Name: 光片荧光显微术捕捉4维图像调制剪切应力对斑马鱼心脏发育的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 了解光片荧光显微术结合计算算法重建四维跳动斑马鱼心脏的方法。该技术通过减少光漂白和光损伤，实现心脏发育的实时可视化，揭示剪切应力通过Notch信号调控心肌小梁形成的机制，为先天性心脏病诊断提供新思路。

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作者谨此感谢斯坦福大学的 William Talbot 提供人源&#160;Nrg1&#160;cDNA，感谢加州大学圣地亚哥分校的 Deborah Yelon 提供&#160;wea&#160;突变体。作者还感谢 Cynthia Chen 在图像采集方面提供的帮助。本研究获得了以下资助：NIH HL118650（授予 T.K. Hsiai）、HL083015（授予 T.K. Hsiai）、HD069305（授予 N.C. Chi 和 T.K. Hsiai）、HL111437（授予 T.K. Hsiai 和 N.C. Chi）、HL129727（授予 T.K. Hsiai）、T32HL007895（授予 R.R. Sevag Packard）、HL134613（授予 V. Messerschmidt）以及德克萨斯大学系统 STARS 项目资金（授予 J. Lee）。

以下方法均按照德克萨斯大学阿灵顿分校（UTA）和加州大学洛杉矶分校（UCLA）动物护理与使用委员会（IACUC）的规程进行。实验分组使用了转基因品系Tg(cmlc2:gfp)、wea (weak atrium) 或 clo (cloche) 突变体，包括：（a）野生型（WT）对照组，（b）gata1a MO 注射组，以及（c）tnnt2a MO 注射组（表 1）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>模型</td>
			<td>名称</td>
			<td>修饰基因</td>
			<td>表型</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照</td>
			<td>野生型</td>
			<td>无</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tg(cmlc2:gfp)</td>
			<td>心肌肌球蛋白轻链 </td>
			<td>心肌中特异性表达的绿色荧光</td>
			<td>34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">壁面剪切应力降低</td>
			<td>弱心房（wea）突变体</td>
			<td>心房特异性肌球蛋白重链</td>
			<td>心房无法收缩，心室致密，心肌壁厚，管腔狭窄，心房扩张 </td>
			<td>37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloche（关闭）突变体</td>
			<td>N/A</td>
			<td>心内膜完全缺失，心房异常扩大而心室细小，心内垫缺如</td>
			<td>41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gata1a 摩尔浓度</td>
			<td>gata1a </td>
			<td>红细胞缺乏导致的贫血</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tnnt2a 摩尔浓度</td>
			<td>tnnt2a</td>
			<td></td>
			<td>39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">壁面剪切应力增加</td>
			<td>EPO mRNA</td>
			<td>无</td>
			<td>严重红细胞增多症，循环血细胞数量增加，血液黏稠度升高</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>异丙肾上腺素</td>
			<td>无</td>
			<td>心率增加</td>
			<td>7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：斑马鱼描述。实验中所用斑马鱼的定义与描述。
1. 研究设置
<ol>
	<li>准备 Nrg1 和 EPO 小梁修复的mRNA。
	<ol>
		<li>获取人类样本 Nrg1 cDNA并从供体质粒中扩增。 
		注意： 人类 Nrg1 cDNA由斯坦福大学的William Talbot惠赠。
		<ol>
			<li>取出必要的试剂和材料，即 PCR 预混液（储存于 -20 °C），引物（参见 表 2)（储存于 -20 °C），PCR板（室温保存）和一个 20 μL 移液器（室温保存）。参见 材料表 例如产品。 
			<img alt="DNA序列比对表，用于遗传分析的人源Nrg1-克隆正向与反向引物序列。" src="/files/ftp_upload/57763/57763tbl2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="表2"> 
			表2：人源引物 Nrg1 克隆</li>
			<li>为每组引物在三个重复中配制预混液 20 μL 移液器。对于一组三个重复样本，使用 37.5 μL 的预混液， 3 μL 无DNA水， 4.5 μL 引物的量。对于更多的三复孔，只需乘以样本数量即可。</li>
