Name: 样品制备质谱术分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学习质谱流式细胞术样品制备方法，用于单细胞水平的高参数蛋白检测和异质性细胞群体分析。该技术可实现细胞身份识别与信号通路研究，为神经科学和细胞生物学研究提供可靠的实验基础。

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Barton 实验室的工作得到了德克萨斯州癌症预防与研究所（CPRIT RP110471）资助项目的支持。本研究部分得到了美国国立卫生研究院分子遗传学培训项目资助的培训基金支持，该基金授予瑞安·L·麦卡锡（Ryan L. McCarthy），项目编号为 5 T32 CA009299。负责维护和运行质谱流式细胞仪的核心设施得到了德克萨斯州癌症预防与研究所资助（RP121010）以及美国国立卫生研究院核心资助（CA016672）的支持。

1. 细胞收获
<ol>
	<li>从原代组织中收获细胞 
	注意：此处所述从原代组织中收获细胞的方法专门适用于小鼠乳腺肿瘤组织，可能不直接适用于其他来源的原代组织。
	<ol>
		<li>按每克待处理组织在10 mL DMEM/F12培养基中溶解5 mg透明质酸酶和30 mg胶原酶，配制消化缓冲液。对消化缓冲液进行过滤除菌。</li>
		<li>从小鼠中分离原代乳腺肿瘤组织，并记录肿瘤重量。</li>
		<li>使用#10手术刀将组织切碎，持续至少5分钟。</li>
		<li>将切碎的组织加入适量体积的消化缓冲液中（每克组织使用10 mL缓冲液）。</li>
		<li>在37 °C下，以100 rpm振荡切碎的组织1–3小时。</li>
		<li>通过0.4 μm滤膜将细胞过滤至50 mL离心管中，获得单细胞悬液。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心10分钟。倾去或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于4 mL DMEM/F12培养基中，并转移至5 mL圆底试管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从组织培养物中收获细胞
	<ol>
		<li>在室温下用不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞的培养板或培养瓶。 
		注意：此处所述的细胞收获技术专门适用于人胚胎干细胞（hESC）贴壁培养细胞。然而，后续所述的实验流程广泛适用于其他培养的细胞系、非贴壁细胞系以及原代细胞。</li>
		<li>加入预热（37 °C）的胰蛋白酶或其他适用于获得单细胞悬液的酶消化试剂。遵循制造商提供的操作说明。 
		注意：胰蛋白酶及其他酶解离试剂可能影响细胞表面标志物的表达。</li>
		<li>在37 °C孵育2–5分钟以使细胞脱落。对于高密度培养的细胞，可轻轻敲击培养板以帮助细胞脱落。</li>
		<li>将完全脱落的细胞转移至5 mL圆底试管中，并使用1 mL移液器轻柔吹打以进一步解离细胞。 
		注意：若需处理大量样本，所有步骤也可在96孔圆底板中进行。在96孔板格式中，所有洗涤步骤可使用250 μL体积进行。其他步骤中所述体积可相应调整，使总体积不超过300 μL。</li>
		<li>用等体积的洗涤缓冲液（含0.5% BSA和0.02%叠氮化钠的PBS）淬灭酶消化反应。 
		注意：叠氮化钠为危险化学品，配制和操作时必须采取适当的安全防护措施。</li>
		<li>在37 °C下以300 × g离心5分钟。倾去或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>将细胞重悬于1 mL无血清培养基中。</li>
		<li>取10 μL细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中进行细胞计数。用台盼蓝按已知比例稀释后，转移至血细胞计数板或自动细胞计数系统中进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S期细胞群体标记 
	注意：若不进行S期标记，请直接进入步骤1.4。
	<ol>
		<li>为每2 × 106个待分析细胞，用无血清DMEM F12或其他适宜培养基配制1 mL浓度为10 μM的5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）。</li>
		<li>为每2 × 106个细胞加入500 μL浓度为10 μM的IdU无血清培养基。 
		注意：虽然IdU标记可在含血清培养基中进行，但游离蛋白会与顺铂反应，从而阻碍死细胞的正确标记。若在IdU标记过程中使用含血清培养基，则必须在顺铂活/死染色前增加一步无血清培养基洗涤，以去除血清蛋白。</li>
		<li>使用1 mL移液器轻柔重悬沉淀。</li>
		<li>在37 °C下轻轻振荡孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活/死细胞标记
	<ol>
		<li>为每个样本配制500 μL浓度为50 μM的顺铂无血清DMEM-F12或其他适合细胞类型的培养基。 
		注意：若不进行IdU对S期细胞的标记，则将样本重悬至浓度为4 × 106个细胞/mL。在加入顺铂前重悬细胞，有助于溶液快速均匀混合，实现一致的活/死标记。</li>
		<li>每2 × 106个细胞加入500 μL浓度为50 μM的顺铂。</li>
		<li>在室温（RT）下于旋转摇床上持续混匀孵育1分钟。</li>
		<li>用等体积的洗涤缓冲液淬灭顺铂反应。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心5分钟。倾去或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>用500 μL洗涤缓冲液洗涤样本两次，以去除过量顺铂。</li>
		<li>用500 μL PBS洗涤样本两次，以去除过量蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本固定
	<ol>
		<li>将样本重悬于500 μL PBS中。</li>
		<li>加入等体积的4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液，终浓度为2%；用移液器混匀。 
		注意：应使用粉末新鲜配制4% PFA，调节pH至6.9，并经0.44 μm滤膜过滤。4% PFA PBS溶液可在4 °C保存最多两周。应避免使用市售安瓿瓶装的预混福尔马林，除非经过专门验证，因其常含有金属污染物，可能干扰质谱通道的检测。较低浓度的PFA可能已足够，并有助于减少固定对抗体结合的影响，但需通过实验经验确定。</li>
		<li>在室温下于旋转摇床上持续混匀孵育15分钟。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟。倾去或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>用PBS洗涤样本以去除PFA溶液。 
		注意：此步骤后样本可在4 °C短期保存。长时间在4 °C保存可能导致样本降解和染色效果下降。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 条形码标记
注意：虽然本文同时介绍了单同位素顺铂条形码和钯条形码的使用方法，但可根据实验需求独立使用其中一种，或完全不使用。

