样品制备质谱术分析
April 29th, 2017
本文介绍了用于质谱流式细胞术分析的样品采集和处理。
该样品制备过程的总体目标是对不同样品进行稳定且一致的抗体染色，以便能够检测异质细胞群。该方法可以帮助回答有关复杂异质细胞群中的细胞身份、细胞信号传导和细胞反应的问题。该技术的主要优点是它允许在单细胞水平上测量高参数蛋白质水平。
演示该程序的是我们实验室的研究生 Aundrietta Duncan。对于每个单细胞悬液样品，在无血清培养基中以每毫升 10 至第六个细胞的四倍重悬，每 2/10 向六个细胞中加入 500 微升新鲜制备的 50 微摩尔顺铂，并在轨道振荡器上孵育样品，在室温下不断混合。1 分钟后，用等体积的洗涤缓冲液淬灭顺铂并离心细胞。
弃去上清液，加入 500 μL 洗涤缓冲液，离心细胞，倒出洗涤缓冲液，再洗涤样品两次。随后在 500 微升 PBS 中洗涤两次，类似地离心样品并弃去上清液。第二次 PBS 洗涤后，将沉淀重悬于 500 微升新鲜 PBS 中，并用 500 微升 4% PFA 固定细胞。
移液细胞进行混合。然后将样品放在定轨摇床上，在室温下持续混合 15 分钟。在孵育结束时，通过离心沉淀细胞，倒出上清液，然后在新鲜 PBS 中洗涤。
要透化细胞，请再次旋转细胞并丢弃上清液。通过轻轻涡旋将样品重悬于残留的 PBS 中，并立即每 2/10 10 向第六个细胞中加入 1 毫升 100% 甲醇，轻轻移液。将样品在 4 度下孵育至少 1 小时，并在孵育结束时离心细胞。
然后，倒出甲醇。然后，每 mL 甲醇在 1 mL 洗涤缓冲液中洗涤沉淀，然后在 500 μL 新鲜洗涤缓冲液中再洗涤两次。使用设置为 50 μL 的 200 μL 移液器，将每个沉淀中剩余的洗涤缓冲液转移到相应抗体混合物的试管中。
通过保持柱塞部分压下，移液管将混合溶液移回，不要将空气吸入吸头。然后将移液器吸头转移到含有 500 μL 洗涤缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中，而不松开柱塞。松开柱塞，吸取洗涤缓冲液，使抗体混合物总体积为 50 μL，然后轻轻移液，用吸出的抗体混合物标记相应的样品。
在室温下持续摇动 1 小时后，洗涤样品 4 次，每次倒出洗涤缓冲液。要用铱标记细胞，请将最终沉淀重悬于 500 微升 PBS 中，然后加入 500 微升 4% PFA，在室温下放置 15 分钟。接下来，向样品中加入 500 微升新鲜制备的 62.5 纳摩尔铱和 PFA，再室温振荡 15 分钟。
然后，离心细胞，倒出上清液，然后在 500 微升 0.1% BSA 和过滤的去离子水中洗涤两次。通过将归一化微珠添加到样品板的孔中，将细胞移液到这些孔中，然后在 24 小时内进行质谱流式细胞术来分析样品。在信号强度归一化后，可以通过对铱 191 阳性微珠阴性群体进行门控，从数据中去除校准微珠。
然后可以使用铱 193 阴性表达与事件长度的双轴图对单细胞事件进行门控，以去除碎片和细胞多重态。顺铂标记可用于测量细胞深度的量。例如，此处显示了死细胞数量较少和较高的样品。
可以通过设门去除铂 198 阳性细胞群来去除死细胞，条形码可在条形码参数内实现样品的明显分离，从而将细胞分配到其原始样品身份。IDU 标记可用于检测此处观察到的美国面部细胞。在初始归一化、去条形码和门控之后，可以使用 SPADE 算法分析高维数据，以生成更适合视觉解释的数据的低维表示。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四到六个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住在执行洗涤步骤时尽量减少样品损失。观看此视频后，您应该对如何制备用于质谱流式细胞术分析的样品有很好的了解。
不要忘记使用叠氮化钠可能很危险，因此在执行此程序时应采取预防措施，例如佩戴适当的 PPE。
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概述
本文描述了用于质谱细胞分析的样品收集和处理方法。该方法旨在产生一致的抗体染色，以检测异质性细胞群体。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 质谱细胞分析
背景
- 质谱细胞分析允许在单个细胞水平测量高参数蛋白质水平。
- 它对于理解细胞身份和信号传导很有用。
- 该技术适用于复杂的异质性细胞群体。
- 样品制备对于获得稳健的结果至关重要。
研究目的
- 展示质谱细胞分析的样品制备过程。
- 使得能够检测多样化的细胞群体。
- 提供有关细胞反应和相互作用的见解。
使用的方法
- 在无血清培养基中重新悬浮单细胞悬液样品。
- 使用新鲜制备的顺铂进行细胞处理。
- 在轨道摇床上孵育以实现一致混合。
- 处理后进行离心和细胞洗涤。
主要结果
- 展示了有效的样品制备技术。
- 在样品中实现了一致的抗体染色。
- 在单个细胞水平上促进了高参数分析。
- 获得了有关异质性细胞群体的见解。
结论
- 该方法增强了分析复杂细胞群体的能力。
- 稳健的样品制备对于获得准确的质谱细胞分析结果至关重要。
- 该技术可以推进细胞生物学和神经科学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
