Name: 斑马鱼心脏收缩的 4D 光片成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解斑马鱼心脏收缩的四维光片成像技术，用于研究心脏发育与疾病机制。该方法结合GPU并行计算和虚拟现实平台，实现单细胞分辨率的动态心脏功能分析，为心血管研究提供新工具。

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我们感谢波士顿儿童医院的Caroline Burns博士慷慨分享转基因斑马鱼。感谢德克萨斯大学达拉斯分校的Elizabeth Ibanez女士在斑马鱼饲养方面提供的帮助。我们还感谢德克萨斯大学达拉斯分校D-incubator成员提供的所有建设性意见。本研究由美国国立卫生研究院R00HL148493（Y.D.）、R01HL162635（Y.D.）以及德克萨斯大学达拉斯分校STARS项目（Y.D.）资助。

本研究已获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，批准编号为 #20-07。Tg(myl7:nucGFP) 转基因斑马鱼幼体12被用于本研究。所有数据采集和图像后期处理均使用具有科研或教育许可的开源软件或平台完成。相关资源可在合理请求下向作者索取。
1. 斑马鱼繁殖与胚胎显微注射
时间：2 天
<ol>
	<li>通过标准的饲养和繁殖程序维持并培育成年斑马鱼。详细方法请参考先前的报告13。</li>
	<li>按照既定方案进行显微注射14。本研究中，显微注射在1-2细胞（合子）阶段进行。 
	&#8203;注意：准确识别该阶段对于实现有效的显微注射以及确保胚胎发育的一致性至关重要。在单细胞阶段，卵黄顶部会形成一个小圆顶，此阶段通常持续约12分钟。进入双细胞阶段后，可观察到两个相邻的圆顶，此阶段持续约受精后45分钟15。有关系统构建的更详细信息可参见其他报告或方案12,16,17。&#160;</li>
</ol>
2. 斑马鱼胚胎/幼鱼的制备与固定
时间：7 天
<ol>
	<li>将受精后1天（dpf）的胚胎转移至含有0.2 mM 1-苯基-2-硫脲（PTU）（见材料表）的E3水中，以防止色素形成。</li>
	<li>每天更换新鲜的含PTU的E3水，直至进行激光扫描显微成像（LSM）。</li>
	<li>在0至7 dpf期间的预定时间点，使用体视显微镜对胚胎或幼鱼进行成像，记录其发育情况。</li>
	<li>准备内径为2 mm的分段式氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管，用于在LSM系统下包埋斑马鱼幼鱼12。 
	注意：FEP管用于固定样本，并可使用折射率与周围介质（如水）相近的材料进行匹配。</li>
	<li>从3 dpf开始，将鱼转移至150 mg/L的三卡因（MS-222）溶液中（见材料表），在成像前使其 immobilize（固定）。</li>
	<li>制备含150 mg/L三卡因的0.8%低熔点琼脂糖，待其冷却至室温后，用移液管将麻醉后的鱼转移至琼脂糖中18。</li>
	<li>使用另一支移液管将鱼与琼脂糖一起装入FEP管中（图1）。 
	注意：为确保发育中胚胎受到的应激最小化，在固定前后通过显微观察评估心脏活动（如心率），以检测三卡因麻醉前后是否存在显著差异。此外，可在固定后进一步检查皮肤和肌肉组织是否存在心脏结构异常（如水肿）。三卡因的浓度对心脏成像具有关键影响19，因此本项目中采用150 mg/L浓度的三卡因溶液进行斑马鱼幼鱼收缩成像。尽管当前的回顾性同步方法使我们能够分析不规则心跳20，但针对斑马鱼心脏心律失常的4D成像及长期成像的完整解决方案仍在开发中。</li>
</ol>
3. 光片成像系统的设置与配置
时间：3-14 天
<ol>
	<li>基于柱面透镜构建一套自主设计的光片显微镜（LSM）系统，采用特定波长（如 473 nm 和 532 nm）的连续波二极管泵浦固体（DPSS）激光器作为照明光源（图 2A）。</li>
	<li>定制 LabVIEW（见材料表）控制代码，以实现样品平移台、光片照明与 sCMOS 相机曝光之间的同步，从而采集图像序列。 
	&#8203;注意：有关系统构建的更详细信息可参见其他研究报告或实验方案12,16,17。我们鼓励研究团队在系统构建过程中积极寻求与在光学成像领域具有成熟经验的实验室开展合作。</li>
</ol>
4. 斑马鱼成像样品制备与数据采集
时间：1 天
<ol>
	<li>通过测量荧光微珠来校准 LSM 系统的空间分辨率，并最小化不同深度下的不透明度变化。
	<ol>
		<li>首先，将直径为 0.53 µm 的荧光微珠（参见材料表）用 0.8% 低熔点琼脂糖稀释至 1:1.5 × 105 的浓度，并将溶液转移至分段 FEP 管中。</li>
