样品制备质谱术分析

该样品制备过程的总体目标是对不同样品进行稳定且一致的抗体染色，以便能够检测异质细胞群。该方法可以帮助回答有关复杂异质细胞群中的细胞身份、细胞信号传导和细胞反应的问题。该技术的主要优点是它允许在单细胞水平上测量高参数蛋白质水平。

演示该程序的是我们实验室的研究生 Aundrietta Duncan。对于每个单细胞悬液样品，在无血清培养基中以每毫升 10 至第六个细胞的四倍重悬，每 2/10 向六个细胞中加入 500 微升新鲜制备的 50 微摩尔顺铂，并在轨道振荡器上孵育样品，在室温下不断混合。1 分钟后，用等体积的洗涤缓冲液淬灭顺铂并离心细胞。

弃去上清液，加入 500 μL 洗涤缓冲液，离心细胞，倒出洗涤缓冲液，再洗涤样品两次。随后在 500 微升 PBS 中洗涤两次，类似地离心样品并弃去上清液。第二次 PBS 洗涤后，将沉淀重悬于 500 微升新鲜 PBS 中，并用 500 微升 4% PFA 固定细胞。

移液细胞进行混合。然后将样品放在定轨摇床上，在室温下持续混合 15 分钟。在孵育结束时，通过离心沉淀细胞，倒出上清液，然后在新鲜 PBS 中洗涤。

要透化细胞，请再次旋转细胞并丢弃上清液。通过轻轻涡旋将样品重悬于残留的 PBS 中，并立即每 2/10 10 向第六个细胞中加入 1 毫升 100% 甲醇，轻轻移液。将样品在 4 度下孵育至少 1 小时，并在孵育结束时离心细胞。

然后，倒出甲醇。然后，每 mL 甲醇在 1 mL 洗涤缓冲液中洗涤沉淀，然后在 500 μL 新鲜洗涤缓冲液中再洗涤两次。使用设置为 50 μL 的 200 μL 移液器，将每个沉淀中剩余的洗涤缓冲液转移到相应抗体混合物的试管中。

通过保持柱塞部分压下，移液管将混合溶液移回，不要将空气吸入吸头。然后将移液器吸头转移到含有 500 μL 洗涤缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中，而不松开柱塞。松开柱塞，吸取洗涤缓冲液，使抗体混合物总体积为 50 μL，然后轻轻移液，用吸出的抗体混合物标记相应的样品。

在室温下持续摇动 1 小时后，洗涤样品 4 次，每次倒出洗涤缓冲液。要用铱标记细胞，请将最终沉淀重悬于 500 微升 PBS 中，然后加入 500 微升 4% PFA，在室温下放置 15 分钟。接下来，向样品中加入 500 微升新鲜制备的 62.5 纳摩尔铱和 PFA，再室温振荡 15 分钟。

然后，离心细胞，倒出上清液，然后在 500 微升 0.1% BSA 和过滤的去离子水中洗涤两次。通过将归一化微珠添加到样品板的孔中，将细胞移液到这些孔中，然后在 24 小时内进行质谱流式细胞术来分析样品。在信号强度归一化后，可以通过对铱 191 阳性微珠阴性群体进行门控，从数据中去除校准微珠。

然后可以使用铱 193 阴性表达与事件长度的双轴图对单细胞事件进行门控，以去除碎片和细胞多重态。顺铂标记可用于测量细胞深度的量。例如，此处显示了死细胞数量较少和较高的样品。

可以通过设门去除铂 198 阳性细胞群来去除死细胞，条形码可在条形码参数内实现样品的明显分离，从而将细胞分配到其原始样品身份。IDU 标记可用于检测此处观察到的美国面部细胞。在初始归一化、去条形码和门控之后，可以使用 SPADE 算法分析高维数据，以生成更适合视觉解释的数据的低维表示。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四到六个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住在执行洗涤步骤时尽量减少样品损失。观看此视频后，您应该对如何制备用于质谱流式细胞术分析的样品有很好的了解。

不要忘记使用叠氮化钠可能很危险，因此在执行此程序时应采取预防措施，例如佩戴适当的 PPE。