一种简便有效的成人皮肤组织中人角质形成细胞的分离方法

本视频的总体目标是介绍一种新的简单方法，从成人皮肤组织中分离和培养原代人表皮细胞。这种先进的方法更适合生产大量用于实验室和临床应用的高潜力表皮细胞。称重前用 PBS 洗涤组织。

用电子秤称量皮肤组织。用 70% 乙醇冲洗皮肤组织 30 秒。将组织在 PBS 中用抗生素孵育两次，每次 5 分钟。

将组织转移到另一个无菌培养皿中，并使用手术刀刀片彻底匀浆。每 5 分钟添加 200 μL PBS 以保持组织湿润。将匀浆组织转移到 50 毫升试管中。

每 1 克皮肤组织加入 10 毫升酶混合物。将酶与匀浆组织充分混合。将混合物在 37 摄氏度的水浴中摇动孵育。

之后，加入 1/5 体积的 0.25% 胰蛋白酶。在 37 摄氏度的水浴中继续孵育 30 分钟。以 1：100 的比例向混合物中加入 Dnase I 溶液。

然后再孵育 5 分钟。通过添加相同体积的中和培养基来终止消化过程。上下移液约 20 次。

通过 100 微米的细胞过滤器过滤解离的细胞以去除组织碎片。以 200 g 离心 5 分钟。观察试管底部的沉淀。

去除上清液，用 10 毫升中和培养基洗涤细胞沉淀。然后以 200 g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于含有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的接种培养基中。

在 100 mm 培养皿中将 10 至 6 个细胞铺板 2 次。三天后，用无血清角质形成细胞培养基替换接种培养基。每两天更换一次培养基。

当细胞达到密度的约 80% 时，传代细胞。用 PBS 洗涤细胞。如有必要，胰蛋白酶消化 2 分钟，然后用 PBS 洗涤细胞以去除受污染的真皮细胞。

加入相同体积的中和培养基。以 200 g 离心 5 分钟。最后，去除上清液并重悬细胞沉淀。

从人体皮肤组织中分离的角质形成细胞通过两种方法分别孵育。传统方法是两步消化，涉及为期两天的程序。相比之下，新方法是一步消化，大约需要三个小时才能完成。

在第三天，我们可以很容易地发现许多用新方法培养的细胞簇，而使用传统方法则不会出现这种现象。在第 5 天，观察到新方法产生了更多的原代细胞。为了测试培养的角质形成细胞的分化状态，我们分析了基底细胞标志物 K5 和末端分化标志物 Loricrin。

我们发现 90% 的总细胞是 K5 阳性，但不到 10% 的细胞在第 3 次传代时表达 Loricrin，表明它们是未分化的角质形成细胞。我们检查了在真皮成纤维细胞中表达的波形蛋白的表达，以检查分离过程中真皮细胞的污染。我们发现大约 3% 的真皮细胞出现在初始传代中，但在第 3 次传代时仅检测到约 0.02% 的真皮细胞，表明传代后表皮细胞纯度高。