<ol>
	<li>单一同位素顺铂条形码标记 
	注意：由于顺铂条形码标记和顺铂活/死细胞染色依赖于重叠的检测通道，因此应特别注意尽量减少活细胞中背景性的顺铂活/死染色信号，以免干扰顺铂条形码的准确性。
	<ol>
		<li>将1 mM的单一同位素顺铂储备液用PBS稀释至200 μM。</li>
		<li>针对每种独特的顺铂条形码，为每2 × 106个接受该条形码的细胞准备一个含500 μL PBS的1.5 mL离心管。</li>
		<li>为制备每种独特的条形码，向溶液中加入相应的单一同位素顺铂，使其终浓度为200 nM。</li>
		<li>将细胞重悬于每2 × 106个细胞500 μL PBS中。</li>
		<li>向每个样本中加入等体积的对应条形码溶液。</li>
		<li>在室温下，于旋转摇床上持续混匀孵育5分钟。</li>
		<li>加入等体积的洗涤缓冲液以淬灭顺铂反应。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟，弃去上清液或小心吸除，勿扰动沉淀。</li>
		<li>用500 μL洗涤缓冲液洗涤样本两次，以去除多余的顺铂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钯条形码标记 
	注意：钯条形码试剂可自行制备5，也可商业购买。
	<ol>
		<li>瞬时部分透化19 
		注意：钯螯合条形码标记需要对细胞膜进行部分透化，以便试剂穿过细胞膜并有效标记细胞。
		<ol>
			<li>用500 μL PBS洗涤样本。</li>
			<li>用500 μL含0.02%皂苷的PBS洗涤样本。</li>
			<li>将沉淀重悬于残留液体中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>应用钯条形码标记。
		<ol>
			<li>将100倍浓度的钯条形码试剂储备液用1 mL预冷的含0.02%皂苷的PBS稀释。</li>
			<li>迅速将稀释后的条形码试剂加入重悬的样本中。</li>
			<li>在室温下，于旋转摇床上持续混匀孵育15分钟。</li>
			<li>用500 μL洗涤缓冲液洗涤样本两次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞表面染色
注意：在固定之前，可对活细胞进行细胞表面染色。对于那些在固定后对其表位亲和力下降的抗体，此步骤可能是必要的。某些细胞样本在抗体标记前可能需要额外的封闭步骤，例如白细胞的Fc受体封闭，以降低背景信号。最佳封闭条件应根据具体的样本类型通过实验确定。

