基于生物素的下拉法对细胞 miRNAs mRNA 靶点的验证

这种方法可以帮助我们回答 mRNA 生物学领域的关键问题，例如，计算机预测的 mRNA 靶标是否可以直接与特定的细胞 microRNA 相互作用。这种方法的主要优点是它利用生物素化的模拟物来拉低目标 mRNA。这些生物素化模拟物具有锁定的核酸或基于 LNA 的模拟化学，有助于形成非常稳定的寡核苷酸，具有非常高的亲和力，可以增强反应的特异性。

这种方法的含义是，它可以从理解 microRNA 的生物学扩展到基于 microRNA 的治疗。这主要是因为我们都知道 microRNA 在细胞生物学的各个方面都发挥着关键作用。因此，通过识别 microRNA 的靶标，即 mRNA，我们当然可以提供对发现和治疗非常重要的关键知识。

演示该协议的将是来自我们实验室的研究生 Sabyasachi Dash。要用链霉亲和素包被磁珠，首先，彻底涡旋磁珠以重悬。然后，将 30 μL 重悬的微珠转移到 2 毫米无核酸酶的微量离心管中。

将装满磁珠悬浮液的试管放在磁力架上 2 分钟。两分钟后，当珠子被拉到与磁铁接触的试管一侧时，用微量移液管去除上清液。然后，向珠子中加入 100 μL 洗涤缓冲液。

添加洗涤缓冲液后，从磁力架上取下试管。然后，涡旋珠子 15 秒以清洗它们。接下来，将含有磁珠的试管转移到磁力架上 2 分钟。

孵育结束后，吸出上清液并丢弃。然后，向珠子中加入 100 μL RNase 游离溶液。涡旋磁珠 15 秒以混合 RNase 溶液。

然后，将微珠在室温下孵育 5 分钟。孵育 5 分钟后，将含有磁珠的试管转移到磁力架上 2 分钟。孵育后，吸出上清液并丢弃。

接下来，向微珠中加入 100 μL 重悬溶液，涡旋 15 秒。涡旋后，将试管在室温下孵育 5 分钟。5 分钟后，将带有磁珠的试管转移到磁力架上 2 分钟。

两分钟后，吸出上清液并丢弃。接下来，向珠子中加入 200 μL 的珠子封闭溶液。要将微珠重悬于封闭溶液中，请在室温下彻底涡旋 15 秒。

然后，将试管放在 4 摄氏度的多管旋转器上 16 小时。要制备裂解物，请使用细胞刮刀并在层流罩下刮擦转染的 HEK293T 细胞。然后，将细胞悬液转移到 2 mL 微量离心管中。

接下来，将细胞悬液以 1， 500 g 离心 5 分钟。离心后，将细胞沉淀溶解在维持在 pH 7.2 的 1x 磷酸盐缓冲盐水中。重复离心过程，以获得残留的无培养基沉淀。

离心结束后，将沉淀物快速转移到冰上。接下来，准备新鲜的细胞裂解缓冲液。制备缓冲液后，向微量离心管中的样品中加入 260 μL 完全细胞裂解缓冲液。

取细胞沉淀数次以获得均匀的悬浮液。要裂解细胞，请将试管在 80 摄氏度下孵育 10 至 15 分钟。然后，将细胞放在冰上。

在 4 摄氏度的台式离心机中以 16， 000 g 的浓度重复离心过程 5 分钟。离心后，将含有裂解物的上清液转移到冰上的无菌 1.7 ml 微量离心管中，然后排出沉淀。向上清液中加入 5 摩尔氯化钠，使最终浓度达到 1 摩尔。

首先，准备 pull-down 洗涤缓冲液。磁珠封闭后孵育过夜后，将含有磁珠的试管转移到磁力架上 2 分钟。孵育期后弃去上清液。

向磁珠中加入 150 μL 冰冷的下拉洗涤缓冲液。然后，在室温下涡旋磁珠 15 秒。并立即在室温下孵育 30 至 60 秒。

一分钟后，将含有磁珠的试管转移到磁力架上 2 分钟。孵育期后弃去上清液。然后，将磁珠重悬于 300 μL 完全沉降洗涤缓冲液中。

添加氯化钠后，将 300 μL 细胞裂解物转移到装有 300 μL 磁珠的微量离心管中。然后，将混合物在章动搅拌机上室温放置一个小时。一小时后，将试管转移到磁铁上 5 分钟。

孵育期后弃去上清液。接下来，向珠子中加入 300 微升冰冷的完全下拉洗涤缓冲液。添加缓冲液后，在室温下涡旋磁珠 15 秒。

然后，将试管放在磁力架上 5 分钟。孵育期后弃去上清液。然后，将珠子溶解在 100 μL 无核酸酶水中，并储存在冰上。

从珠子中分离总 RNA。然后，将分离的 RNA 溶解在 25 μL 无核酸酶水中。接下来，在分光光度计中测量 RNA 的浓度。

最后，制备 50 ng/μL 的 RNA 工作储备液。接下来，按照制造商的说明使用 50 ng 分离的总 RNA 合成互补 DNA。然后，添加寡核苷酸引物至最终体积为 20 μL。

将 PCR 管放在热循环仪上并开始运行。qPCR 完成后，在板的每个孔中转移 9 μL 的 PCR 反应混合物。向每个孔中加入 1 μL 互补 DNA，使最终体积达到 10 μL。

接下来，使用耐热 PCR 板密封剂密封 PCR 板并加载到热循环仪上。然后，在热循环仪上启动程序。为了验证 miR-125b 的靶标，研究了 PARP-1 和 p53 的靶标 mRNA 的表达水平。

有趣的是，PARP-1 和 p53 mRNA 的表达水平相对高于阴性对照肌动蛋白 mRNA。实验中使用的其他阴性对照是无模板和三个引物生物素化的加扰序列。此外，定量的 PARP-1 和 p53 的三个主要非翻译区也显示出不同水平的扩增。

这是与阴性对照（如 Actin、无模板和 3 个引物生物素化的加扰序列）相比的。PARP-1 和 p53 的扩增表明它们是细胞 miR-125b 的强靶标。一旦掌握，如果作得当，该技术可以从细胞铺板开始，到转染生物素标记的 LNA 模拟物，最后进行 PCR 分析，可以在一周内完成。

观看此视频后，您应该对如何验证哺乳动物细胞中的假定 mRNA 靶标有一个很好的了解。通过在哺乳动物细胞中引入基于三种主要生物素标签的锁定核酸模拟物的转染，可以实现高特异性与低噪音比。不要忘记，使用 RNA，尤其是小 RNA，如 micro RNA，可能高度敏感且容易降解。

因此，在进行该检测时应采取必要的预防措施，例如使用无核酸酶的水、不含核酸酶的微量离心管和无菌缓冲液，并且在进行该检测时应考虑使用新鲜制备的缓冲液和试剂，以获得更好的灵敏度和更好的结果。