		<li>其次，使用 LSM 系统对微珠成像，并在整个样品范围内测量点扩散函数（PSF），以验证空间分辨率和系统对准情况12。 
		注意：在本系统中，对半高全宽（FWHM）代表性结果的分析表明，横向和轴向分辨率分别为 1.26 ± 0.15 和 2.48 ± 0.15 µm（n = 60 个微珠）。这表明在整个成像深度范围内空间分辨率保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将固定有斑马鱼幼鱼的 FEP 管牢固地连接到六轴（x、y、z、俯仰、偏航和滚动）电动样品台上，并将管子浸入充满 E3 水的样品室中。为避免卵黄囊引起的光散射并更准确地定位心脏位置，应旋转斑马鱼幼鱼，从腹侧进行成像（图 2B）。在此情况下，大多数捕获的图像将同时包含心室和心房（图 2C）。 
	注意：由于当前成像过程通常每条鱼耗时少于一小时，且在受控的室温环境中进行，因此本项目中样品室的温度控制和氧气水平调节被视为可选步骤。然而，对于长期延时成像研究，特别是关注发育过程的研究，建议在样品室内持续监测并调节温度至 27 °C，以维持斑马鱼的生理环境，并防止潜在的发育异常。</li>
	<li>将电动样品台连接至工作站，并配置所有必要参数，包括所需的移动模式。</li>
	<li>建立 sCMOS 相机与工作站之间的连接。调整所有关键设置，例如 5 ms 的曝光时间和所需的感兴趣区域。</li>
	<li>在自定义的 LabVIEW 控制程序中设置图像序列的数量及每序列的帧数。</li>
	<li>开启激光器并启动 LSM 对样品的成像。持续操作直至所有图像序列均成功记录。</li>
	<li>以每秒 200 帧的帧率记录 300 帧，形成一个二维图像序列，覆盖幼鱼 3–5 个心动周期。该记录捕捉了光片照明选择平面上的心脏收缩功能。</li>
	<li>以 1 µm 的步长在光片照明方向上移动幼鱼，实现对样品的虚拟切片。 
	注意：样品台的步长应根据光片系统的轴向分辨率设定，遵循奈奎斯特-香农采样定理12。</li>
	<li>重复步骤 7，记录新样品切片的另一组图像序列，直至覆盖整个心脏。通常，以 1 µm 步长采集 100–200 个图像序列即可确保覆盖斑马鱼幼鱼的整个心脏（图 2D）。 
	&#8203;注意：步骤 4.7–4.9 由 LabVIEW 程序控制，并由 LSM 系统自动执行（图 3）。鉴于生成的图像数据量庞大，建议采用标准化的命名规范对图像序列进行管理。例如，使用“z-1”&#34;、&#34;z-2&#34;&#34;等名称建立文件夹，以分类不同图像序列的数据。在每个序列内，图像应按时间点顺序命名（如“1”&#34;、&#34;2&#34;&#34;……）。固定一条鱼、调整成像&#160;角度并完成全部数据采集的总时间约为 1 小时。</li>
</ol>
5. 采用并行计算进行4D图像&#160;重建
时间：1天 
注意：我们团队开发的4D重建算法及样本数据可公开获取21。该方法可用于从此前步骤采集的图像序列中重建4D心脏图像（表1）。
<ol>
	<li>打开文件 test_Parallel.m 在 MATLAB 中（参见 材料表）。在变量中指定存储原始图像序列的文件夹位置 &#34;baseDir&#34;.</li>
	<li>分配变量 &#34;切片数量&#34; 图像序列的总数（通常为100-150）以及变量 &#34;图像数量&#34; 每个序列中的图像数量（通常为300-500张）。</li>
	<li>检查显示斑马鱼心脏中位平面的图像序列（例如，第51帧）st 在总共101个序列中确定该序列的第一次和第四次心缩的帧编号，并将其赋值给变量 收缩期第一点 和 收缩期点_4th.</li>
	<li>点击 运行 开始该过程。 
	注意：每个图像序列中心动周期的长度将首先由MATLAB程序通过比较不同时间点图像之间的相似性（平方差之和）来确定。随后，通过计算所有图像序列周期长度的平均值来估算心动周期。接下来，程序将通过从第一个图像序列到最后一个图像序列的图像相似性进行迭代比较，对不同轴向位置图像序列的起始点进行对齐。</li>
	<li>在输出文件夹中查看结果。程序将把图像保存为 &#34;.tif&#34; 带有时间戳的文件。每个 &#34;.tif&#34; 文件是某一特定时间点的三维心脏图像。两幅三维图像之间的时间间隔等于所设置的曝光时间。 
	&#8203;注意：重建前几步获取的图像，以展示四维（三维空间 + 一维时间）心脏收缩过程。为在回顾性同步过程中提高高通量研究的效率，该方法利用 MATLAB 并行计算工具箱通过多个 CPU 核心实现并行计算，并将图像转换为 gpuArray 格式，从而在 GPU 上同时执行计算操作。</li>
</ol>
6. 三维细胞分割与细胞追踪
时间：1 天
<ol>
	<li>下载 3DeeCellTracker 软件包（参见材料表），并配置 Python 环境22。</li>