<ol>
	<li>准备细胞表面抗体染色方案。
	<ol>
		<li>将每种浓度为 0.5 mg/mL 的细胞表面抗体各 0.5 μL（或根据经验确定的用量）加入一个 1.5 mL 离心管中，每个样本一份。如有需要，加入洗涤缓冲液，使每份样本总体积达到 10 μL。用移液器吹打混匀。 
		注意：每个抗体的工作稀释度应在实验前通过滴定实验经验性确定。</li>
		<li>将细胞表面抗体混合液等量分装至多个 1.5 mL 离心管中，每管对应一个待染色样本。</li>
		<li>为每个样本在 1.5 mL 离心管中准备 500 μL 洗涤缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以统一的体积对所有样本进行细胞表面染色。 
	注意：为确保多个样本间抗体标记的一致性，必须严格控制样本体积和抗体浓度。以下步骤旨在通过确保加入抗体后的最终样本体积一致，从而实现染色条件的均一性。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>使用设定为 50 μL 的 200 μL 移液器，吸除样本沉淀中残留的液体，并转移至含有分装好的细胞表面抗体混合液的离心管中。</li>
		<li>用移液器将分装管中的所有液体吸起，避免吸入空气。</li>
		<li>保持移液器按钮压下状态，将吸头移入装有 500 μL 洗涤缓冲液的预置离心管中，然后缓慢释放按钮。</li>
		<li>将移液器吸头中的液体重新加入样本管中，通过轻柔吹打重悬细胞。</li>
		<li>在室温下，将样本置于旋转摇床中孵育 1 小时，持续混匀。</li>
		<li>用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤样本两次，以确保去除所有未结合的抗体。</li>
		<li>用 500 μL PBS 洗涤样本一次。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 500 μL PBS 中。</li>
		<li>加入等体积的 PBS 配制的 4% 多聚甲醛；吹打混匀。</li>
		<li>在旋转摇床上孵育 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞通透化与细胞内染色
<ol>
	<li>细胞通透化
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心细胞 5 分钟。倾去上清液，或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>通过轻柔涡旋，用残留液体重悬细胞，直至沉淀完全分散。 
		注意：若在加入甲醇前未充分分散细胞，会导致细胞聚集并形成一层薄膜，从而造成部分样本损失。</li>
		<li>每 2 × 106 个细胞立即加入 1 mL 100% 甲醇（MeOH），并轻轻吹打混匀。 
		注意：可使用其他通透化方法替代甲醇，某些细胞类型可能需要特定方法以实现最佳通透效果。例如，某些细胞来源可使用含 0.1% Triton X-100、0.2% Tween-20 或 0.1% 皂苷的 PBS 溶液进行通透化处理，可在保证通透效果的同时更好地维持细胞完整性。</li>
		<li>在 4 °C 条件下孵育样本至少 1 小时，最长不超过 24 小时，以完成通透化。 
		注意：此步骤中，经甲醇处理的样本可在 -80 °C 保存长达 1 个月。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心细胞 5 分钟。倾去上清液，或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>根据用于通透化的每毫升甲醇，加入 1 mL 洗涤缓冲液。轻柔重悬细胞沉淀。</li>
		<li>用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤样本两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备胞内抗体染色组合。
	<ol>
		<li>将每种浓度为 0.5 mg/mL 的胞内抗体各 0.5 μL（或根据经验确定的用量）加入一个 1.5 mL 离心管中，每个样本单独配制。如需，加入洗涤缓冲液使总体积达到每个样本 10 μL。通过吹打混匀。</li>
		<li>将胞内抗体混合液等量分装至每个样本对应的 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>为每个样本在 1.5 mL 离心管中准备 500 μL 洗涤缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以统一的体积对所有样本施加胞内染色。 
	注意：为&#160;确保多个样本间抗体标记的一致性，严格控制样本体积和抗体浓度至关重要。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心细胞 5 分钟。倾去上清液，或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>将 200 μL 移液器设定至 50 μL，吸取样本沉淀中残留的液体，并转移至已分装好的细胞表面抗体混合管中。</li>