			<li>稀释工作液 人 Nrg1 cDNA（20 ng/μg 在引物条带中用无DNA水稀释至指定浓度，以确保有 10 μL 每样本每孔总量 
			注意： 确保1.1.1步骤中的每种溶液均匀分布，可通过上下吹打混匀各溶液。为防止交叉污染，每种样品仅使用一个移液枪头。</li>
			<li>分装 Nrg1 cDNA与 10 μL 将多通道移液器移至PCR板中目标孔。</li>
			<li>添加 14.5 μL 将主混合液加入到孔中的cDNA中。用粘性封板膜密封PCR板，并放入PCR仪中。</li>
			<li>启动PCR仪，并确保循环程序达到所用酶和引物所需的适当温度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>克隆 Nrg1 将cDNA插入质粒pCS2+ 在BamHI和EcoRI位点使用过量的BamHI和EcoRI酶，以确保cDNA在所有质粒中均完成连接。
		<ol>
			<li>混合 Nrg1 cDNA 与供体质粒 pCS2+，市售的预混液和引物（表2). 
			注意： 总反应体积应为 50 μL 与 25 μL 的主混合液， 3 μL 引物和 1 μL 20 ng/μL 带有供体质粒的 Nrg1 cDNA</li>
			<li>将步骤1.1.2.1中的混合物放入PCR仪中，并设置参数以满足以下条件： 98 °C 10 秒 55 °C 5 或 15 秒 72 °C 5 秒/千碱基</li>
			<li>使用纯化试剂盒按照制造商说明书纯化PCR产物。将产物洗脱至 50 μL 洗脱缓冲液</li>
			<li>消化纯化的PCR产物并 5 μg pCS2+ 分别用 BamHI 和 EcoRI 在 37 °C 2 小时 200 μL 反应体系体积。使用商品化试剂盒纯化所得的消化产物，并用洗脱液洗脱 20 μL 和 100 μL Tris-HCl（pH 8.5）的</li>
			<li>连接 4 μL 的 Nrg1 cDNA 和 2 μL pCS2 消化产物+ 质粒在 25 μL 与……反应 1 μL 连接酶催化剂的 16 °C 过夜。 
			注意： 此处可停止操作，进行过夜孵育。</li>
			<li>使用 2 μL 连接步骤1.1.2.5中的连接反应液，并转化至 50 μL 的 E. coli 适用于克隆的细菌细胞（参见 材料表).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过筛选确认转化是否成功 Nrg1 使用PCR筛选cDNA克隆。随机挑选克隆，加入含有特异性引物、聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）的溶液中。 
		注意： 对照组为载体（pCS2+）有插入片段（人cDNA）和无插入片段的菌落。不要挑选过大的菌落，因为过多的细菌会抑制PCR反应。
		<ol>
			<li>从转化产物中挑选8个菌落，并筛选pCS2+-Nrg1 克隆使用来自 PCR 引物的 表 2.</li>
			<li>培养一个克隆 Nrg1 用于分离 pCS2 的 cDNA+-Nrg1 质粒 DNA。接种于 100 μL 的 E. coli 带有 pCS2 的细菌+将Nrg1质粒转入100 mL LB培养基中，于160–225 RPM振荡培养 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转染纯化的pCS2+使用商品化转染试剂，按照生产商说明书将 Nrg1 质粒转染至 6 孔板中的 HEK-293 细胞。</li>
		<li>转染24小时后，使用裂解缓冲液裂解细胞，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至印迹膜，然后用抗-Nrg1 抗体22验证 Nrg1 使用蛋白质印迹法检测蛋白质表达。 
		注意： 对照为不含插入片段的pCS2空载体+ 质粒。若凝胶膜转移过夜，可在此暂停。</li>
		<li>合成 Nrg1 使用与市售产品类似的试剂提取 mRNA 材料表 并遵循制造商的说明。
		<ol>
			<li>取 5 μL pCS2 的+-从分离的细菌培养物中提取 Nrg1 DNA，并用 NotI 进行消化 200 μL 反应 2 小时于 37 °C 线性化质粒。</li>
			<li>使用商品化试剂盒纯化线性化质粒，并用洗脱液洗脱 20 μL Tris-HCl（pH 8.5）</li>
			<li>执行 体外 使用商业RNA提取试剂盒进行转录 20 μL 使用反应 5 μL 按照制造商说明书线性化质粒。</li>
			<li>加入 体外 转录 Nrg1 到 350 μL RNA裂解缓冲液，然后使用RNA提取试剂盒进行纯化。将RNA洗脱至 60 μL Tris-HCl (pH 8.5)</li>
			<li>测定 RNA 浓度，并于 -80 °C 以备将来使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>参照上述步骤 1.1.6.1 - 1.1.6.5 进行操作 EPO cDNA和mRNA的制备，但将cDNA在EcoRI和XhoI位点克隆到pCS2+质粒中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向斑马鱼注射 Morpholino
	<ol>
		<li>设计23 使用在线工具进行 MO 注射（材料表）针对ATG序列的 gata1a4 （5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′）和 tnnt2a5 (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′)</li>
