Name: 用于评估肿瘤细胞中的微RNA水平、功能和相关靶基因的体外协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用SRB细胞增殖实验、实时PCR和荧光素酶报告基因实验来识别和验证肿瘤细胞中的微RNA靶基因。该方案通过miRNA模拟物转染和剂量反应曲线分析，帮助研究人员评估微RNA功能及其在癌症治疗中的潜在应用。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部门资助的基础科学研究中心项目（2017R1D1A3B03035662）以及2017年汉阳大学研究基金（HRF-201703-003）支持。

1. 成熟微小RNA（miRNA）表达分析
<ol>
	<li>成熟 miRNA 互补 DNA (cDNA) 的合成
	<ol>
		<li>取 254 ng 总 RNA 和 4.5 µL 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) 混合液，然后加入超纯水至 PCR 条形管中，总体积为 18 µL（图 2A）。根据反应总数，使用足量的 DNase I 混合液，为从多个细胞系中提取的每种总 RNA 样品准备反应体系。 
		注意： DNase I 混合液由 DNase I (1.8 µL)、核糖核酸酶抑制剂 (0.3 µL) 和 25 mM MgCl2 (2.4 µL) 组成。为可重复地获取总 RNA，采用基于柱的提取方法，而非酚-氯仿提取方法。已有报道指出，当使用酚-氯仿提取方法时，某些 miRNA 的提取得率可能因细胞数量不同而有所变化11,12。</li>
		<li>将管子置于热循环仪中孵育。在 37 °C 下孵育 10 分钟，然后在 90 °C 下孵育 5 分钟以热失活 DNase I。孵育后立即将管子置于冰上。</li>
		<li>将 7.1 µL 经 DNase I 处理的总 RNA 转移至两组新管中，然后每管加入 1.5 µL 针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 基因的反义引物（图 2B）。 
		注意： 此步骤中用于 cDNA 合成的总 RNA 量为 100 ng。GAPDH 反义引物的储存浓度为 10 µM。加入 GAPDH 反义引物的目的是通过基因特异性引物法生成 GAPDH cDNA。</li>
		<li>使用热循环仪孵育管子。先在 80 °C 下孵育 5 分钟，然后在 60 °C 下反应 5 分钟。孵育后立即置于冰上。</li>
		<li>在每个反应体系中加入 3.4 µL 逆转录 (RT) 酶混合液（图 2B）。RT 酶混合液由 100 mM 脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs) (0.15 µL)、10× RT 缓冲液 (1.5 µL)、核糖核酸酶抑制剂 (0.75 µL) 和逆转录酶 (1 µL) 组成。根据反应总数准备足量的混合液。</li>
		<li>在每个反应体系中加入 3 µL 针对特定 miRNA 的 5× RT 引物（图 2B）。 
		注意： 每个反应体系的总体积为 15 µL。</li>
		<li>使用热循环仪运行程序：先在 16 °C 下反应 30 分钟，然后在 42 °C 下反应 30 分钟，最后在 85 °C 下反应 5 分钟。剩余时间保持在 4 °C（图 2B）。此步骤在同一管中生成特定 miRNA 和 GAPDH 基因的单链 cDNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时聚合酶链式反应 (PCR) 及数据分析
	<ol>
		<li>用超纯水将每种 cDNA 按 1:49 的比例稀释。</li>
		<li>为特定 miRNA 和 GAPDH 准备反应混合液（表 1）。为检测特定 miRNA 和 GAPDH，每种 cDNA 样品设置三个重复反应。</li>
		<li>进行实时 PCR 并分析数据（图 2C）。使用比较 CT 法分析数据13,14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. microRNA (miRNA) 模拟物转染
注意： 从步骤1中选择miRNA-107。由于与正常细胞相比，miRNA-107在肿瘤细胞中呈下调表达，因此可推测miRNA-107是一种具有抑瘤作用的miRNA。若某miRNA在肿瘤细胞中相较于正常细胞呈上调表达（例如.，miRNA-301），可将针对 miRNA-301 的反义寡核苷酸用于步骤 2、3 和 4。
<ol>
	<li>使用细胞计数器对细胞进行计数，并将细胞接种于96孔板中。每孔细胞密度为 2 × 103 个细胞/100 µL。不要使用含有青霉素-链霉素（P/S）的细胞培养基，因为P/S会降低转染效率。</li>