	<li>下载 ITK-SNAP 标注软件23（参见材料表），并使用该软件在两个选定的时间点（一个处于心室舒张期，另一个处于心室收缩期）对三维心脏图像进行手动标注，以创建训练集和验证集。 
	注意：其他标注软件也可能适用。</li>
	<li>在 Python 中运行 3DeeCellTracker 训练程序，并在 TrainingUNet3D 函数中初始化 noise_level（本例中为 100）、folder_path 和 model 参数，以设置预定义的三维 U-Net 模型。</li>
	<li>在 MATLAB 中，使用 imageDimConverter.m 程序将训练集和验证集转换并重命名为合适的格式以便加载。</li>
	<li>在 Python 中，使用 trainer.load_dataset() 和 trainer.draw_dataset() 函数加载训练集和验证集。</li>
	<li>在 Python 中运行 3DeeCellTracker 跟踪程序的第一部分并初始化参数。 
	注意：此步骤包括定义用于描述图像尺寸的图像参数、选择用于细胞分割的机器学习模型的分割参数，以及选择用于细胞配准的预训练深度神经网络模型的跟踪参数。首次使用时，建议采用 U-Net 模型进行细胞分割，采用 FFN+ PR-GLS 进行细胞配准。需要将数据、模型和结果存储在本步骤中自动创建的文件夹中。</li>
	<li>在 MATLAB 中，使用 imageDimConverter.m 程序将所有三维心脏图像转换并重命名为合适格式，并将其转移至上一步创建的数据文件夹中。</li>
	<li>在 Python 中运行 3DeeCellTracker 程序的第二部分以开始分割。</li>
	<li>当第一幅三维图像完成分割后，将分割结果与原始图像进行比较，若发现任何错误分割，则进行手动校正。将校正后的分割结果移至已创建的 &#34;/manual_vol1&#34; 文件夹中。</li>
	<li>在 Python 中运行 3DeeCellTracker 程序的第三部分，以完成所有图像的分割。</li>
	<li>使用 Amira（参见材料表）通过比较被追踪细胞的位置与其对应的原始图像，对追踪结果进行可视化评估。如果测试结果不理想，则从步骤 6.6 重新开始，采用其他机器学习模型进行分割或细胞配准，然后重新启动追踪流程。 
	&#8203;注意：分割完成后，默认情况下细胞标签数据以 8 位图像（0 到 255）形式存储，这意味着仅提供 256 个标签用于细胞分类。当需要更多类别时，有两种解决方案。一种是在跟踪程序中将细胞标签数据格式设置为 16 位图像，但这会导致处理时间呈指数级增长，本例中超过两天。另一种解决方案是使用 &#34;separateTrackingResults.py&#34; 程序对细胞标签进行后处理，该程序会根据细胞的物理位置将具有相同标签的细胞分开，并为每个细胞分配不同的标签。本例中该过程耗时约 10 分钟。</li>
</ol>
7. 虚拟现实模式下的心脏收缩力分析
时间：1 天
<ol>
	<li>获取前序步骤的细胞追踪结果。</li>
	<li>手动验证数据，并筛选在所有体积中图像强度保持一致的细胞（约600个细胞中的500个）。</li>
	<li>使用 cellLabelsToObj.ipynb 脚本21，通过 3D Slicer 软件24（见材料表）为每个单个细胞生成表面网格，并为每个细胞分配唯一的颜色编码。</li>
	<li>将每个包含单个时间点所有细胞的三维模型导出为一个单独的 .obj 文件，该文件包含多个子对象，并附带一个 .mtl 文件以描述细胞标签。</li>
	<li>使用教育许可证将模型导入 Unity，Unity 是一种用于扩展现实的开发引擎。</li>
	<li>将包含用 C# 编写的函数的自定义脚本应用于模型和用户界面元素，以实现四维可视化和交互式分析。按照步骤 7.7 执行 VR 交互。</li>
	<li>在虚拟现实（VR）中使用以下功能与模型进行交互（图4）：
	<ol>
		<li>细胞选择：每次最多选择两个细胞，查看其轨迹、速度、体积、表面积及相对距离。</li>
		<li>时间点选择：在数据中选择特定时间点以分析所选细胞的输出，例如在舒张期的 t = 0 ms 或收缩期的 t = 200 ms。</li>
		<li>时间暂停：冻结动态模型，以集中观察所选细胞及其输出结果。</li>
		<li>对比度调节：调节模型中所选细胞与周围细胞之间的对比度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Analysis of Zebrafish Cardiac Contraction with Virtual Reality Interaction