		<li>添加 gata1a 和 tnnt2a 将MO分别加入无核酸酶水中，使终浓度分别为8 ng/nL和4 ng/nL。重复操作 EPO mRNA 的终浓度为 20 pg/nL，确保终体积为 1 mL。</li>
		<li>注射 1 nL 浓度为 8 ng/nL 的溶液 gata1a MO 和 1 nL 的 4 ng/nL tnnt2a 在1至4细胞期将MO分别注射到斑马鱼胚胎中，以降低心室壁剪切应力（WSS）24. 为增加WSS，注入1 nL浓度为20 pg/nL的溶液 EPO mRNA6 在1至4细胞期将物质注入斑马鱼胚胎中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化学处理斑马鱼以抑制小梁形成
	<ol>
		<li>使用 20 mL 移液器，将 10 mg/mL AG1478 用含 1% DMSO 的 E3 培养基稀释至终浓度为 5 μM 在30 hpf时转入15 mL离心管。作为对照，每条鱼仅用1% DMSO处理。</li>
		<li>加入N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）至1%二甲基亚砜（DMSO）中（100 μM) 加入15 mL离心管中的E3培养基，以在40 hpf时以类似方式抑制Notch信号通路。作为对照，仅使用1% DMSO处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 成像技术
<ol>
	<li>采用同步算法的4-D心脏LSFM成像
	<ol>
		<li>使用以下步骤对整个斑马鱼胚胎在多个心动周期内进行2-D成像（图1）。确保光片厚度约为5 μm。采集500个x-y帧，曝光时间为10 ms。根据奈奎斯特采样原理，将z轴扫描步长设置为1 μm，以实现无损数字采样25。
		<ol>
			<li>通过将1 g琼脂糖加入100 mL水中并加热至完全溶解，制备1%（w/v）琼脂糖凝胶。使用20 μL移液器将胚胎和琼脂糖加载至小型塑料管中，并固定在载物台上。</li>
			<li>打开图像查看软件，点击Live以观察样品的实时图像。使用旋钮调节物镜，使样品处于焦点位置。类似地，移动载物台，使实时图像显示胚胎的顶部。</li>
			<li>使用显微镜软件在10倍放大下连续5秒采集500帧图像26。</li>
			<li>使用电机移动载物台至新一层（z轴方向1 μm），并重复成像过程。</li>
			<li>重复上述两步，直至整个心脏被完整成像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过忽略第一个和最后一个心动周期的图像来确保数据完整性。通过匹配在不同周期但处于心动周期相同时相点采集的图像，确定心动周期的周期长度。使用以下开发的公式计算周期： 
		<img alt="分形维数公式；数学方程；数据分析；科研；教育用途" src="/files/ftp_upload/57763/57763eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程1"> (1) 
		其中D为用于拟合周期假设的代价函数，Im为捕获的图像，τ'为图像捕获时间，zk为图像的z方向索引，xm为像素索引向量，T'为周期假设。</li>
		<li>使用以下公式计算两个相似阶段图像之间的相对位移： 
		<img alt="辐射传递图中的双重积分方程，用于吸收分析" src="/files/ftp_upload/57763/57763eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程2"> (2) 
		其中Qk',k表示相对位移的代价函数，R为可能的空间邻域，L为图像采集的总时间，x为像素索引，zk和zk'分别为第一和第二z方向切片，t为时间，s为相对位移假设。</li>
		<li>将相对位移转换为相对于第一幅图像的绝对位移，并采用伪逆法求解线性方程，以确定绝对关系，从而对齐后续图像部分，如前所述27。</li>
		<li>最终的4-D图像使用图像处理软件进行处理（材料表）。
		<ol>
			<li>将2-D图像堆叠为3-D
			<ol>
				<li>打开商业图像处理软件。</li>
				<li>点击Open Data。</li>
				<li>选择所有需堆叠为3-D的图像 &gt; 点击Load。</li>
				<li>输入体素尺寸0.65 x 0.65 x 1 &gt; 点击OK。</li>
				<li>点击Multi-Planar View框以可视化3-D图像。</li>
				<li>右键点击蓝色的slice_1.tiff框 &gt; 选择Display &gt; 选择Volren。</li>
				<li>点击Edit &gt; 选择Options &gt; 选择Edit Colormap。</li>
				<li>使用红色边框标出的框调整颜色 &gt; 点击OK。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将3-D转换为4-D
			<ol>
				<li>点击"File &gt; Open Time Series Data。</li>
				<li>选择刚刚生成的3-D tiff文件 &gt; 点击Load。</li>
				<li>输入与之前相同的体素尺寸。</li>
				<li>右键点击蓝色的slice_1.tiff框 &gt; 选择"Display" &gt; 选择Volren。</li>
				<li>点击Edit &gt; 选择Options &gt; 选择Edit Colormap。使用框调整颜色 &gt; 点击OK。</li>
