rna 下拉法识别长非编码 rna 的 rna 靶点
2018年4月10日
这种 rna 下拉法允许识别长的非编码 rna (lncRNA) 的 rna 目标。根据自制的、设计的抗感 DNA 寡核苷酸探针的杂交, 在适当的固定组织或细胞系 lncRNA, 它有效地允许捕获 lncRNA 的所有 RNA 目标。
该程序的总体目标是在培养细胞或组织中鉴定感兴趣的长链非编码 RNA 的 RNA 分子伴侣。该方法可以通过提供有关长链非编码 RNA 调控 RNA 的新重要知识来帮助破译长链非编码 RNA 的生物学功能。这种方法的主要优点是它可用于大多数应用，因为我们已经对其进行了优化，首先是几种长链非编码 RNA，其次是培养细胞和组织提取物。
我们的方法基于前两种方法的混合，ChIRP（代表通过 RNA 纯化分离染色质）和 CHART（即 RNA 靶标的捕获杂交分析）。我们方法的特异性在于，寡核苷酸探针是使用长非编码 RNA 二级结构的生物信息学建模设计的，其目标是识别 RNA 靶标。演示该程序的是我团队的两名技术人员 Benedicte Boyer 和 Severine Guillen。
根据文本方案培养 GH4C1 细胞后，从细胞培养板中取出培养基，并使用一体积的 PBS 冲洗细胞。在 PBS 中加入 10 毫升 1% PFA 以固定细胞。然后，在室温下搅拌 10 分钟的细胞交联。
加入 1 mL 1.25 摩尔甘氨酸，淬灭 PFA 作用，并在室温下搅拌样品 5 分钟。然后，抽吸丢弃溶液，并使用 10 毫升 PBS 冲洗板 2 次，每次 5 分钟。接下来，加入 1 毫升 PBS，使用细胞刮刀收集细胞，并将它们转移到离心管中。
将样品在 510 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后，去除尽可能多的上清液，并将沉淀物无限期地储存在零下 80 摄氏度。为了进行组织交联，将 5 毫克新鲜获得的小鼠垂体组织浸入 10X 体积的 1% PFA 的 PBS 溶液中，并在室温下搅拌样品 10 分钟。
加入 0.05 毫升 1.25 摩尔甘氨酸溶液淬灭 PFA，并在室温下搅拌组织 5 分钟。吸出培养基并使用 0.5 毫升 PBS 冲洗组织两次。去除尽可能多的上清液后，将交联组织无限期地储存在零下 80 摄氏度。
制备裂解缓冲液，然后在不事先解冻的情况下裂解样品。使用缓冲液重悬样品，每 100 毫克细胞沉淀物或组织约为 1 mL。将裂解的样品置于 4 摄氏度的水浴中，然后根据文本方案开始优化的超声处理系列。
超声处理后，立即将样品以 12， 000 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟。然后，将上清液转移到新试管中。超声处理系列必须经过优化，以使其足够高效，以降低 DNA 的粘度，而不会获得其他片段化的 RNA。
要对超声处理的样品进行杂交，请向试管中加入两倍体积的杂交缓冲液并涡旋。将每个样品的 20 微升转移到离心管中，并在零下 20 摄氏度下储存。向每个样品中加入 100 pgol 的生物素化寡核苷酸探针。
然后，在室温下在试管旋转器上适度搅拌孵育样品 4 至 6 小时。孵育后，向样品中加入 50 μL 磁性链霉亲和素珠，并补充 200 单位/mL 的 RNase 抑制剂溶液和 5 μL /mL 蛋白酶抑制剂混合物。在室温下在试管旋转器上适度搅拌下孵育试管过夜。
第二天，通过将试管放在磁性支架上进行 RNA 分离，并弃去上清液。然后，向磁珠中加入 900 μL 洗涤缓冲液，并将试管在室温下放在旋转器上 5 分钟。然后，将样品放在磁力架上，丢弃缓冲液，重复洗涤 5 次。
去除最后一次洗涤液后，向样品中加入 95 微升蛋白酶 K 缓冲液和 5 微升 20 毫克/毫升蛋白酶-K。然后，在冰上解冻输入样品并加入 75 微升蛋白酶 K 缓冲液和 5 微升蛋白酶-K。将样品在 50 摄氏度下孵育 45 分钟，然后在 95 摄氏度下孵育 10 分钟。
将样品在冰上冷却 3 分钟，然后将它们放在磁力架上，收集含有 RNA 的上清液并丢弃磁珠。使用 RNA 纯化试剂盒纯化 RNA。最后，将 RNA 储存在负 80 摄氏度下，进行 RT 和 qPCR 并根据文本方案构建 DNA 文库。
基于此处所示的 lncRNA 二级结构的生物信息学建模，针对两种 lncRNA 设计探针，大鼠 Neat1 或 Malat1 用于 GH4C1 培养细胞，小鼠 Neat1 用于垂体组织提取物。计算相对于输入样品的非特异性和特异性探针的 Neat1 或 Malat1 的相对富集度。该图显示了特异性探针在大鼠 GH4C1 垂体细胞系和小鼠垂体组织提取物中拉低 Neat1 的效率。
当特定寡核苷酸或 SO 探针的方案定向到 Malat1 时，会生成一个高效探针和一个被丢弃的低效探针。RNA pull-downs 和 RT qPCR 后，GH4C1 细胞提取物中与 Neat1 相关的 RNA 也与垂体组织提取物中的 Neat1 相关。事实上，在 Neat1 RNA 下拉后，发现 Malat1 在 GH4C1 细胞系和垂体小鼠组织提取物中都被 Neat1 靶向。
此外，在 GH4C1 细胞中使用探针进行 Malat1 RNA pull-down 后，Neat1 显著富集。两种 lncRNA 之间鉴定的密切关系与 Neat1 和 Malat1 的潜在共调节作用一致，Malat1 基因敲除小鼠表现出 Neat1 RNA 表达的变化。一旦掌握，该技术即可在 2 到 3 天内捕获所需长链非编码 RNA 的 RNA 靶标。
使用生物信息学方法，重要的是要设计几个反义探针，然后通过实验比较它们的效率，因为探针效率可能会因细胞裂解物制备而改变。按照此程序，可以进行高通量 RNA 测序，以提供感兴趣的长链非编码 RNA 的整个 RNA 相互作用组。观看本视频后，您应该对如何使用高效、特异性的探针捕获长链非编码 RNA 的 RNA 伴侣有一个很好的了解，这些探针与长链非编码 RNA 的可用区域杂交，通过其二级结构的生物信息学建模确定。
概述
这种RNA pull-down方法使用特定的反义DNA寡核苷酸探针来识别长链非编码RNA（lncRNAs）的RNA靶标。它适用于培养细胞和组织提取物，增强了我们对RNA调控的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 分子生物学
- RNA生物学
背景
- 长链非编码RNA在基因调控中扮演重要角色。
- 了解它们的RNA伙伴对于破译它们的生物学功能至关重要。
- 这种方法结合了ChIRP和CHART技术的元素。
- 生物信息学建模有助于设计lncRNA的特定探针。
研究目的
- 识别特定lncRNA的RNA分子伙伴。
- 增强对lncRNA调控RNA的知识。
- 优化一种适用于各种应用的方法。
使用的方法
- 用PFA交联细胞和组织。
- 超声波处理以裂解样品并降低粘度。
- 用生物素化寡核苷酸探针使样品杂交。
- RNA分离和纯化，随后进行RT和qPCR。
主要结果
- 特定探针有效地在细胞和组织提取物中拉下lncRNA Neat1。
- 在两种情况下，Malat1被识别为Neat1的靶标。
- 证明了Neat1和Malat1之间的共同调控关系。
结论
- 这种方法提供了一种可靠的方法来研究lncRNA相互作用。
- 研究结果表明Neat1和Malat1具有重要的调控作用。
