用于评估肿瘤细胞中的微RNA水平、功能和相关靶基因的体外协议
2019年5月21日
该协议使用基于探针的实时聚合酶链反应(PCR)、磺胺胺B(SRB)测定、3'未翻译区域(3'UTR)克隆和荧光素酶测定来验证感兴趣的miRNA的目标基因,并了解miRNA的功能。
获得神经微RNA目标与微RNA功能的相互作用对于了解微RNA如何调节健康状态和患病状态的各种生物过程至关重要。该协议描述了通过策略识别微RNA靶点和功能性微RNA的复制，因为微RNA直接目标的验证具有挑战性。我们的协议可以提供关于单个微RNA的功能和微RNA在癌症治疗中的含义的见解。
计算半最大抑制浓度是一种重要的方法，不仅对于微RNA研究，而且对于其他抗癌药物的疗效评价。我们的协议将有助于新的研究人员，因为我们描述了了解细胞中微RNA水平的基本方法。要开始协议，请用单元格计数器计数单元格。
将细胞板放在96井板中。第二天，准备一组转染混合物，在微RNA对照模拟的几种最终浓度中转染细胞，并模拟微RNA-107。从库存的25微摩尔微RNA控制模仿，或微RNA-107模仿，稀释和添加控制模仿或微RNA-107模仿在减少的血清介质以及微培养管中的转染试剂。
使用微管轻轻混合含寡分的混合物。在细胞培养罩中孵育10分钟后，再次轻轻混合含寡糖的混合物，然后将50微升混合物加入到每个井中。将转染细胞留在细胞培养箱中。
小心地吸进板的每个井中的细胞培养基，并及时将100微升10%的三氯乙酸（TCA）填充到每个井中。将含有 10%TCA 的板在 4 摄氏度下保持一小时。接下来，将盘子淹没在一个带自来水的浴缸里，洗几次。
通过敲击板，直到没有水，从井内去除多余的水，然后擦干板。将 50 微升 0.4% SRB 溶液移入每口井，包括空井。轻轻摇动板，直到 0.4% SRB 溶液均匀地覆盖井底。
然后，孵育板40至60分钟。孵育后，用1%醋酸清洗板，直到未绑定染料被完全冲走。移液100微升10毫摩尔三口基溶液进入相应的井，包括空白井。
将盘子放在摇床上 10 分钟。测量 492 纳米的吸光度。使用 SRB 测定的吸收度值计算每个组的平均吸收率百分比和标准偏差。
通过垂直对齐数据，将原始数据（包括处理浓度、平均吸收度和标准偏差）导入软件。单击"创建图形"选项卡并选择"简单散点错误栏"。选择工作表列作为符号值，然后单击"下一步"。
在"数据格式"面板中，选择 X-Y 对并单击下一步。在"选择数据"面板中选择相应的数据列。单击"完成"以创建绘图。
双击 X 轴可修改轴缩放中的缩放类型。将比例类型从线性更改为日志。将开始和结束范围编号分别修改为 0.01 和 200。
右键单击任何散点图，选择"曲线拟合"，然后转到已定义的子类别用户。选择剂量响应曲线。单击下一个按钮，然后单击"完成"。
转到报表选项卡，然后检查 n、k 和 R 值。运行 PCR，详见随附的文本协议中。然后通过组合反应混合物，包括限制酶Exo1和 Not1在管中加入双消化。
在37摄氏度的水浴中孵育混合物3至4小时。在 1%的加糖凝胶上运行双消化产品。然后在紫外线下切割带子。
从切除频段中净化双消化的PCR产品和荧光素向量。通过制备20微升的结扎反应混合物（包括DNA连接酶），继续将PCR产品与荧光素酶载体连接。将管子短暂离心10至15秒。
使用热循环器在16摄氏度下孵育结扎过夜。第二天，通过将结扎混合物加入含有称职细胞的管中进行转化。轻轻敲按管子，在冰上保持20分钟。
快速、轻轻地将管转移到 42 摄氏度的热块中，30 秒到 1 分钟。热冲击后，将管子放在冰上20分钟。将称职的细胞铺在 LB 阿加板上。
在37摄氏度的培养箱中一夜之间生长称职的细胞。第二天，在含有超纯水的8条管中挑选一个个体菌落并重新分配大肠杆菌，然后重复这一步骤，将大肠杆菌从4个随机选择的菌落重新暂停到8个。将 25 微升大肠杆菌悬浮液转移到另一组 8 条管中。
使用大肠杆菌悬浮液执行菌落 PCR。在24井板中准备荧光素酶测定。在每一个井的500微升细胞培养培养的四个细胞中，将1到2倍的10倍。
经过一夜的孵育，将50纳米的荧光素酶载体转染到细胞中，使用转染试剂进行对照模仿或特定的微RNA模拟。第二天，用磷酸盐缓冲盐水洗两次井内。在测量荧光素酶活性之前，将200微升的解解试剂放入井中，并充分进行细胞解解。
保持板抖至少 15 分钟。将5至10微升的细胞解酶转移到新管中，并加入100微升试剂，然后通过移液立即混合溶液。然后使用光照仪读取萤火虫荧光素酶活性 10 至 15 秒。
在同一管中加入100微升试剂，然后通过移液混合两次。最后，使用光照仪读取 10 到 15 秒的 renilla 荧光素酶活性。RTPCR显示，与HPNE细胞相比，微RNA-107、PANC-1和CAPAN-1细胞显著减少。
与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞的微RNA-301水平显著上升。这项研究中的SRB测定清楚地表明，在微RNA-107模拟转染后，PANC-1细胞的增殖减少。对微RNA-107的11个潜在预测靶点进行筛选，清楚地表明，只有突核素伽马（SNCG）是肿瘤细胞生长的正调节剂，直接与微RNA-107和PANC-1细胞相互作用，表明微RNA-107可以通过调节SNCG表达对PANC-1细胞的增殖产生负性。
使用四氢基实体和 CFSE 的成人细胞增殖检测适用于筛选微RNA模拟等效果，具体取决于细胞类型。基于微RNA的实验验证功能，需要对数据库和目标预测程序进行系统审查，以缩小荧光素分析前候选目标列表。对于微RNA与抗癌药物的结合效率的评价，根据组合指数评价方案计算调整后的IC值是有利的。
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概述
该协议描述了一种识别microRNA靶标并理解其功能的方法，这对于研究健康和疾病中的生物过程至关重要。它利用各种测定来验证microRNA的直接靶标，提供了对其作用的见解，特别是在癌症治疗中。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- MicroRNA研究
- 癌症生物学
背景
- MicroRNA在调节生物过程中起着至关重要的作用。
- 理解microRNA的功能可以帮助癌症治疗的发展。
- 识别microRNA靶标具有挑战性，但对功能研究是必要的。
- 该协议旨在协助研究人员研究microRNA。
研究目的
- 识别microRNA靶标并验证其功能。
- 提供microRNA在癌症治疗中的影响的见解。
- 为研究microRNA的新研究人员建立一种基础方法。
所用方法
- 探针基实时聚合酶链反应（PCR）
- 磺酰罗丹明B（SRB）测定
- 3' 非翻译区（3' UTR）克隆
- 荧光素酶测定
主要结果
- 成功识别microRNA靶标。
- 验证microRNA在生物过程中的功能。
- 提供microRNA在癌症治疗中的作用的见解。
- 为未来研究建立可重复的协议。