				<li>右键点击Time Series Control &gt; 点击Movie maker &gt; 按下Play按钮以观看视频。</li>
				<li>输入文件名、帧大小、帧率、质量设为1、类型选择Monoscopic &gt; 点击Apply。</li>
				<li>导出视频。使用适当的软件打开该视频。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. qRT-PCR 分析
<ol>
	<li>斑马鱼心脏RNA提取，用于定量Notch配体、受体及靶基因的表达
	<ol>
		<li>通过过量的三卡因甲磺酸盐处理处死斑马鱼28,29。根据先前描述的方法30，切除斑马鱼心脏并进行RNA提取的准备工作。</li>
		<li>提取总RNA，并按照试剂盒说明书使用cDNA合成试剂盒合成cDNA。</li>
		<li>设计针对Notch配体Jag1、Jag2、Dll4、受体Notch1b以及信号通路相关基因Nrg1和ErbB2的PCR引物。所用引物见表3。</li>
		<li>将步骤3.1.3中的引物、步骤3.1.2中提取的mRNA以及商用预混液加入PCR板中。根据所用酶的要求，在适当的温度和时间条件下运行qRT-PCR。以斑马鱼α-actin为内参对结果进行标准化。 
		注意：该步骤用于计算各配体、受体及基因的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体外 人主动脉内皮细胞（HAEC）实验
<ol>
	<li>动态剪切应力模型
	<ol>
		<li>使用 HAEC 培养基培养 HAEC 细胞。待细胞完全融合后，将细胞暴露于层流和脉动流中，作用力为 23 x 10-5 N，频率为 1 Hz，持续 24 小时。
		<ol>
			<li>将内皮细胞培养基/DMEM 含 10% 胎牛血清在水浴中预热 20 分钟。</li>
			<li>从液氮罐中取出 HAEC 细胞，将冻存管放入水浴中直至完全融化。</li>
			<li>使用 1,000 μL 移液器吸取解冻后的细胞，转移至 15 mL 离心管中，加入 3–5 mL 培养基，以 53 × g 离心 3 分钟。</li>
			<li>吸除上清液，加入适量培养基使总体积达到 10 mL。将细胞悬液加入无菌 T75 培养瓶中，盖紧瓶盖，并轻轻晃动使细胞均匀分布于瓶底。</li>
			<li>在培养瓶上标记姓名缩写、日期、细胞类型和传代次数。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养，直至细胞融合度达 80%。注意每 2–3 天更换一次培养基。</li>
			<li>使用商用泵将管路连接至培养瓶，并按照步骤 4.1.1 中所述参数进行设置31,32,33。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 GI254023X 加入 50 mL HAEC 培养基中，终浓度为 5 μM，处理 30 分钟。</li>
		<li>使用预混的 ADAM10 抑制剂 GI254023X（可抑制 Notch 信号通路），对 HAEC 细胞进行与步骤 4.1.1 相同的层流或脉动流实验。</li>
		<li>采用 qRT-PCR 检测四组 HAEC 样本中 Notch 配体（Jag1、Jag2 和 Dll4）及 Notch 靶基因（hairy 及 enhancer of split [Hes]）的表达水平，四组分别为：层流组、层流 + GI254023X 组、脉动流组、脉动流 + GI254023X 组32。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Notch 信号通路的挽救与过表达
<ol>
	<li>在1至4细胞期，将步骤1.1.6中制备的浓度为5 pg/nL的Nrg1 mRNA 1 nL与gata1a MO共同注射，以过表达Notch靶基因24。</li>
	<li>以类似方式将1 nL的Nrg1 mRNA注射至wea突变体中24。</li>
	<li>将Nrg1 mRNA浓度加倍（10 pg/nL），并向斑马鱼注射1 nL，以观察心室形态24。</li>
	<li>在1至4细胞期向斑马鱼胚胎注射1 nL浓度为20 pg/nL的EPO mRNA6，以增强造血作用，从而增加心室壁剪切应力，方法如先前所述24。</li>
	<li>将50 μM异丙肾上腺素7 1 nL加入E3培养基中，处理培养中的斑马鱼24小时，以提高收缩频率，操作方法如先前所示24。</li>
	<li>对每组样本进行4D LSFM成像。按照步骤2.1.1–2.1.5.2.8中的说明进行操作。</li>
</ol>
6. 随时间推移对短轴缩短率和体积变化的定量分析
<ol>
	<li>对每组样本分别在50、75和100 hpf时进行4-D LSFM成像。按照步骤2.1.1–2.1.5.2.8中的说明操作。将每幅图像划分为600个节点，以复制心壁运动。</li>
	<li>使用以下公式测量心室在舒张期和收缩期直径的变化： 
	<img alt="分数缩短率方程，显示心脏直径计算；研究关键词：心脏病学分析。" src="/files/ftp_upload/57763/57763eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3">  (3) 
	使用可视化软件加载每0.1秒的三维心室图像，并测量其体积。</li>
	<li>绘制各实验组在75 hpf和100 hpf时心室体积随时间的变化曲线。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。&#160;