		<li>用移液器将分装管中的所有液体吸起，避免吸入空气。</li>
		<li>保持移液器按钮压下状态，将吸头移入预先准备的含 500 μL 洗涤缓冲液的离心管中，然后缓慢释放按钮，吸入洗涤缓冲液，使样本总体积达到 50 μL。</li>
		<li>将移液器吸头中的液体重新加回样本管中，并通过轻柔吹打使样本在液体中重悬。</li>
		<li>在室温下，将样本置于旋转摇床上持续混匀，孵育 1 小时。</li>
		<li>用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤样本两次。</li>
		<li>用 500 μL PBS 洗涤样本一次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 铱标记
<ol>
	<li>固定样品
	<ol>
		<li>将样品重悬于 500 μL PBS 中。</li>
		<li>加入 500 μL 含 4% PFA 的 PBS 溶液。</li>
		<li>在室温下于旋转摇床上持续混匀孵育至少 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行铱标记 DNA
	<ol>
		<li>将 125 μM 的 500 倍铱嵌入试剂用含 4% PFA 的 PBS 稀释至终浓度为 62.5 nM。</li>
		<li>向样品中加入 500 μL 浓度为 62.5 nM 的含铱 PFA 溶液。 
		注意：对于使用通透化细胞的实验，应将 500 倍&#160;Ir191/193 储液稀释至最终稀释比例为 1:2,000，以避免过度染色。</li>
		<li>在室温下于旋转摇床上持续混匀孵育 15 分钟。 
		注意：若进行单一同位素顺铂条形码标记，则样品与铱的孵育时间不得超过 15 分钟，因为强烈的 Ir193 信号可能干扰&#160;Pt194 质量通道，从而对条形码质量产生负面影响。</li>
		<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液或小心吸除上清液，勿扰动沉淀。</li>
		<li>用 500 μL 含 0.1% BSA 的过滤去离子水洗涤样品两次。 
		注意：样品制备完成后，建议尽可能在 24 小时内上机检测。样品可短期储存于 4 °C，但需注意避免降解。如条件允许，最后的洗涤步骤应使用不含 BSA 的过滤去离子水，以减少仪器喷雾室和采样锥上的沉积物，从而降低仪器清洁频率。但对于人胚胎干细胞（hESCs），必须在洗涤液中保留 BSA，以防止样品黏附于管壁造成损失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 准备样品以进行采集
<ol>
	<li>细胞计数
	<ol>
		<li>将细胞重悬于 500 μL 含 0.1% BSA 的过滤去离子水中，并通过 35 μm 细胞滤网帽过滤至新离心管中。 
		注意：降低最终洗涤步骤中 BSA 的浓度可减少质谱流式细胞仪雾化器上的残留物。非贴壁细胞可直接用过滤去离子水洗涤并重悬。</li>
		<li>取 10 μL 细胞悬液转移至微量离心管中进行细胞计数。用台盼蓝按已知比例稀释该 aliquot（以利于细胞观察），然后转移至血细胞计数板或自动细胞计数系统中进行计数。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液或小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备与上样
	<ol>
		<li>取出校准微球，恢复至室温后剧烈震荡，使其充分重悬。</li>
		<li>若使用质谱流式自动进样器运行样品，需向样品板的每个孔中加入 50 μL 校准微球，然后加入待分析的细胞。若采用手动进样，则将 50 μL 校准微球加入样品中，用过滤去离子水稀释样品，充分混匀后载入质谱流式细胞仪的样品进样口。合适的样品稀释倍数可能因分析的细胞类型而异，但通常稀释至 106 倍较为适宜1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案已成功用于多种培养细胞系（H1 和 H9 人胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞、MCF7、HEK 293、KBM5、HMEC、MCF10a）以及原代组织样本（小鼠骨髓、小鼠胚胎肝脏、小鼠成年肝脏、小鼠肿瘤）的处理。无论样本来源如何，任何能够解离为单细胞并同时保持细胞状态的组织均适用于质谱流式细胞术分析，但可能需要对方案进行一定优化。需要注意的是，特定的解离、固定和通透处理可能会影响某些表位，因此这些方法可能需要根据样本进行特异性优化。如果某个抗体信号较弱，可通过在活细胞上进行细胞表面标记、更换通透方法或缩短固定时间来改善信号强度。
在实验设计允许的情况下，在样本处理流程中引入条形码技术可确保样本在细胞浓度和抗体浓度水平上的一致性。如果不使用条形码，即使在样本处理过程中已尽可能严格控制条件，仍可能在不同样本之间引入抗体浓度和细胞浓度的微小差异。此外，由于不同样本中特定表位阳性细胞的比例可能存在差异，即使总体抗体浓度保持一致，有效抗体与表位的比例在不同样本间也可能必然不同，从而可能导致抗体染色结果的不一致。这些差异在单通道检测时通常较小，但在进行高参数实验时可能被显著放大，若在数据...

