3d轨道跟踪的改进双光子显微镜之应用：细胞内的囊泡的跟踪
2014年10月1日
在这个视频协议中，我们使用改进的双光子显微镜中的轨道跟踪方法，以高速和三维方式跟踪活细胞内荧光标记的溶酶体。
该程序的总体目标是说明如何跟踪快速移动的细胞器，例如溶酶体在活细胞内以 3D 形式移动。这是通过首先在培养的活细胞内使用特定的商业染料对溶酶体和微管进行染色来实现的。第二步是利用激光扫描显微镜，采用轨道跟踪方法，高速跟踪溶酶体的运动，然后选择轨道大小和其他参数，如系统的频率响应，进行跟踪实验。
最终，结果表明，可以在三个维度上跟踪快速移动的溶酶体，并检测在跟踪过程中沿激光轨道遇到的其他荧光染色细胞器的相互作用。与其他现有方法相比，3D跟踪方法的主要优点是，例如基于散光，是3D跟踪方法允许我们跟踪非常大范围的痴呆。这种方法可以帮助提出囊泡运输领域的关键问题，例如囊泡如何沿着微管移动。
虽然这种方法可以用来研究内体动力学。它也可以用于其他系统，在这些系统中可以荧光标记分离的颗粒，例如 go 纳米颗粒、膜受体、聚集核端口复合物或遗传位点 维持的中国仓鼠卵巢细胞或 CH K one 细胞，如文本方案中所述。收获细胞后，将它们放在直径为 14 毫米的直径上。
表面厚度为 0.16 毫米的微孔种子细胞，为成像提供最佳密度，以 60% 至 70% Co 流度左右成像，第二天在 37 摄氏度 5%CO2 下孵育细胞过夜，在 Hank 缓冲盐水溶液或 H-B-S-S-H-B-S-S 中洗涤细胞 3 次，用于从培养板中去除死细胞或碎片，并为染色步骤准备细胞。然后，在孵育后，将细胞在含有终浓度为 50 阿诺摩尔的 Lyo 示踪剂和 150 Ano 摩尔的微管蛋白示踪剂绿色的 HBSS 溶液中孵育 1 小时。在 HBSS 中洗涤细胞 3 次，以去除任何未结合的染料。
在对细胞进行成像之前，添加新鲜的 DMEM 生长培养基。视频协议中描述的用于粒子跟踪的显微镜组装在市售倒置显微镜的框架上。使用相干变色龙超二钛蓝宝石飞秒激光激发光源，其可调输出波长范围在 690 纳米至 1040 纳米之间。
确保激光束对准显微镜的后端口。使用红外镀膜镜，使用放置在方解石偏振器前面的旋转半波片对激光束进行衰减，使光束衰减，使样品的平均功率在 0.5 到 2 毫瓦之间。通过将高数值孔径水物镜放入光路中，从样品中收集荧光。
接下来，将样品放在电动载物台上并调整显微镜物镜的精细运动。使用客观的压电控制器。根据所需的发射波长选择单通道或双通道配置的荧光滤光片立方体。
使用发射带通过滤光片。为了进一步选择发射荧光的光谱范围，将来自滤光片立方体的光引导到光电倍增管中，在那里信号被放大和区分，并发送到数字输入输出数据采集卡，以对细胞进行成像，将它们放置在载物台上并使用透射光照明进行聚焦。切换到光栅扫描成像以识别已掺入染料的细胞，并可视化底层微管，识别存在囊泡运动的初始区域。
一旦确定了分离的囊泡，就可以设置轨道跟踪的参数。首先，选择轨道的半径，以根据被跟踪粒子的大小定义圆周扫描的大小。对于点发射器，将轨道半径设置为等于点扩散函数的腰部或激发光束的 PSF。
最大限度地提高灵敏度和响应。设置轴向距离以定义两个轨道之间的距离，这些轨道用于沿轴向定位粒子位置。将轴向距离设置为 PSF 废料的 1.5 到 3 倍。
根据粒子的亮度定义停留时间，以设置在轨道的每个点上花费的时间，这也将决定照片漂白速率。使用 10 到 100 微秒之间的停留时间。将每个轨道中的点数设置为 64 或 128，以产生 4 到 32 毫秒左右的轨道周期，并提供高时间分辨率来确定粒子位置。
更改发送到反射镜的直流偏移信号，以便通过图形用户界面通过光栅扫描图像中的光标选择使光束在粒子上居中。通过将显微镜模式从光栅成像切换到轨道扫描来开始跟踪。激活 feedback 和 data collection 以进行轨迹分析。
使用该软件以强度地毯的形式显示在轨道上每个点和每个时间点收集的荧光。沿地毯收集的强度提供了有关粒子与其他明亮物体相互作用的信息。以时间序列的形式显示轨迹信息以及随时间从光电倍增管收集的荧光强度。
使用时间序列表示和强度地毯信息，在轨迹中仅选择感兴趣区域。然后显示粒子轨迹的选定部分的 2D 投影。选择适当的对照，根据颗粒荧光强度对轨迹进行颜色编码。
选择该选项以 3D 形式显示颗粒轨迹，并根据荧光强度对其进行颜色编码。使用控件在 3D 中旋转轨迹，以可视化溶酶体沿微管运动的特征。使用溶酶体和微管的荧光绿色染料染色，可以使用双光子激光扫描显微镜对囊泡沿微管的高速运动进行成像。
然而，如果使用轨道跟踪，光栅扫描成像不具备准确跟踪较快内体运动所需的时间分辨率。相反，数据表明，可以获得时间分辨率为 32 毫秒的 x、y、Z 位移轨迹。在这些位移与时间轨迹中，地毯分析显示了沿每个轨道记录的强度。
随着时间的推移，强度轨迹提供有关粒子荧光环境的信息。框区域对应于两次跳跃之间的轨迹部分。方框区域之外的亮点对应于粒子与其他明亮物体的相互作用，并且与轨道重新以最亮的荧光源为中心的轨迹跳跃有关。
在跟踪过程中，可以记录发射荧光的积分强度。重建的 3D 轨迹显示出有向运动，就像在微管网络上移动的囊泡一样。此外，还可以将 3D 轨迹与 RA 或周围区域的扫描图像相关联。
这证实了颗粒沿微管束方向的运动。一旦掌握了，如果这项技术在尝试时执行得当，可以在几个小时内完成。此过程重要的是要记住使用对您的样品无害的激光功率水平，同时使用光子引用，如本协议所示，应保持物镜后约 2 毫伏的功率水平。
看完这个视频后，你应该对如何使用 3D 轨道跟踪方法设置实验有了很好的了解，该方法允许跟踪非常大的 Z 范围的物体。
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概述
本视频协议展示了使用改进的双光子显微镜在活细胞内三维跟踪快速移动的溶酶体。轨道跟踪方法允许高速观察溶酶体运动和与其他细胞器的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 显微镜技术
- 细胞器动力学
背景
- 溶酶体是涉及细胞运输的重要细胞器。
- 跟踪细胞器运动对于理解细胞过程至关重要。
- 现有方法在跟踪速度和准确性方面可能存在局限性。
- 轨道跟踪方法相对于传统技术具有优势。
研究目的
- 说明在活细胞中跟踪溶酶体的方法。
- 展示高速3D跟踪的能力。
- 探索溶酶体与其他细胞器之间的相互作用。
使用的方法
- 用特定染料染色溶酶体和微管。
- 使用激光扫描显微镜进行观察。
- 采用轨道跟踪方法进行高速跟踪。
- 调整轨道大小和频率响应等参数。
主要结果
- 成功在三维空间中跟踪溶酶体。
- 检测到与其他荧光染色细胞器的相互作用。
- 展示该方法在大范围内的有效性。
- 洞察沿微管的囊泡运输。
结论
- 轨道跟踪方法是研究细胞器动力学的强大工具。
- 这种方法可以增强我们对囊泡运输机制的理解。