在本实验方案中，我们证明了4D成像可用于追踪小梁网络在生物力学力变化下的发育过程。具体而言，内皮细胞所经历的剪切应力会启动Notch信号级联反应，从而促进心肌小梁的形成。在本研究中，我们证明了以下三点：（1）gata1a MO注射减少了造血作用，从而降低了管壁剪切应力；（2）tnnt2a MO注射抑制了心室的收缩功能，进而降低管壁剪切应力；（3）wea突变体缺乏心房收缩，导致作用于心室的血流动力学力下降。通过降低心脏壁上的剪切应力，我们利用qRT-PCR定量分析了Notch信号，发现当壁面剪切应力（WSS）降低时，Notch信号也随之减弱。为进一步验证我们的假设，缺乏心内膜的clo突变体未能形成心肌小梁；而在存在ADAM10的情况下，对内皮细胞施加脉动性剪切应力的实验表明，剪切应力可激活Notch信号通路。
其他成像技术（如共聚焦显微镜）可用于对样品进行三维成像14。然而，该技术及其他类似技术存在诸多局限性。例如，共聚焦成像难以深入穿透样品，轴向分辨率较低，且扫描...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>.&#160;Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>. Additional&#160;author names were&#160;added, and an author affiliation was updated.

Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

生物力学力（如血流动力学剪切应力）深度参与心脏形态发生过程。在血流动力学剪切力的作用下，心肌脊和心肌沟以波浪状的小梁网络形式发育，并与房室（AV）瓣膜处剪切应力的方向一致1。心脏小梁化对于增强心肌收缩功能和增加心肌质量至关重要2。Notch信号通路的突变会导致人类及其他脊椎动物出现先天性心脏病3。例如，gata1a4 和 tnnt2a5 的吗啉代寡核苷酸（MO）已被证明可减少红细胞生成，而促红细胞生成素mRNA（EPO）6 和异丙肾上腺素（ISO）7 则分别增加红细胞数量和心率，从而提高血管壁剪切应力（WSS）。此外，作为Notch信号通路下游的ErbB2信号可促进心肌细胞增殖与分化，产生收缩力，进而激活Notch信号通路8,9。研究表明，剪切应力调控由Notch信号介导的小梁化过程，以推动心室发育。目前已有大量研究致力于进一步阐明导致先天性心脏病（CHD）的遗传编程事件10,11,12，但极少有研究关注机械力如何影响正在形成的心脏。
为了研究作用于心内膜的机械力，需要在发育期间进行密切观察。然而，获取高质量的心内膜图像具有挑战性 体内 由于传统显微镜的固有特性而造成样本跳动13为了观察样本随时间的发育变化，因此需要进行物理切片和染色13,14,15尽管共聚焦显微镜已广泛用于成像样品的三维结构14,16然而，这些成像系统的数据采集仍受限于较慢的扫描速度。
光片荧光显微镜（LSFM）是一种独特的成像技术，可实现对生物样本的高分辨率、低光毒性的三维可视化 体内 长工作距离下的动态事件13该技术利用光片荧光显微镜对样品进行光学切片17由于仅对样品的薄层光平面进行照明，因此光漂白和光毒性显著降低13,18大视野和长工作距离使得在成像过程中能够保持大尺寸样本的完整性13,14,17低倍率可实现更大范围的成像，而长工作距离可在不降低信噪比的情况下对较厚的样品进行成像。许多研究团队已采用光片荧光显微镜对完整胚胎进行成像17大脑14,18肌肉和心脏19 包括其他组织，展示了可成像样本的多种类型。
尽管先前的研究通过阻断斑马鱼心脏的流入道或流出道证明了血流剪切力的降低，但这些信息仅限于定性描述。这种操作会导致出现异常的第三心腔、心脏环化减弱以及瓣膜形成受损20。4D LSFM 图像为血流剪切力如何影响心肌组织发育提供了全新的视角。这些机械力可能激活力敏感的信号分子，并诱导小梁嵴的形成。由于4D成像增加了时间维度，研究者能够实时追踪发育过程中的变化，从而可能揭示以往被忽视的新现象。斑马鱼是成像研究的理想模型，因为科学家可以观察整个脊椎动物个体，而不仅仅是细胞间的相互作用。氧气能够扩散至整个胚胎，使发育过程无需依赖血管系统即可进行，这与哺乳动物的发育不同。尽管斑马鱼心脏缺乏需要四腔心的肺器官，但在斑马鱼与人类之间仍有许多心脏相关基因是保守的21。
在本论文中，我们描述了如何在不同条件下利用光片荧光显微镜对斑马鱼心脏中发育中的小梁结构进行成像。首先，通过注射 gata1a4 或 tnnt2a5 的吗啉代寡核苷酸（MOs），降低血液黏度，从而降低壁面剪切应力（WSS），随后记录心脏的形态。在另一组斑马鱼中，我们通过给予 EPO mRNA6 或异丙肾上腺素7 以提高WSS，并观察其结果。我们还开展了细胞实验，采用不同的脉动或振荡流速进行研究。在对每组样本成像后，我们发现内皮细胞通过Notch信号通路感知的WSS启动了心肌小梁的形成。