<ol><li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ. Res. 110 (6), 870(2012).</li>
<li>Ding, Y., Bu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+inherited+cardiomyopathies+in+adult+zebrafish+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine.</a> Front. Physiol. 11, 599244(2020).</li>
<li>Giardoglou, P., Beis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+zebrafish+disease+models+and+matters+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">On zebrafish disease models and matters of the heart.</a> Biomedicines. 7 (1), 15(2019).</li>
<li>Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cardiac+contractile+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Cardiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cardiac contractile function.</a> Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).</li>
<li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cardiac+development+and+function+in+zebrafish+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Med.+Wkly%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy.</a> Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).</li>
<li>Vedula, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+quantify+mechanobiologic+forces+during+zebrafish+cardiac+development+using+4-D+light+sheet+imaging+and+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling.</a> PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+function+and+hemodynamic+analysis+for+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).</li>
<li>Baek, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microscopy+to+elucidate+cardiovascular+injury+and+regeneration%3A+4D+light-sheet+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).</li>
<li>Salman, H. E., Yalcin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+blood+flow+assessment+in+Zebrafish+via+experimental+digital+particle+image+velocimetry+and+computational+fluid+dynamics+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling.</a> Micron. 130, 102801(2020).</li>
<li>Sodimu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+the+cardiac+structure+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice.</a> J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+light-sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+cardiac+contractility+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae.</a> APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22Eugene%22">Eugene</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. 25, e1115(2009).</li>
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<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+light-sheet+for+rapid+imaging+of+cardiopulmonary+system%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system.</a> JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).</li>
<li>Coelho-Filho, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cardiomyocyte+hypertrophy+by+cardiac+magnetic+resonance%3A+implications+on+early+cardiac+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling.</a> Circulation. 128 (11), 1225(2013).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+segmentation+and+cardiac+mechanics+analysis+of+evolving+zebrafish+using+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cardiovasc.+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning.</a> Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).</li>
<li>Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+reality+for+interactive+medical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Virtual+Real%22%5BJournal%5D)">Virtual reality for interactive medical analysis.</a> Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+reality+for+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Methods+Prim%22%5BJournal%5D)">Extended reality for biomedicine.</a> Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

