rna 下拉法识别长非编码 rna 的 rna 靶点

该程序的总体目标是在培养细胞或组织中鉴定感兴趣的长链非编码 RNA 的 RNA 分子伴侣。该方法可以通过提供有关长链非编码 RNA 调控 RNA 的新重要知识来帮助破译长链非编码 RNA 的生物学功能。这种方法的主要优点是它可用于大多数应用，因为我们已经对其进行了优化，首先是几种长链非编码 RNA，其次是培养细胞和组织提取物。

我们的方法基于前两种方法的混合，ChIRP（代表通过 RNA 纯化分离染色质）和 CHART（即 RNA 靶标的捕获杂交分析）。我们方法的特异性在于，寡核苷酸探针是使用长非编码 RNA 二级结构的生物信息学建模设计的，其目标是识别 RNA 靶标。演示该程序的是我团队的两名技术人员 Benedicte Boyer 和 Severine Guillen。

根据文本方案培养 GH4C1 细胞后，从细胞培养板中取出培养基，并使用一体积的 PBS 冲洗细胞。在 PBS 中加入 10 毫升 1% PFA 以固定细胞。然后，在室温下搅拌 10 分钟的细胞交联。

加入 1 mL 1.25 摩尔甘氨酸，淬灭 PFA 作用，并在室温下搅拌样品 5 分钟。然后，抽吸丢弃溶液，并使用 10 毫升 PBS 冲洗板 2 次，每次 5 分钟。接下来，加入 1 毫升 PBS，使用细胞刮刀收集细胞，并将它们转移到离心管中。

将样品在 510 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后，去除尽可能多的上清液，并将沉淀物无限期地储存在零下 80 摄氏度。为了进行组织交联，将 5 毫克新鲜获得的小鼠垂体组织浸入 10X 体积的 1% PFA 的 PBS 溶液中，并在室温下搅拌样品 10 分钟。

加入 0.05 毫升 1.25 摩尔甘氨酸溶液淬灭 PFA，并在室温下搅拌组织 5 分钟。吸出培养基并使用 0.5 毫升 PBS 冲洗组织两次。去除尽可能多的上清液后，将交联组织无限期地储存在零下 80 摄氏度。

制备裂解缓冲液，然后在不事先解冻的情况下裂解样品。使用缓冲液重悬样品，每 100 毫克细胞沉淀物或组织约为 1 mL。将裂解的样品置于 4 摄氏度的水浴中，然后根据文本方案开始优化的超声处理系列。

超声处理后，立即将样品以 12， 000 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟。然后，将上清液转移到新试管中。超声处理系列必须经过优化，以使其足够高效，以降低 DNA 的粘度，而不会获得其他片段化的 RNA。

要对超声处理的样品进行杂交，请向试管中加入两倍体积的杂交缓冲液并涡旋。将每个样品的 20 微升转移到离心管中，并在零下 20 摄氏度下储存。向每个样品中加入 100 pgol 的生物素化寡核苷酸探针。

然后，在室温下在试管旋转器上适度搅拌孵育样品 4 至 6 小时。孵育后，向样品中加入 50 μL 磁性链霉亲和素珠，并补充 200 单位/mL 的 RNase 抑制剂溶液和 5 μL /mL 蛋白酶抑制剂混合物。在室温下在试管旋转器上适度搅拌下孵育试管过夜。

第二天，通过将试管放在磁性支架上进行 RNA 分离，并弃去上清液。然后，向磁珠中加入 900 μL 洗涤缓冲液，并将试管在室温下放在旋转器上 5 分钟。然后，将样品放在磁力架上，丢弃缓冲液，重复洗涤 5 次。

去除最后一次洗涤液后，向样品中加入 95 微升蛋白酶 K 缓冲液和 5 微升 20 毫克/毫升蛋白酶-K。然后，在冰上解冻输入样品并加入 75 微升蛋白酶 K 缓冲液和 5 微升蛋白酶-K。将样品在 50 摄氏度下孵育 45 分钟，然后在 95 摄氏度下孵育 10 分钟。

将样品在冰上冷却 3 分钟，然后将它们放在磁力架上，收集含有 RNA 的上清液并丢弃磁珠。使用 RNA 纯化试剂盒纯化 RNA。最后，将 RNA 储存在负 80 摄氏度下，进行 RT 和 qPCR 并根据文本方案构建 DNA 文库。

基于此处所示的 lncRNA 二级结构的生物信息学建模，针对两种 lncRNA 设计探针，大鼠 Neat1 或 Malat1 用于 GH4C1 培养细胞，小鼠 Neat1 用于垂体组织提取物。计算相对于输入样品的非特异性和特异性探针的 Neat1 或 Malat1 的相对富集度。该图显示了特异性探针在大鼠 GH4C1 垂体细胞系和小鼠垂体组织提取物中拉低 Neat1 的效率。

当特定寡核苷酸或 SO 探针的方案定向到 Malat1 时，会生成一个高效探针和一个被丢弃的低效探针。RNA pull-downs 和 RT qPCR 后，GH4C1 细胞提取物中与 Neat1 相关的 RNA 也与垂体组织提取物中的 Neat1 相关。事实上，在 Neat1 RNA 下拉后，发现 Malat1 在 GH4C1 细胞系和垂体小鼠组织提取物中都被 Neat1 靶向。

此外，在 GH4C1 细胞中使用探针进行 Malat1 RNA pull-down 后，Neat1 显著富集。两种 lncRNA 之间鉴定的密切关系与 Neat1 和 Malat1 的潜在共调节作用一致，Malat1 基因敲除小鼠表现出 Neat1 RNA 表达的变化。一旦掌握，该技术即可在 2 到 3 天内捕获所需长链非编码 RNA 的 RNA 靶标。

使用生物信息学方法，重要的是要设计几个反义探针，然后通过实验比较它们的效率，因为探针效率可能会因细胞裂解物制备而改变。按照此程序，可以进行高通量 RNA 测序，以提供感兴趣的长链非编码 RNA 的整个 RNA 相互作用组。观看本视频后，您应该对如何使用高效、特异性的探针捕获长链非编码 RNA 的 RNA 伴侣有一个很好的了解，这些探针与长链非编码 RNA 的可用区域杂交，通过其二级结构的生物信息学建模确定。