细胞计量技术能够在大量细胞群体中对单个细胞水平的多种抗体靶标进行同时检测。在传统的基于荧光的流式细胞术中，可定量的参数数量受限于多种荧光染料发射光谱之间的光谱重叠，随着检测参数数量的增加，需要进行日益复杂的补偿计算。质量细胞术克服了这些限制，该技术通过飞行时间（TOF）质谱法检测和定量重金属标记的抗体，从而显著增加可同时采集的参数数量，并为每个单细胞提供高维度的蛋白质丰度谱型。
了解质谱流式细胞仪的基本工作原理对用户很有帮助，且可能对故障排查至关重要。有关质谱流式细胞仪调谐和运行的更详尽描述，请参见相关论文1。简而言之，细胞样本使用一组金属标记的抗体进行标记，这些抗体靶向细胞表面标志物、胞质蛋白、核蛋白、染色质结合蛋白或其他感兴趣的表位（图1i）。标记后的细胞通过手动进样逐个加载到仪器上，或使用自动进样器从96孔板中取样加载。加载的细胞通过雾化器注入，产生包裹细胞的液滴喷雾（图1ii）。该喷雾被定位，使细胞被氩等离子体炬电离。此电离过程生成由每个细胞所有组成原子构成的粒子云（图1iii）。当该粒子云向检测器移动时，四极杆质谱过滤器将低原子质量的原子与高质量离子分离。剩余的高质量离子继续进入检测器，在此每种同位素的丰度被定量（图1iv）。检测器收集的原始数据由质谱流式细胞仪软件分析，以识别细胞事件。对于每个识别出的细胞事件，各通道检测到的信号被定量并保存至输出的.fcs文件中。用于检测重金属标记抗体的质量通道之间光谱重叠极小，通常在0–4%之间，大多数重叠低于1%。由于通道间串扰极低，通常在分析前无需使用补偿矩阵对数据进行转换2。然而，在设计实验用抗体组合时应谨慎，确保高丰度表位的抗体不被分配至会对低丰度抗体所用通道产生信号干扰的质量通道，否则可能导致接收信号贡献的通道出现人为偏高的细胞群。
质谱流式细胞术分析的样本制备过程在很大程度上取决于所采集样本的类型以及待验证的实验假设。本文提供了两种获取不同类型细胞的实验方案示例：一种为人类胚胎干细胞，另一种为原代细胞（小鼠乳腺肿瘤上皮细胞分离物）。在启动质谱流式细胞术研究时，建议首先开展小规模的预实验，以确保所有拟使用的实验方案和抗体在研究者操作条件下均能正常工作。当使用定制偶联抗体时，这一步骤尤为重要，因为在抗体偶联过程中所涉及的部分还原反应可能会影响抗体的亲和力；因此，每种定制抗体均需通过实验进行经验性验证，以确保数据的准确性。其他需要考虑的因素包括：确定实验中拟使用的细胞表面抗体是否能在固定后仍识别其表位，或是否必须在活细胞上进行染色。某些固定方法可能会阻碍细胞表面抗体的正常染色，例如已知肽段-MHC复合物的染色即会受到此类影响3,4。对于某些抗体而言，可能必须在活细胞上进行细胞表面抗体染色，但这将排除在抗体标记前进行条形码标记（barcoding）的可能性，因为大多数条形码标记方法均在固定后进行5，尽管基于抗体的条形码标记方法6,7是一个例外。
在确定用于分析的细胞数量时，需要注意的是，加载到仪器上的细胞仅有部分会被检测并产生数据。这种损失主要源于雾化器在炬管处喷雾样品时的效率不足。具体的损失百分比取决于质谱流式细胞仪的设置和细胞类型，通常在50%至85%之间，因此在实验设计时应予以考虑。本方案已针对每样本2×106个细胞进行优化，但也可根据需要调整用于处理更小或更大的样本量。对于1×106至4×106范围内的样本量，本方案只需极少修改即可适用，但在同一实验中必须保持样本量的一致性。细胞数量的变化可能影响条形码标记和抗体染色的强度，因此在需要直接比较的样本之间，细胞数量应大致保持一致。
某些实验步骤，例如死细胞标记和DNA标记，在绝大多数甚至所有实验设计中都应进行。在仅分析表面标志物的实验中，可使用Rh103进行死细胞标记，但在需要透膜处理的实验中应避免使用Rh103，因为它会导致染色信号丢失。对于涉及透膜处理的实验，建议使用顺铂8，并尽可能联合使用识别裂解型PARP或裂解型Caspase的抗体，以检测凋亡细胞和死亡细胞。
样本条形码技术可减少抗体消耗、缩短检测时间，并消除样本间的变异9。条形码技术的原理是对所有细胞标记独特的、针对特定样本的编码，从而在后续分析中将每个细胞准确归类至其来源样本。完成条形码标记后，可在抗体染色前将样本混合，该步骤可确保所有样本经历一致的染色条件。为最大限度降低实验误差，建议对需要直接比较的样本进行条形码标记并合并处理。目前已有多种适用于质谱流式分析的样本条形码方法5,6,7，本文将介绍其中两种（见下文）。
利用目前可用的试剂，可以在多组样本的多重实验中定量检测38种抗体靶标，识别处于S期的细胞10，区分活细胞与死细胞8，以及测量细胞内的缺氧水平11。这种对大规模细胞群体获取高参数单细胞数据的能力，有助于更精确地分析高度异质性的细胞群体，并已产生多项新的生物学发现12,13,14,15,16。将由此产生的复杂数据提炼为可解释的信息，需要借助计算算法，包括密度归一化事件的生成树进程分析（Spanning Tree Progression of Density Normalized Events, SPADE）17和可视化t-随机邻域嵌入（viSNE）18。
本文介绍了质谱流式细胞术实验的设计与实施方法，并概述了质谱流式细胞术数据的基本分析方法。