将斑马鱼模型与工程学方法相结合，在心肌梗死、心律失常和先天性心脏缺陷的体内研究中具有巨大潜力。凭借其光学透明性、再生能力以及与人类在遗传和生理上的相似性，斑马鱼胚胎和幼鱼已被广泛应用于科学研究1,2,4。光片成像技术具有优异的时空分辨率、光损伤小以及光学切片能力，使其在斑马鱼幼鱼心脏形态和收缩功能的四维研究中脱颖而出12,26,27,28。本实验方案介绍了一种综合性方法，整合了光片成像、回顾性同步、三维细胞追踪以及交互式虚拟现实（VR）平台，用于定量分析。该方法为捕获和重建心脏收缩、追踪并量化细胞动态，以及评估心脏发育和再生过程中的结构、功能和力学变化提供了入门途径。此外，该方法还可结合多通道荧光成像，追踪多种细胞类型和谱系，以研究细胞异质性和细胞间相互作用。尽管斑马鱼模型与哺乳动物系统存在差异，且仅适用于急性模型，需谨慎对待，但基因工程技术的进步可能推动构建更接近人类疾病状态的转基因斑马鱼品系，从而提升斑马鱼研究结果的转化价值29。
这种基于心脏周期性假设的回顾性同步方法可用于重建斑马鱼跳动心脏的光片图像。在光片成像中应用该方法，能够以每秒超过200个体积的速度可视化并分析跳动的心脏。为应对当前分析中产生的大量数据带来的挑战，采用了多核CPU与GPU的并行计算，使图像重建效率提升了十倍以上。在回顾性同步过程中，假设心肌细胞在每次心跳后均回到其基线位置。尽管考虑到斑马鱼心跳变异度较低，这一假设相对合理——如图4C所示26，但它仍是一种简化模型，可能无法涵盖所有生物学上的细微差异。成像技术的创新，如压缩荧光成像和光场显微镜，可通过减少切片冗余来减轻由此假设带来的影响。
为了实现对复杂四维心脏模型的深入分析，开发了一种计算框架，该框架结合了基于3DeeCellTracker的细胞分割方法以及支持用户自主探究的虚拟现实（VR）平台。该框架具备高效性和交互式操作等内在优势，可用来量化细胞速度变化、研究细胞间相互作用，并评估局部及整体心肌力学参数，如缩短分数、射血分数和区域应变30（图4）。现有文献中尚无关于斑马鱼在受精后7天（7 dpf）时心脏功能的先前提评估报道。然而，与其它研究者提供的3 dpf数据相比，本研究结果与此前关于从3 dpf到7 dpf期间射血分数（EF）和缩短分数（FS）均呈下降趋势的结论一致25,31。这些分析方法在阐明斑马鱼心脏损伤模型中的心脏动力学方面具有重要意义12,25。
由于虚拟现实（VR）技术和软件具有立体视觉和细胞位置自动配准等独特功能，该平台能够以沉浸式且高效的方式选择特定细胞，并分析其在整个心动周期中的运动轨迹。VR 的应用为执行细胞分割和标注等复杂任务提供了直观的方法，显著提高了效率和准确性32,33,34。此外，该技术还支持多名用户在处理大型复杂数据集时协同工作，并各自使用独特的工具34。尽管长时间使用 VR 可能引发头晕等副作用，但通过改进的人体工学设计和无线头戴设备可有效缓解这一问题。此外，针对实时渲染复杂生物结构所需的大量计算资源，可通过优化软件以实现即时处理，并结合基于云计算的解决方案，从而增强系统处理复杂可视化任务的能力。
随着硬件设备&#160;和计算能力的不断进步，该策略可进一步用于在细胞和组织水平上研究心肌中的心律失常，最终有望揭示心脏形态发生的潜在机制，并推动治疗干预手段的发展。

