的单元，将清晰定位到感兴趣的结构，然后捕捉图像。绘制一个矩形感兴趣区域（或 ROI）以突出显示漂白地点。存储此 ROI 位置。

现在初始化FRETFRAP_date日志，该日志将开始获取 FRET 图像，然后初始化 FRAP 延时。重复这些步骤，直到获得 10 到 15 个图像集。然后分析F FRET-FRAP数据，详见文本协议中。

此处显示的具有代表性的 FRET 成像的文库林张力传感器，经过分割和掩蔽，以隔离焦粘附。在整个细胞中可以看到葡萄球素负载的种族变化。FRAP 成像和分析可能受到焦粘附稳定性的影响。

在成像期间快速转位的焦点粘附可能难以准确跟踪。通常，这由包含不连续性和不可解释的 FRAP 曲线指示。对于野生型葡萄林，蛋白质载荷与周转率呈反比相关，表明葡萄林以力稳定。

引入文库林的突变以影响其与塔林的结合，导致相关性的逆转，表明无法结合塔林的葡萄林被力破坏。在尝试此过程时，必须记住正确准备样本，确保细胞在内源水平上表达传感器，并仔细选择成像参数。按照这个程序，其他方法，如免疫荧光，测量细胞规模动力学或具有挑战性的细胞与各种抑制剂，以回答其他问题，如感兴趣的蛋白质如何与其他亚细胞成分相互作用，以协调对力的反应。