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 培养基试剂盒</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>使用前于室温下回温</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 下预热</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 下预热</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>提供浓度为 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>提供浓度为 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>提供浓度为 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>顺铂</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>可溶于 DMSO 至 25&amp;nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd 条形码试剂盒</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-碘-2'-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>可溶于 0.2&amp;nbsp;N NaOH 至 74&amp;nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>铑 103 插入剂</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>使用前于 -20&amp;nbsp;&amp;deg;C 冷却</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &amp;#956;m 滤帽管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ 四元素校准微珠</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶 I-S 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>产气荚膜梭菌胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀 #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

质谱流式细胞术分析的样本制备

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

质谱流式细胞术利用与重金属标签偶联的抗体，这一方法显著增加了可检测的参数数量，极大地拓展了深度分析的可能性，远超传统基于荧光的流式细胞术所能达到的范围。与任何新技术一样，存在若干关键步骤有助于确保可靠地生成高质量数据。本文提供了一项经过优化的实验方案，整合了多种用于质谱流式细胞分析样本处理的技术。文中所述方法将帮助使用者避免常见误区，通过减少实验变异性获得稳定可靠的结果，从而防止数据失真。为指导实验设计，本文还阐述了方案中可选或替代步骤背后的科学依据，以及这些步骤在揭示所研究生物系统新发现方面的有效性。最后，提供了代表性数据以展示采用本方案技术所能获得的预期结果。

本方案可广泛适用于多种培养细胞和原代细胞样本，仅需少量修改。根据实验需求，可在无需某些步骤（如条形码标记或细胞表面染色）时，以模块化方式执行该方案。若完整使用本方案，则可制备用于多重质谱流式分析的样本，实现死细胞排除、S期细胞群鉴定，并对多达38种抗体靶标进行定量检测。
本方案所述方法产生的预期结果（图2）如图3所示。数据采集后，可在质谱流式软件中根据校准微球的信号强度对信号强度进行归一化处理。归一化后，可使用任何具备流式细胞数据分析能力的软件手动进行初步数据处理，包括去除校准微球、圈选单细胞以及去除死细胞。去除校准微球可通过圈选 Ir191+ Ce140- 群体（图3A）手动完成，或使用基于 MATLAB 的算法20实现。通过在 Ir193 与事件长度（Event Length）的双轴图上设门（<str...