	<li>配制一系列转染混合物，用于次日以不同终浓度的miRNA对照mimic和miRNA-107 mimic转染细胞（图3）。
	<ol>
		<li>从miRNA对照mimic或miRNA-107 mimic的储存液（25 μM）中，按相应比例稀释并加入适量的对照mimic或miRNA-107 mimic至低血清培养基中，同时加入转染试剂，使用微量离心管进行操作（图3A）。用移液器轻轻混匀含有寡核苷酸的混合物。每个孔中寡核苷酸的总量（miRNA mimic对照 + miRNA-107 mimic）应保持一致。空白孔包含100 µL细胞培养基以及含转染试剂但不含细胞的低血清培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细胞培养罩中孵育10分钟后，再次轻轻混匀含寡核苷酸的混合物，然后向每孔中加入50 μL混合液。将转染后的细胞置于细胞培养箱中继续培养。在孵育6–12小时后，更换为含胎牛血清（FBS）和P/S的新鲜细胞培养基。继续培养细胞72小时。miRNA mimic的总处理时间为96小时。</li>
</ol>
3. 磺酰罗丹明B（SRB）检测
<ol>
	<li>细胞固定
	<ol>
		<li>移除平板各孔中的细胞培养基，并立即向每孔中加入 100 μL 的 10% 三氯乙酸（TCA）。小心吸取各孔中的细胞培养基，避免对细胞造成损伤或从孔底脱落。 
		注意：通过将 20 g TCA 粉末加入 50 mL 蒸馏水中配制 40% TCA 溶液。再将 40% TCA 按 1:3 的稀释比例用蒸馏水稀释，制备 10% TCA 溶液。</li>
		<li>将含有 10% TCA 的平板置于冰箱（4 °C）中固定 1 小时。</li>
		<li>将平板浸入水槽中反复清洗数次，并将其倒置轻拍，去除孔内多余水分，直至孔内无残留水滴。将平板放置于实验台上晾干，再进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞染色
	<ol>
		<li>用移液器向包括空白孔在内的每个孔中加入 50 μL 的 0.4% 考马斯亮蓝（SRB）溶液。轻轻振荡平板，使 0.4% SRB 溶液均匀覆盖孔底。 
		注意：通过将 0.4 g SRB 粉末溶于 100 mL 的 1% 乙酸溶液中，配制并使用 0.4% SRB 溶液。小心振荡使其充分溶解。用铝箔等避光材料包裹 0.4% SRB 溶液瓶，并将其储存于冰箱中。</li>
		<li>染色孵育 40 至 60 分钟后，用 1% 乙酸溶液冲洗平板，洗去未结合的染料，直至染料完全洗净（图 3B）。</li>
		<li>将平板放置于实验台上晾干，再进行下一步操作。 
		注意：在进入步骤 3.3 之前，平板必须完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸光度测定
	<ol>
		<li>向包括空白孔在内的各孔中加入 100 μL 的 Tris 碱溶液（10 mM）。将平板置于摇床上振荡 10 分钟。在 492 nm 波长下测定吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 剂量-反应曲线的生成
<ol>
	<li>在电子表格中分析SRB实验数据。从每组的吸光度值中减去空白对照的吸光度，计算每组吸光度值的平均值（AVE）和标准差（STD）。</li>
	<li>使用SRB实验的吸光度值计算每组的平均吸光度百分比（AVE%）和标准差百分比（STD%）。 
	注意： miRNA对照mimic处理组的AVE%为100%。使用以下公式计算STD%：STD% =（各组的STD / 对照mimic处理组的AVE吸光度）× 100。</li>
	<li>将处理浓度、AVE% 和 STD% 等原始数据垂直对齐后导入软件。由于 Log 0 无定义，将 X 轴的第一个浓度设置为接近 0 的值（例如., 0.01).</li>
	<li>点击 创建图表 标签并选择 简单散点-误差棒图. 选择 工作表列 作为符号值并点击 下一步在数据格式面板中，选择 XY 配对 并点击 下一步在“选择数据”面板中选择相应的数据列。单击 完成 单击按钮以生成图表。 
	注意： 横轴表示浓度，纵轴表示各浓度的平均吸光度百分比（AVE%），误差线表示各浓度的标准偏差百分比（STD%）。</li>
	<li>双击 X 轴以修改坐标轴的刻度类型和比例。将刻度类型从线性更改为对数。将起始和结束范围值分别修改为 0.01 和 200。</li>
	<li>右键单击任意散点图，选择“曲线拟合”，进入“自定义”子类别。选择“剂量-反应曲线”，点击“下一步”按钮，然后点击“完成”按钮。此时将生成剂量-反应曲线，并同时创建一个报告标签页图4A).
