在改进的双光子显微镜中进行三维轨道追踪：用于细胞内囊泡追踪的应用

本实验的总体目标是展示如何在活细胞内三维空间中追踪快速移动的细胞器（如溶酶体）。首先，使用特异性的商业染料对培养的活细胞内的溶酶体和微管进行染色；其次，利用激光扫描显微镜，采用轨道追踪方法高速追踪溶酶体的运动。随后，根据系统频率响应等参数，选择合适的轨道尺寸及其他条件，以开展追踪实验。

最终结果表明，有可能在三维空间中追踪快速移动的溶酶体，并检测在追踪过程中沿激光轨道遇到的其他荧光标记细胞器之间的相互作用。与现有其他方法（例如基于像散的方法）相比，三维追踪方法的主要优势在于，该方法使我们能够在非常广泛的痴呆范围内进行追踪。该方法有助于回答囊泡运输领域的一个关键科学问题，例如囊泡如何沿微管移动。

尽管该方法可用于研究内体动力学，也可应用于其他系统，在这些系统中可以对分离的颗粒进行荧光标记，例如金纳米颗粒、膜受体、聚集的核孔复合物或遗传位点，如文中实验方案所述，在中国仓鼠卵巢细胞或CHO-K1细胞中进行。收集细胞后，将其置于直径为14毫米的培养皿上。

将细胞以约60%至70%融合度接种于表面厚度为0.16毫米的微孔板中，于37摄氏度、5% CO2条件下培养过夜。次日，用Hank's平衡盐溶液（H-B-S-S）洗涤细胞三次，以去除培养板中的死细胞或碎片，并为染色步骤做准备。随后，将细胞在含有终浓度为50阿摩尔Lyo Tracker和150阿摩尔微管追踪剂绿色（tubulin tracker green）的HBSS溶液中，于37摄氏度孵育一小时。孵育结束后，用HBSS洗涤细胞三次，以去除未结合的染料。

成像前添加新鲜的DMEM培养基。视频方案中所述的粒子追踪所用显微镜，安装在市售倒置显微镜的框架上。采用相干Chameleon Ultra II钛宝石飞秒激光器作为激发光源，其可调输出波长范围为690纳米至1040纳米。

确保激光束与显微镜后端口对齐。使用镀红外膜的反射镜，通过在方解石偏振器前放置一个可旋转的半波片来衰减激光束，调节衰减程度，使样品处的平均功率保持在0.5至2毫瓦之间。将高数值孔径的水浸物镜置于光路中，以收集样品发出的荧光信号。

接下来，将样品放置在电动载物台上，并微调显微镜物镜的位置。使用物镜压电控制器，根据所需的一通道或双通道配置中的发射波长选择合适的荧光滤光片组。

使用带通发射滤光片。为进一步选择发射荧光的光谱范围，将滤光立方体中的光线导入光电倍增管，在其中信号被放大并进行区分，随后传送至数字输入输出数据采集卡，以对细胞成像，并利用透射光照明在载物台上定位细胞并调焦。切换至光栅扫描成像模式，以识别已摄取染料的细胞，并观察下方的微管结构，确定存在囊泡运动的初始区域。

一旦识别出孤立的囊泡，即设置轨道追踪的参数。首先，选择轨道半径，以根据被追踪粒子的大小确定圆形扫描的范围。对于点光源发射体，应将轨道半径设为激发光束的点扩散函数（PSF）的束腰大小。

为了最大限度提高灵敏度和响应性，设置轴向距离以定义用于沿轴向定位粒子位置的两个轨道之间的距离。将轴向距离设置为点扩散函数（PSF）宽度的1.5至3倍。

根据粒子的亮度确定停留时间，以设定在轨道每个点上花费的时间，这也将决定光漂白速率。使用10至100微秒之间的停留时间。将每条轨道的点数设置为64或128，以获得约4至32毫秒的轨道周期，并为确定粒子位置提供高时间分辨率。

通过图形用户界面在光栅扫描图像中用光标选择粒子，调整发送到镜片的直流偏置信号，使光束在粒子上居中。将显微镜模式从光栅成像切换到轨道扫描，开始追踪。激活反馈和数据采集以进行轨迹分析。

使用软件以强度地毯图的形式显示在轨道上每一点及每个时间点采集的荧光信号。沿地毯图采集的强度信息可提供粒子与其他明亮物体相互作用的情况。同时以时间序列的形式显示轨迹信息以及光电倍增管随时间采集的荧光强度。

利用时间序列表示和强度地毯图信息，仅选择轨迹中的感兴趣区域。然后显示所选粒子轨迹部分的二维投影。选择适当的控件，根据粒子荧光强度对轨迹进行颜色编码。

选择以3D形式显示粒子轨迹，并根据荧光强度对其进行颜色编码。使用控件旋转3D轨迹，以可视化溶酶体沿微管运动的特征。利用荧光绿色染料对溶酶体和微管进行染色，可通过双光子激光扫描显微镜对囊泡沿微管的高速运动进行成像。

然而，如果使用轨道追踪，光栅扫描成像并不具备足够的时间分辨率，以准确追踪较快的内体运动。相反，数据表明，可以获得时间分辨率为32毫秒的x、y、z位移轨迹。在这些位移-时间轨迹中，地毯分析显示了沿每条轨道记录的强度。

随着时间推移，强度轨迹可提供有关粒子周围荧光环境的信息。方框区域对应轨迹中两次跳跃之间的部分。方框区域外的亮斑对应粒子与其他明亮物体的相互作用，这些相互作用会导致轨迹发生跳跃，因为轨道会重新定位到最亮的荧光源上。

在追踪过程中，可以记录所发射荧光的积分强度。重建的三维轨迹显示出定向运动，这符合囊泡沿微管网络移动的预期行为。此外，还可以将三维轨迹与周围区域的RAs图像或扫描图像进行关联分析。

这证实了颗粒沿微管束方向的运动。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数小时内完成。在尝试时需牢记，使用光镊激发时应采用对样品无害的激光功率水平；如本方案所示，物镜后的功率水平应维持在约两毫伏。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用三维轨道追踪方法来设置实验，该方法可对具有极大 Z 轴范围的物体进行追踪。