本文介绍了用于质谱流式细胞术分析的样本采集与处理方法。

质谱流式细胞术利用与重金属标签偶联的抗体，这一方法极大地增加了可检测参数的数量和研究机会……

本样品制备流程的总体目标是实现对多种样品进行稳定且可重复的抗体染色，从而能够分析异质性细胞群体。该方法可用于解答关于复杂异质性细胞群体中细胞身份、细胞信号传导及细胞应答的问题。该技术的主要优势在于，能够在单细胞水平上检测高参数的蛋白质表达水平。本实验操作将由本实验室的研究生 Aundrietta Duncan 演示。对于每份单细胞悬液样品，用无血清培养基重悬至浓度为每毫升四乘以十的六次方个细胞，每 2/10 的六细胞样品中加入 500 微升新配制的 50 微摩尔顺铂，并将样品置于旋转摇床上，在室温下持续振荡孵育。一分钟后，加入等体积的洗涤缓冲液淬灭顺铂反应，随后离心细胞。弃去上清液，再用 500 微升洗涤缓冲液洗涤样品两次，每次均通过离心细胞并倾倒弃去洗涤缓冲液。随后同样用 500 微升 PBS 洗涤两次，每次均离心样品并弃去上清液。第二次 PBS 洗涤后，将沉淀重悬于 500 微升新鲜 PBS 中，并加入 500 微升 4% PFA 固定细胞。用移液器吹打细胞以混匀。随后将样品置于摇床中，在室温下持续振荡混合15分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞沉淀，弃去上清液，再用新鲜的PBS洗涤一次。为了透化细胞，再次离心细胞并弃去上清液。用残留的 PBS 轻柔涡旋重悬样品，并立即通过轻柔吹打加入一毫升 100% 甲醇至 2/10 × 10⁶ 个细胞中。将样品在 4°C 下孵育至少一小时，孵育结束后离心细胞。随后，倒出甲醇。然后每毫升甲醇用一毫升洗涤缓冲液洗涤沉淀，再用500微升新鲜洗涤缓冲液重复洗涤两次。使用调至50微升的200微升移液器，将每个沉淀中残留的洗涤缓冲液转移至相应抗体混合液的离心管中。将移液器吸头插入合并后的溶液中，保持按钮部分下压，避免吸入空气，重新吸取溶液。然后将移液器吸头转移至含有500 µL洗涤缓冲液的1.5 mL微量离心管中，在此过程中不要松开按钮。松开按钮，吸入洗涤缓冲液，使抗体混合液总体积达到50 µL，并通过轻柔移液将吸出的抗体混合液加入相应的待标记样品中。在室温下持续振荡孵育一小时后，将样品洗涤四次，每次均倾去洗涤缓冲液。为了用铱对细胞进行标记，将最终的沉淀重悬于500 µL PBS中，随后加入500 µL 4%多聚甲醛，在室温下孵育15分钟。接着，向样品中加入500 µL新配制的62.5 nmol/L铱和多聚甲醛溶液，在室温下继续振荡15分钟。然后，离心细胞，弃去上清液，并用500微升含0.1% BSA的过滤去离子水洗涤两次。通过将标准化微珠加入样品板的孔中，用移液器将细胞加入这些孔内，然后在24小时内进行质谱流式细胞术分析。在完成信号强度标准化后，可通过门控排除含铱-191阳性的微珠阴性细胞群，从而从数据中去除校准微珠信号。然后可以通过使用铱193阴性表达与事件长度的双轴图对单细胞事件进行设门，以去除碎片和细胞多重体。顺铂标记可用于测量细胞的深度。例如，此处展示了死细胞数量较低和较高的样本。可通过排除铂-198阳性的细胞群体来去除死细胞，条形码标记可使各样本在条形码参数中实现明显分离，从而将细胞分配至其原始样本身份。IDU标记可用于检测此处观察到的US面细胞。在完成初始归一化、去条形码及设门步骤后，可利用SPADE算法对高维数据进行分析，以生成更易于可视化解释的低维数据表示。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四到六小时内完成。在进行此实验步骤时，重要的是要记住在洗涤步骤中尽量减少样品损失。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备用于质谱流式细胞分析的样品。请注意，叠氮化钠具有潜在危险性，因此在进行此操作时应采取预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

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生物学

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