<table><tbody><tr><td>Clontech Hifi PCR 预混液&amp;nbsp;</td><td>Takara&amp;nbsp;</td><td>639298</td><td>PCR 预混液&lt;br/&gt; 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td></tr><tr><td>人 &lt;em&gt;Nrg1&lt;/em&gt; cDNA</td><td>由美国加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学 William Talbot 惠赠</td><td>N/A</td><td>用于小梁结构挽救实验&lt;br/&gt; 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td></tr><tr><td>CFX Connect&amp;trade; 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>PCR 仪&lt;br/&gt; 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>pCS2+</td><td>GE Health</td><td></td><td>用于合成 mRNA 的质粒&lt;br/&gt; 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td></tr><tr><td>Nucleospin 核酸纯化试剂盒&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>740609.25</td><td>DNA 纯化&lt;br/&gt; 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>2011A</td><td>PCR 连接反应溶液&lt;br/&gt; 1.1.2.5</td></tr><tr><td>Stellar 感受态细胞</td><td>Clontech</td><td>636763</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 转化用细胞&lt;br/&gt; 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>转染试剂&lt;br/&gt; 1.1.4</td></tr><tr><td>mMessage SP6 体外转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>用于合成 mRNA 的试剂盒&lt;br/&gt; 1.1.6.3</td></tr><tr><td>Aurum 总 RNA 小量提取试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td>RNA 纯化&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 1.1.6.4, 3.1.2</td></tr><tr><td>GeneTools 4.3.8</td><td>GeneTools</td><td>N/A</td><td>引物设计软件&lt;br/&gt; 1.2.1, 3.1.3</td></tr><tr><td>EPO cDNA</td><td>Creative Biogene</td><td>CDFH006026</td><td>增加壁面剪切应力（WSS）&lt;br/&gt; 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td></tr><tr><td>AG1478</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T4182</td><td>ErbB 抑制剂&lt;br/&gt; 1.3.1</td></tr><tr><td>E3 培养基</td><td></td><td></td><td>用于胚胎培养&lt;br/&gt; 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5942</td><td>&amp;gamma;-分泌酶抑制剂&lt;br/&gt; 1.3.2</td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9539</td><td>用于胚胎封片&lt;br/&gt; 2.1.1.1</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT&amp;nbsp;数字 CMOS 相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>用于图像采集&lt;br/&gt; 2.1.1.2, 2.1.1.3</td></tr><tr><td>Amira 软件</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>用于将图像可视化并分析为三维（3D）和四维（4D）&lt;br/&gt; 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>886-86-2</td><td>用于人道地麻醉或处死胚胎&lt;br/&gt; 3.1.1</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>cDNA 合成&lt;br/&gt; 3.1.2</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-005</td><td>微型离心机&lt;br/&gt; 4.1.1.3</td></tr><tr><td>GI254023X</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>260264-93-5</td><td>ADAM10 抑制剂&lt;br/&gt; 4.1.2, 4.1.3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>I5627</td><td>异丙肾上腺素可增加壁面剪切应力（WSS）&lt;br/&gt; 5.1.5</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>心脏力学分析</td></tr></tbody></table>