- 进一步的研究可能阐明这些相互作用的功能含义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying RNA interactors of long non-coding RNAs (lncRNAs) is critical for de-risking target validation in early discovery, particularly for regulatory RNAs with poorly defined mechanisms. This pull-down method enables mechanistic interrogation of lncRNA function by mapping direct and indirect RNA partners, supporting hypothesis-driven target assessment. The approach provides predictive confidence in target selection by revealing co-regulatory networks that may influence disease-relevant pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lncRNA-mediated regulatory hypotheses by identifying associated RNA molecular partners.
- Operational Value: Uses bioinformatics-guided probe design to increase specificity and reduce false-positive interactions in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports target de-risking by revealing co-regulatory lncRNA relationships, such as Neat1-Malat1, that may influence phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified RNA complexes suitable for downstream quantitative analysis, including RT-qPCR and high-throughput sequencing.
- Reproducibility: Standardized cross-linking and wash conditions improve consistency across cell and tissue models, supporting assay transferability.
- Scalability: Compatible with both cultured cells and tissue extracts, enabling flexible application across discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated applicability in both rat cell lines and mouse tissue extracts supports cross-species target validation.
- Mechanistic De-risking: Identification of functionally relevant RNA partners, such as Malat1 as a Neat1 target, aids in prioritizing lncRNAs with regulatory impact.
- Predictive Biomarker Alignment: RNA interactome data can inform biomarker strategies when linked to disease-associated expression patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to lead optimization, providing RNA interaction data that informs target suitability and mechanistic rationale.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing RNA-based mechanisms of lncRNA action, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Outputs purified RNA fractions amenable to quantitative profiling, enabling scalable evaluation of lncRNA interactors.
- Analytics: Enables quantitative measurement of RNA enrichment (e.g., via qPCR or sequencing) to compare specific versus control probe conditions.
- Translational Research: Demonstrated consistency between cell and tissue models supports extrapolation to preclinical systems.
- Enterprise Reuse: Standardized probe design and hybridization workflow allows reuse across multiple lncRNA targets with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic uncertainty in lncRNA target validation by defining RNA interaction networks.
- Operational Value: Standardized fixation, lysis, and hybridization steps enhance reproducibility across laboratories and sample types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing whether a lncRNA engages in functionally relevant RNA-mediated regulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lncRNA targets based on demonstrated interactome complexity and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lncRNA bioinformatics to model secondary structure and design effective antisense probes.
- Dependent on access to sonication equipment optimized to reduce viscosity without excessive RNA fragmentation.
- Necessitates standardized cross-linking and quenching protocols to preserve native RNA-protein-RNA interactions.
- Adaptation across model systems may require validation of fixation efficiency and probe accessibility.
- Practical limitation: Probe efficiency can vary with lysate conditions, necessitating empirical testing of multiple candidates.
