光片荧光显微术捕捉4维图像调制剪切应力对斑马鱼心脏发育的影响

在这里, 我们提出一个协议, 以可视化发展的心在斑马鱼在4维 (4)。4维成像, 通过光片荧光显微镜 (LSFM), 采取3维 (3 维) 图像随着时间的推移, 重建发展的心脏。我们定性和定量地显示, 剪切应力激活心内膜凹槽信号在室发展期间, 促进心脏 trabeculation。

这种方法可以帮助回答发育心脏力学生物学领域的关键问题，例如使用 4D 光片显微镜通过缺口信号调节心脏小梁的剪切应力。这种技术的主要优点是它用 5 微米的平面照亮样品的薄片，从而减少光漂白和光损伤。此外，我们的计算算法允许我们重建一个 4D 跳动的斑马鱼心脏。

该技术的意义延伸到先天性心脏病的诊断，因为它允许在早期发育阶段到后期表型对心脏小梁进行体内顺序可视化。一般来说，刚接触这种技术的人会发现，随着时间的推移，很难想象三维思考。此外，创建系统并准确对齐它需要时间。

首先，使用隔板将繁殖池中的雄性和雌性斑马鱼分开。然后，提起隔板，让雄性和雌性斑马鱼繁殖。收集斑马鱼胚胎并将吗啉寡核苷酸注射到胚胎中以抑制小梁形成。

接下来，通过在 100 毫升蒸馏水中加入 1 克琼脂糖来制备 1% 琼脂糖凝胶，并加热直至所有琼脂糖溶解。让琼脂糖冷却，然后使用 20 微升移液管将准备好的胚胎和琼脂糖之一加载到一个小塑料管中。将管子固定在显微镜载物台上并使用 10 倍物镜。

使用旋钮调整物镜，使胚胎的顶部聚焦。使用 5 微米厚度的薄片在多个心脏跳动周期中拍摄整个鱼胚胎的图像。收集 500 个 xy 帧，曝光时间为 10 毫秒。

然后，将 z 通道中的载物台移动一微米到新层并重复成像过程。继续想象每个 z 平面 500 帧，直到整个心脏完全成像。接下来，打开图像处理软件并开始将图像堆叠成 3D。

为此，首先单击 open data（打开数据）。在这里，选择要堆叠到 3D 中的所有图像，然后选择 load （加载）。然后添加 0.65 x 0.65 x 1 微米的体素大小，然后单击 Ok.

输入正确的体素大小对于准确分析 3D 图像至关重要。现在，单击多平面视图框并可视化 3D 图像。右键单击蓝色切片单点 tiff 框，选择 display（显示），然后单击 volran。

在编辑菜单中，选择选项，然后选择编辑色图。使用框调整颜色，然后单击 好.仍在图像处理软件中，单击文件，然后打开时间序列数据。

选择刚刚通过单击加载创建的 3D tiffs，然后输入与以前相同的体素大小。右键单击蓝色切片单点 tiff 框，然后选择 display （显示），然后选择 volran。现在，单击编辑。

选择选项。然后选择 编辑彩图.使用框调整颜色，然后单击 好.

接下来，右键单击时间序列控件，单击 Movie maker，然后按播放按钮以观看电影。最后，添加 文件名、帧大小、帧速率、质量等于 1，然后输入 monoscopic。然后单击 apply。

最后，导出视频。生物力学力，如血流动力学剪切应力，与心脏形态发生密切相关。在这里，使用光片荧光显微镜观察受精后 75 小时突出到心室腔的小梁嵴。

受精后 100 小时，可以清楚地看到小梁网络。在用 gata1aMO 显微注射处理的胚胎中，造血和粘度降低了 90%。这种降低的粘度减轻了血流动力学剪切应力，导致启动延迟和小梁网络密度降低。

通过上调 Notch 相关基因表达，在受精后 75 小时和受精后 100 小时挽救小梁形成，能够恢复小梁网络的这种延迟和密度。因此，gata1a 吗啉寡核苷酸降低了血流动力学力，导致 Notch 信号传导下调，而 Nrg1-mRNA 挽救了受调节的 Notch 相关基因并重新启动小梁形成。一旦掌握，如果作得当，这种成像技术可以在大约两个小时内完成。

发展后，这项技术为心脏发育领域的研究人员研究 Notch 基因中的因子铺平了道路，这些因子负责斑马鱼小梁的正确形成。观看此视频后，您应该对如何使用选择性平面照明显微镜采集图像并创建 4D 图像文件有很好的了解。不要忘记，使用激光可能非常危险。

在此过程中应始终采取预防措施，例如佩戴合适的眼镜。