利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

心脏所经历的血流动力学力影响心脏发育，尤其是小梁化过程，后者由心肌层分支出的突起形成网状结构。Notch信号通路中的遗传程序缺陷与左心室致密化不全心肌病或左心发育不全综合征等心室缺陷相关。通过本方案可确定，由剪切应力驱动的小梁化过程与Notch信号通路之间存在关联。利用光片荧光显微镜，实现了对斑马鱼心脏发育过程的可视化观察。本文评估了血流动力学力是否通过Notch信号通路调控小梁化的起始，从而影响收缩功能。为进行剪切应力的定性与定量分析，在斑马鱼心脏形态发生过程中获取了四维（三维+时间）图像，并结合四维同步技术整合光片荧光显微镜，捕捉了心室的运动过程。通过显微注射gata1a-吗啉代寡核苷酸（MO）降低血液黏度，以减少剪切应力，从而下调Notch信号通路并抑制小梁化。共注射Nrg1 mRNA与gata1a MO可恢复Notch相关基因的表达，使小梁化得以重建。为证实剪切应力驱动的Notch信号通路对小梁化的影响，进一步通过tnnt2a-MO抑制心肌细胞收缩，以降低血流动力学力，从而下调Notch靶基因，形成无小梁结构的心肌。最后，通过对内皮细胞施加脉动流，验证了剪切应力响应性Notch基因的表达模式。因此，四维光片显微镜揭示了血流动力学力在Notch信号通路与小梁化中的作用，对致密化不全性心肌病具有临床相关意义。

本研究采用光片荧光显微镜（LSFM）获取高分辨率的二维和三维图像。如图1A和1B所示，照明物镜将光片投射到样品上。由于光片非常薄，仅能照亮一个平面。检测物镜与照明物镜垂直放置，并聚焦于被照亮的平面（图1B）。随后，来自照明物镜的光片从左至右扫描样品（图1C）。这种扫描方式可减少光漂白和光毒性，并具有较低的信噪比。
LSFM 被应用于 Tg(cmlc2a:gfp) 胚胎以可视化完整的心脏结构34 通过快速扫描（&gt; 30 秒，体素分辨率为 0.65 × 0.65 × 1 µm由于采用单平面照明，背景噪声显著降低 (图1...

本文介绍了一种在斑马鱼中以四维（4-D）方式可视化心脏发育的实验方案。通过光片荧光显微镜（LSFM）进行的4-D成像，可在时间序列上获取三维（3-D）图像，从而重建发育中心脏的动态过程。我们通过定性和定量分析表明，剪切应力在心腔发育过程中可激活心内膜的Notch信号通路，进而促进心脏小梁化。