结论
- 该协议增强了对microRNA功能的理解。
- 它为进一步研究microRNA-靶标相互作用提供了基础。
- 所概述的方法对于评估抗癌药物有益。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable identification and validation of microRNA (miRNA) targets is a critical inflection point in oncology discovery pipelines, directly impacting target confidence and mechanistic de-risking. This protocol enables quantitative assessment of miRNA function and target engagement in tumor cells, supporting predictive confidence for translational biomarker strategies. Integrating these methods strengthens portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in early-stage cancer R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of miRNA-target gene relationships in disease-relevant tumor models.
- Supports biological de-risking by experimentally validating direct miRNA-mRNA interactions.
- Improves predictive confidence for target nomination and prioritization in oncology pipelines.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, quantitative assays for miRNA function and target validation.
- Facilitates standardization of cell proliferation and luciferase reporter assays for downstream screening.
- Provides dose-response and IC50 data to enable reliable compound or mimic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA functional data with disease-relevant cellular phenotypes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking molecular mechanism to phenotypic outcome.
- Enables risk-adjusted decisions for advancing miRNA-based therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical assessment in oncology research.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for miRNA-target interactions and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, quantitative readouts for proliferation and reporter assays supporting assay readiness.
- Analytics: Generates reproducible IC50 and luciferase activity data for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant cellular outcomes, informing biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to diverse miRNAs, targets, and tumor cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in miRNA target validation.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of miRNA-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and quantitative PCR techniques.
- Demands access to cell culture, fluorescence/luminescence plate readers, and real-time PCR instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various tumor cell lines and miRNA targets with appropriate controls and validation steps.
- Dependent on rigorous statistical analysis and replication to ensure data reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
MicroRNA (miRNA) Mimic Transfection
2:03
Sulforhodamine B (SRB) Assay
3:20
Generation of a Dose-response Curve
4:35
Verification of the Direct Target Gene of a miRNA of Interest
6:37
Luciferase Assay
7:52
Results: miRNA-107 Negatively Regulates Proliferation of PANC-1 Cells
8:53
Conclusion