斑马鱼（Danio rerio）因其光学透明性、遗传可操作性以及强大的再生能力，被广泛用作研究心脏发育、生理学及修复过程的模式生物1,2,3,4。心肌梗死后，尽管结构和功能的变化会影响心脏射血功能和血流动力学，但技术上的局限性仍阻碍了以高时空分辨率对心脏再生过程中的动态变化进行深入研究。例如，传统的成像方法（如共聚焦显微镜）在成像深度、时间分辨率或光毒性方面存在局限，难以捕捉多个心动周期中动态变化并准确评估心肌收缩功能5。
光片显微镜是一种先进的成像方法，通过快速将激光扫描穿过心脏的心室和心房，成功解决了上述问题，实现了具有更高时空分辨率的精细图像，同时几乎无光漂白和光毒性效应6,7,8,9,10,11。
本方案介绍了一种综合成像策略，包括共聚焦显微系统构建、4D图像重建、3D细胞追踪和交互式分析，用于捕获并分析整个心脏在多个心动周期中心肌细胞的动态行为12。该定制的成像系统与计算方法能够&#160;在转基因Tg(myl7:nucGFP)斑马鱼幼体中实现心肌微结构和收缩功能的单细胞水平追踪。此外，通过显微注射将小分子化合物导入胚胎，以评估药物诱导的心脏损伤及其后续再生过程。这一整体性策略为在心脏发育与再生过程中以单细胞分辨率在体研究心肌组织的结构、功能及力学特性提供了切入点。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;资源&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;来源/参考文献&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;标识符&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;动物模型&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tg(myl7:nucGFP) 转基因斑马鱼&lt;/em&gt;</td><td>Boston儿童医院Burns实验室</td><td>ZDB-TGCONSTRCT-070117-49</td><td></td></tr><tr><td>软件与算法</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks公司</td><td>R2023a</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>美国国家仪器公司</td><td>2017 SP1</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>滨松光子学公司</td><td>4.6.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python软件基金会</td><td>3.9.0</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>Schneider等&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td>1.54f</td><td></td></tr><tr><td>3DeeCellTracker</td><td>Chentao Wen等&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td><td>v0.5.2</td><td></td></tr><tr><td>Unity</td><td>Unity软件公司</td><td>2020.3.2f1</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>2021.2</td><td></td></tr><tr><td>3D Slicer</td><td>Andriy Fedorov等&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td>5.2.1</td><td></td></tr><tr><td>ITK SNAP</td><td>Paul A Yushkevich等&lt;sup&gt;16&lt;/sup&gt;</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;光片成像系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>柱面透镜</td><td>Thorlabs公司</td><td>ACY254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>4倍照明物镜</td><td>尼康公司</td><td>MRH00045</td><td></td></tr><tr><td>20倍检测物镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>1-U2M585</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>滨松公司</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>电动XYZ平台</td><td>Thorlabs公司</td><td>PT3/M-Z8</td><td></td></tr><tr><td>双轴倾斜平台</td><td>Thorlabs公司</td><td>GN2/M</td><td></td></tr><tr><td>旋转步进电机</td><td>Pololu公司</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>荧光微珠</td><td>Spherotech公司</td><td>FP-0556-2</td><td></td></tr><tr><td>473 nm DPSS激光器</td><td>Laserglow公司</td><td>R471003GX</td><td></td></tr><tr><td>532 nm DPSS激光器</td><td>Laserglow公司</td><td>R531003FX</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微注射仪与真空泵&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>WPI公司</td><td>PV850</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Welch公司</td><td>2522B-01</td><td></td></tr><tr><td>预拉制玻璃毛细管</td><td>WPI公司</td><td>TIP10LT</td><td></td></tr><tr><td>凝胶加样用毛细管尖端</td><td>Bio-Rad公司</td><td>2239912</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;虚拟现实硬件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VR头戴显示器</td><td>Meta公司</td><td>Quest 2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;30 mg/L PTU溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma-Aldrich公司</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>1× E3工作液</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1% 琼脂糖&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>赛默飞公司</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;10 g/L Tricaine储备液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Syndel公司</td><td>SYNC-M-GR-US02</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich公司</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;150 mg/L Tricaine工作液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 g/L Tricaine储备液</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;60× E3储备液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>德克萨斯大学达拉斯分校实验动物资源中心（LARC）</td><td>NaCl</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>-</td><td>KCL</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>-</td><td>CaCL&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;× 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>-</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;× 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>反渗透水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1× E3工作液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60× E3储备液</td><td>德克萨斯大学达拉斯分校实验动物资源中心（LARC）</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>反渗透水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>1% 亚甲蓝（可选）&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>C&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;ClN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;S</td><td></td></tr></tbody></table>