心脏所经历的血流动力学力影响心脏发育，尤其是形成分支突起网络的肌小梁结构发育。

该方法有助于回答发育性心脏力学生物学领域中的关键问题，例如利用4D光片显微镜通过Notch信号通路研究剪切应力对心脏小梁结构形成的影响。该技术的主要优势在于，它使用5微米厚的光平面照射样品的薄层区域，从而减少光漂白和光损伤。此外，我们的计算算法使我们能够重建出跳动的斑马鱼心脏的4D图像。该技术的应用前景涉及先天性心脏病的诊断，因为它能够在发育早期到后期表型的整个过程中，对心脏小梁结构进行活体连续可视化观察。通常，初次接触该技术的研究人员会发现，随时间变化的三维思维难以想象。此外，构建该系统并实现精确对齐需要耗费一定时间。首先，使用隔板将繁殖用的斑马鱼按雌雄分开置于繁殖缸中。随后，提起隔板，使雌雄斑马鱼交配繁殖。收集斑马鱼胚胎，并向胚胎注射吗啉代寡核苷酸以抑制小梁化过程。接下来，通过将1克琼脂糖加入100毫升蒸馏水中并加热至琼脂糖完全溶解，制备浓度为1%的琼脂糖凝胶。待琼脂糖冷却后，使用20 µL移液器将一个已制备的胚胎与琼脂糖一同加入小塑料管中。将该管固定在显微镜载物台上，并使用10×物镜进行观察。使用旋钮调节物镜，使胚胎顶部处于焦点位置。采用五微米的光片厚度，对整个鱼胚胎在多个心动周期内进行成像。采集500个xy平面图像，曝光时间为十毫秒。然后，将载物台在 z 轴方向移动一微米至新的一层，并重复成像过程。每个 z 平面持续成像 500 帧，直至整个心脏被完全成像。接下来，打开图像处理软件，开始将图像堆叠成三维图像。为此，请首先点击“打开数据”。在此处选择所有将要堆叠成三维的图像，然后选择“加载”。接着输入体素尺寸 0.65 × 0.65 × 1 微米，并点击“确定”。输入正确的体素尺寸对于三维图像的准确分析至关重要。现在，单击多平面视图框以查看三维图像。右键单击蓝色切片的单点 tiff 框，选择显示，然后点击 volran。在编辑菜单中，选择选项，然后编辑色谱图。通过色块调整颜色，然后单击确定。仍在图像处理软件中时，单击文件，打开时间序列数据。选择刚刚通过点击“加载”生成的3D tiff文件，并输入与之前相同的体素尺寸。右键单击蓝色切片的单点tiff框，然后依次选择“显示”和“volran”。接着，点击“编辑”。选择选项，然后选择编辑颜色图。使用色块调整颜色，然后单击确定。接下来，右键单击时间序列控件，点击“电影制作器”，然后按下播放按钮以观看影片。最后，输入文件名、帧尺寸、帧速率、质量设为1，并选择单眼模式，然后单击“应用”。最后，导出视频。生物力学力（例如血流动力学剪切应力）与心脏形态发生密切相关。在此，采用光片荧光显微镜对受精后75小时心室腔内突出的肌小梁嵴进行可视化观察。受精后100小时，可清晰观察到小梁网络。在显微注射gata1aMO处理的胚胎中，造血作用和黏稠度降低了90%。这种黏稠度的降低减弱了血流动力学剪切应力，导致小梁网络的启动延迟且密度降低。通过上调与Notch相关的基因表达，可以在受精后75小时和受精后100小时恢复小梁网络的延迟和密度，从而挽救心肌小梁的形成。因此，gata1a吗啉代寡核苷酸通过降低血流动力学力，导致Notch信号通路下调；而Nrg1-mRNA挽救实验则上调了Notch相关基因，重新启动了心肌小梁化过程。一旦掌握，该成像技术若操作得当，约需两小时即可完成。该技术开发后，为心脏发育领域的研究人员提供了研究notch基因中调控斑马鱼心肌小梁正常形成的因子的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用选择性平面照明显微镜获取图像，并生成4D图像文件。请务必注意，激光操作可能具有极高危险性。在此操作过程中，应始终采取适当的预防措施，例如佩戴合适的护目装备。

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光片荧光显微术捕捉4维图像调制剪切应力对斑马鱼心脏发育的影响

光片荧光显微镜是成像胚胎发育的优秀工具，能够在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间的延时成像。我们展示了其在跨越广泛时空尺度下斑马鱼眼部发育成像中的应用，并提供了一套多视角数据集融合与去卷积的处理流程。...

利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

此处，一种 方案是 提供 使用市售的光片显微镜和图像处理工作站对眼球形态发生过程进行延时成像，并分析所得数据。本方案详细描述了胚胎麻醉、包埋于低熔点琼脂糖、在成像腔室中悬浮、设置成像参数，以及最终利用图像分析软件对成像数据进行分析的操作步骤。...

利用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

我们介绍了用于研究斑马鱼心脏的优化工具 体内...

斑马鱼胚胎中心脏快速动态的光片显微成像

本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。...

4D光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

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设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

我们开发了一种基于介孔二氧化硅薄膜的技术，用于从人血清中选择性回收低分子量蛋白质和多肽。通过精细调控介孔芯片的理化性质，可有效控制多肽的富集过程，进而对血清蛋白质组进行分析，用于诊断目的。...

介孔二氧化硅薄膜富集低分子量蛋白质用于生物标志物发现

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创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

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质膜蛋白和脂质的空间分布与时间动态是生物学中的热点问题。本文通过时空图像涨落分析来探讨这一问题，该方法在概念上可提供与单粒子追踪相同的物理量，但使用小分子标记物和常规显微镜装置即可实现。...

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单分子荧光显微镜在平面支撑双层膜上的应用

了解光片荧光显微术结合计算算法重建四维跳动斑马鱼心脏的方法。该技术通过减少光漂白和光损伤，实现心脏发育的实时可视化，揭示剪切应力通过Notch信号调控心肌小梁形成的机制，为先天性心脏病诊断提供新思路。

利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

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