- 未来的研究可以在这些发现基础上探索细胞过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution, real-time tracking of intracellular vesicles in live cells, providing critical insights into vesicular transport mechanisms relevant to drug delivery and target validation. The ability to monitor fast-moving organelles with nanometer spatial and millisecond temporal resolution supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying intracellular trafficking pathways. Such predictive confidence aids in prioritizing therapeutic candidates based on subcellular localization and transport dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing lysosomal movement along microtubules, clarifying intracellular transport pathways.
- Operational Value: Provides quantitative 3D displacement data with 10 nm accuracy and 50 Hz frequency response, supporting functional target validation through direct observation of organelle dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible trajectories of vesicle motion, enabling reliable comparison across experimental conditions for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable implementation in live-cell imaging platforms, allowing high-throughput assessment of compound effects on intracellular trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase observations to preclinical relevance by tracking lysosomes in disease-relevant cellular models, supporting biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by correlating vesicular transport phenotypes with functional outcomes in translational models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing dynamic, quantitative readouts of intracellular trafficking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of lysosomal motility along cytoskeletal networks.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (x, y, z trajectories) with high temporal resolution, enabling reliable compound screening for modulators of vesicular transport.
- Analytics: Generates time-series and intensity carpet data that allow teams to track particle interactions and detect deviations in motion patterns indicative of biological responses.
- Translational Research: Connects vesicular dynamics to preclinical continuity by enabling tracking in live cells under physiological conditions, relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying organelle dynamics across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in intracellular trafficking pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through feedback-controlled beam tracking, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into lysosomal transport, reducing late-stage failures due to poor subcellular delivery.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of candidates based on validated intracellular delivery and organelle co-localization profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, fluorescence labeling, and live-cell imaging techniques.
- Depends on a modified laser scanning microscope with feedback control hardware and real-time data acquisition systems.
- Necessitates standardization of staining protocols, orbit parameters, and dwell times across laboratories for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types, fluorescent labels, and subcellular targets beyond lysosomes.
- Limited by phototoxicity risks at high laser powers, requiring careful power management to maintain sample viability during extended tracking.