4d光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

斑马鱼是一种引人关注的模式生物，以其显著的心脏再生能力而闻名。研究其跳动的心脏 体内 对于深入了解损伤后结构和功能变化至关重要。然而，获取斑马鱼心脏的高分辨率、高速四维（4D，即三维空间加一维时间）图像以评估心脏结构和收缩功能仍具挑战性。在此背景下，自主研发的光片显微镜（LSM）与定制化的计算分析方法&#160;用于克服这些技术局限。该策略包括LSM系统构建、回顾性同步、单细胞追踪和用户导向分析，能够在转基因小鼠全心范围内以单细胞分辨率研究心肌微结构与收缩功能 Tg(myl7:nucGFP) 斑马鱼幼体。此外，我们还能够进一步结合小分子化合物的显微注射，以精确且可控的方式诱导心脏损伤。总体而言，该体系可实现对心脏形态发生和再生过程中生理与病理生理变化以及单细胞水平区域力学特性的动态追踪。

本实验方案包含三个主要步骤：斑马鱼制备与显微注射、光片成像及4D图像重建、细胞追踪与虚拟现实（VR）交互。成年斑马鱼允许自然交配后收集受精卵，并根据实验设计需要进行显微注射（图1）。该步骤为研究斑马鱼在心脏发育与再生中的应用提供了切入点，同时在后续的成像与分析中起关键作用。利用自主搭建的光片显微镜（LSM）系统，在不同发育阶段（从3 dpf至7 dpf）对跳动的心脏进行成像，并将沿z轴获取的图像序列进行配准，以重建4D斑马鱼心脏模型（图2 和 图3）。这些模型为深入的表型表征提供了基础，对于揭示心脏形态与功能在发育过程中的动态变化至关重要。通过定制的虚拟现实（VR）平台对斑马鱼心脏中的单个细胞进行追踪，量化其运动与相互作用。同时，在心房和心室中比较选定细胞在一个心动周期内的速度及相对距离变化，以评估区域收缩性并研究局部应变（图4）。区域应变的计算基于感兴趣区域内两个相邻心肌细胞之间位移变化的差异。分数缩短率（FS）与射血分数（EF）的估算方法参照已发表文献中的方法25。FS与EF的计算公式如下：
<img alt="结构分析图中安全系数 FS 的公式，包含应力变量。" src="/files/ftp_upload/66263/66263eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1">
<img alt="静力平衡，EF=(Vd-Vs)/Vd，方程，教育公式，力平衡计算" src="/files/ftp_upload/66263/66263eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2">
其中，Dd 和 Ds 分别表示舒张末期和收缩末期的心室直径（短轴，通过不同心室细胞之间的距离测量），Vd 和 Vs 分别表示舒张末期和收缩末期的心室容积（通过心室的长轴和短轴直径计算得出）。
总体而言，这些结果展示了一种整合生理学与工程学的新策略，可促进斑马鱼模型中的容积成像与数据分析，为深入探索心脏形态发生及力学机制提供了广阔前景。
<img alt="斑马鱼显微注射过程示意图；从交配到卵子显微注射的设备设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66263fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：斑马鱼卵收集与显微注射过程。该过程包括成年斑马鱼交配、收集受精卵以及可选的显微注射操作。在显微注射过程中，预先拉制好的玻璃毛细管针头装载所需材料。将受精卵在琼脂糖模具的狭缝中排列成直线，并使其与注射针头呈垂直方向。显微注射过程需在显微镜下持续观察卵子与针尖的位置来进行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66263fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼心脏的4D成像，GFP转基因模型；系统示意图、图像序列、4D重建。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66236fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：光片成像过程与4D图像重建。（A）自制光片成像系统的结构示意图。CL：柱面透镜。EO：激发物镜。DO：探测物镜。TL：管镜。FL：滤光片。CAM：sCMOS相机。（B）斑马鱼幼鱼固定于FEP管中并由琼脂糖包埋的示意图。（C）从4天龄斑马鱼幼鱼获取的原始2D图像序列。每帧左上角的时钟显示从收缩末期开始的心脏相位。（D）用于4D斑马鱼图像配准的回顾性同步示意图。图像序列表示沿z轴某一深度的连续记录。图像序列中的每一帧由一个红色圆点表示，黄色框内突出显示从舒张末期到收缩末期的起始与结束相位。（E）由2D图像序列重建的4D心脏模型。dpf：受精后天数。本图改编自Zhang等12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66236fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="激光显微镜系统界面与荧光图像；细胞结构可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66263fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：LabVIEW控制面板。（A）控制面板中的设置包括激光器、相机、图像路径和电机模式的配置。（B）由LabVIEW程序采集的斑马鱼心脏原始图像示例。比例尺：30 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66263fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼心脏发育；追踪的细胞、舒张/收缩速度图、应变数据；房室管。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66263/66263fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：细胞追踪与虚拟现实交互有助于揭示斑马鱼心脏收缩功能。（A）3 dpf 时 Tg(myl7:nucGFP) 斑马鱼心脏中被追踪的细胞。（B）虚拟现实平台为用户提供了沉浸式观察与交互体验，可用于浏览四维斑马鱼心脏模型，使用户能够通过自定义分析可视化心脏随时间变化的功能。（C）从虚拟现实平台收集测量数据后，比较了在 3 dpf 和 7 dpf 时选定细胞在一个心动周期内的速度变化和相对距离变化。前两幅图为五个心室细胞和五个心房细胞的平均速度变化，其余图示展示了三组细胞之间的相对距离变化，即两个心室细胞、一个心室细胞与一个心房细胞、以及两个心房细胞之间的变化。（D）对 3 dpf 和 7 dpf 斑马鱼心脏的心功能评估。在 3 dpf 斑马鱼心脏中共追踪了 370 个细胞，在 7 dpf 时共追踪了 580 个细胞。此图改编自 Zhang 等人12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66263/66263fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td colspan="2">用途</td>
			<td>标识符</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">定制化程序与算法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSF.m</td>
			<td colspan="2">用于根据荧光微球的 FWHM 测量结果计算点扩散函数（PSF）。</td>
			<td>MATLAB 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Zebrafish Imaging.vi</td>
			<td colspan="2">用于控制并同步共聚焦显微系统（LSM）中的硬件。</td>
			<td>LabVIEW 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>test_Parallel.m, 等</td>
			<td colspan="2">用于从二维图像序列重建四维图像。</td>
			<td>MATLAB 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imageDimConverter.m</td>
			<td colspan="2">用于将图像数据转换为指定格式，以进行细胞追踪。</td>
			<td>MATLAB 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>separateTrackingResults.py</td>
			<td colspan="2">用于对细胞追踪结果进行后处理，分离具有相同标签的细胞。</td>
			<td>Python 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellTracking_All.py</td>
			<td colspan="2">用于筛选在所有体数据中图像强度保持一致的细胞。</td>
			<td>Python 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellLabelsToObj.ipynb</td>
			<td colspan="2">用于通过 3D Slicer 为每个单个细胞生成表面网格。</td>
			<td>Python 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamicHeartModel.cs, 等</td>
			<td colspan="2">用于创建虚拟现实（VR）环境并与其中的对象进行交互。</td>
			<td>C# 程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">定制化硬件设计</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D 打印样品室</td>
			<td colspan="2">用于配合水浸物镜使用。</td>
			<td>SolidWorks 设计</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D 打印样品支架</td>
			<td colspan="2">用于适配样品台并固定样品。</td>
			<td>SolidWorks 设计</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：自定义资源表。样本代码和数据已上传至 Zenodo21。

本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。

4D光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

斑马鱼是一种引人关注的模式生物，以其显著的心脏再生能力而闻名。在活体中研究其跳动的心脏对于……至关重要。

本研究采用4D光片成像技术探索斑马鱼的心脏收缩功能，旨在从单细胞水平理解心脏收缩的动力学特征。其中最主要的实验挑战之一是在观察天然心律的同时，实现心脏功能的高空间末端分辨率动态成像。本研究填补了在单细胞分辨率下分析复杂4D心脏动力学的空白。我们利用基于GPU的并行计算、虚拟现实技术以及先进的细胞追踪方法来解析光片成像数据。我们开发的新型虚拟现实平台提供了一种交互式方法，用于评估心脏区域收缩，并具备可操作功能以实现更深入的分析。通过促进用户主导的心脏收缩分析，本实验方案有望加深对心脏发育及疾病机制的理解。首先，打开体视显微镜，以记录受精后0至7天内斑马鱼幼鱼的发育过程。配制含有150毫克/升三卡因的0.8%低熔点琼脂糖溶液。待琼脂糖冷却至室温后，使用移液器将麻醉后的斑马鱼转移至琼脂糖中。使用另一支移液管，将鱼样用琼脂糖固定在氟化乙烯丙烯管中。将固定有斑马鱼幼鱼的管子连接到六轴电动光片显微镜的样品台上。将管子浸入充满E3水的样品室中。将斑马鱼幼鱼从腹侧旋转，以更好地观察心脏。将电动样品台连接到工作站，并设置所有必要参数，包括所需的移动模式。建立sCMOS相机与工作站之间的连接。将步长设置为1微米，总帧数设置为300，曝光时间为5毫秒。然后，定义所需的感兴趣区域。打开激光器电源，启动光片显微镜对幼虫的成像。记录300帧作为二维图像序列，以覆盖幼虫的三到五个心动周期。对新的样本切片再记录另一组图像序列，直至覆盖整个心脏。首先，打开MATLAB。打开 test_parallel.m 文件。在 baseDir 变量中，指定原始图像序列文件夹的位置。将变量 numbOfSlice 赋值为图像序列的总数，numbOfImage 赋值为每个序列中的图像数量。检查斑马鱼心脏中间层面的图像序列，识别该序列中第一次和第四次收缩期的帧编号，并将其分别赋值给变量 systolicPoint_1st 和 systolicPoint_4th。单击“运行”以开始成像重建。下载三维细胞追踪软件包，并配置 Python 环境。下载并打开 ITK-SNAP 标注软件。在两个时间点手动标注三维心脏图像，一个时间点为心室舒张期，另一个时间点为心室收缩期，以创建训练和验证数据集。在 Python 中运行三维细胞追踪器训练程序。在训练 UNet 3D 函数中，初始化 noise_level、folder_path 和模型参数，以设置预定义的三维 UNet 模型。在 MATLAB 中，使用图像维度转换器 dim converter.m 程序，将训练集和验证集转换并重命名为适合加载的正确格式。在 Python 中，使用训练器 trainer。load_dataset 和 trainer.draw_dataset 函数用于分别加载训练和验证数据集。然后运行 3D 细胞追踪器训练程序的第一部分，并定义用于 3D 细胞分割的成像参数。现在，在 MATLAB 中使用图像 DIM 转换器（image DIM converter.m）程序，将所有三维心脏图像转换并重命名为正确格式，并将其转移至数据文件夹。在 Python 中运行三维细胞追踪程序的第二部分，以开始分割。完成首个3D图像的分割后，将分割结果与原始图像进行比较。将修正后的分割结果移至已创建的手动分割体积文件夹中。在Python中运行3D细胞追踪程序的第三部分，以对所有图像进行分割。接下来，打开 Amira 软件，将追踪到的细胞位置与其对应的原始图像进行比较，以直观评估追踪结果。手动验证细胞追踪结果数据，并选择在所有体数据中图像强度一致的细胞。在 3D Slicer 软件中，使用细胞标签生成 obj 文件。ipymbScript 生成表面网格，并为每个细胞分配唯一的颜色编码。将每个3D模型导出为单个obj文件，包含多个子对象，并附带一个mtl文件以描述细胞标签。使用教育许可证将3D模型导入Unity中。将由 C# 程序编写的函数构成的自定义脚本应用于模型和用户界面元素，以实现四维可视化和交互式分析。

4d-light-sheet-imaging-of-zebrafish-cardiac-contraction

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

斑马鱼心脏收缩的 4D 光片成像

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

本文介绍了一种在斑马鱼中以四维（4-D）方式可视化心脏发育的实验方案。通过光片荧光显微镜（LSFM）进行的4-D成像，可在时间序列上获取三维（3-D）图像，从而重建发育中心脏的动态过程。我们通过定性和定量分析表明，剪切应力在心腔发育过程中可激活心内膜的Notch信号通路，进而促进心脏小梁化。...

利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

我们介绍了用于研究斑马鱼心脏的优化工具 体内...

斑马鱼胚胎中心脏快速动态的光片显微成像

在本视频中，我们演示了用于制备适用于细胞培养的柔性、细胞外基质（ECM）包被基底的实验技术，这些基底可用于牵引力显微镜检测，并可用于观察细胞外基质刚度对细胞行为的影响。...

用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

一种无需麻醉的简易微流控装置已被开发出来 体内 成像 秀丽线虫完整 果蝇...

简单的微流控装置 体内 成像 秀丽隐杆线虫, 果蝇 和斑马鱼

延时显微镜可实现对发育过程的可视化观察。在图像采集过程中，样品的生长或漂移会降低准确追踪和测量发育期间细胞运动的能力。本文介绍了利用开源图像处理软件对样品随时间发生的三维漂移进行校正的方法。...

4D 共聚焦延时成像后的样本漂移校正

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

在此，我们展示了由诱导性多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞生成人源工程化心肌组织的方法。我们介绍了一种分析收缩力的方法，并以hERG通道抑制剂E-4031引起收缩模式改变的示例进行说明。该方法具有高度的稳健性，适用于心脏药物筛选。...

用于心脏药物安全性筛选的人工心脏组织自动收缩分析

用于改进斑马鱼幼鱼实验操作的长期活体成像装置

本研究采用双侧照射光片荧光显微镜（LSFM）技术结合光学透明化方法，对小鼠心脏进行研究。...

用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

了解斑马鱼心脏收缩的四维光片成像技术，用于研究心脏发育与疾病机制。该方法结合GPU并行计算和虚拟现实平台，实现单细胞分辨率的动态心脏功能分析，为心血管研究提供新工具。

4D光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

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