	<ol>
		<li>在软件中输入公式1以生成剂量-反应曲线，请点击 分析 标签并选择 回归向导. 前往 用户自定义 在公式类别中，然后单击 新 按钮。将公式1、变量、初始参数和约束条件输入对应的空白框中（图4B，C）。点击 添加为 按钮，并将方程的名称设置为 剂量-反应曲线方程名称现在将在子类别中生成 用户自定义 在方程类别中。 f 表示公式1中的细胞活力百分比（% cell viability）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
公式 1 
<img alt="静态平衡方程上下文中的数学公式 f=(y0-R)(1-(x^n/(k^n+x^n)))+R。" src="/files/ftp_upload/59628/59628eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1">
<ol start="7">
	<li>转到报告选项卡，然后检查 n、k 和 R 值。 
	注意： y0 表示经 miRNA 对照模拟物处理组的细胞存活率为 100%，n 表示 Hill 型系数（曲线斜率），k 表示产生 miRNA-107 模拟物最大效应 50% 时的浓度（半数最大抑制浓度，IC50），R 表示未受影响的残余部分（即耐受部分）15用于生成剂量-反应曲线的方程将 y0 到 R 值（若有）的范围视为 100%图 4A）。因此，有必要获得经校正的 k（IC50) 基于从 y0 到零值范围计算得出的值（图 4A). 调整后的 k（IC50）以及其他 ICx 值（例如., IC10 通过 IC90) 可通过公式2获得，该公式由公式1推导而来。公式2从公式1的推导过程见于 补充图1.</li>
</ol>
公式 2 
<img alt="静力平衡方程，x=k*(sqrt((y0-f)/(f-R)))&lt;sup&gt;n&lt;/sup&gt;；公式示意图。" src="/files/ftp_upload/59628/59628eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2">
<ol start="8">
	<li>双击应用了公式2的单元格。利用公式2以及生成的剂量-反应曲线中的参数，可计算出从IC10到IC90范围内ICx的校正值（图4D）。</li>
	<li>在单元格中输入等号，后接以括号开始的公式。输入公式时，通过在相应列和行前添加美元符号，将n、k和R的值设为绝对引用，以确保向下自动填充公式时这些固定值不会改变（图4D）。或者，也可手动使用公式2计算校正值。 
	注意：由于R值大于10，因此无法确定IC90值。此外，若R值超过20，则IC80值也无法确定（图4D）。</li>
</ol>
5. 验证目标 microRNA 的直接靶基因
注意：在完成SRB等功能实验后，可确认miRNA-107是一种具有肿瘤抑制功能的miRNA，且其很可能直接靶向癌基因。使用TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_71/）等miRNA靶基因预测程序查看所有预测靶基因的列表，然后结合PubMed和GeneCards等数据库中基因功能的信息，进一步缩小潜在候选靶基因的范围。
<ol>
	<li>3'非翻译区（UTR）克隆引物设计
	<ol>
		<li>在 GeneCards（https://www.genecards.org/）中输入基因名称并点击 符号 基因。通过点击访问 Ensembl 基因组浏览器 Ensembl ID 一个基因，然后单击 转录本 ID 在转录本表格中。之后，单击 外显子 存在于 基于转录本的展示 左侧列表。</li>
		<li>将3’非翻译区（3’ UTR）的核苷酸序列复制并粘贴至引物设计程序中。再次从此程序中复制该序列，并将其粘贴至文字处理软件中。检查是否存在miRNA结合序列，以及是否存在用于克隆的限制性内切酶位点。 
		注意： 如果3’非翻译区（3’ UTR）内不存在限制性内切酶识别位点，则可使用克隆所选的限制性内切酶进行下一步操作。</li>
		<li>在引物设计程序中，接受 3’ UTR 序列，并按照以下条件开始设计上游和下游引物：长度：20-30 个核苷酸，Tm：45-58 °C，GC含量：40-60%。两个引物的Tm值差异应小于 5 °C本研究中使用的引物序列见于 补充图2在设计的引物中加入限制性内切酶识别序列以及4个随机核苷酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>梯度PCR
	<ol>
		<li>制备 25 µL PCR反应混合物，包含针对单一退火温度设计的引物表2）。根据反应总数准备足量的混合液。用移液枪吹打混匀溶液后加入 25 µL 将反应混合物加入各试管中。短暂离心数秒。</li>
		<li>进行35-40个PCR循环，从变性步骤到延伸步骤。PCR循环设置如下步骤： 98 °C 1 分钟（1 个循环，聚合酶激活步骤）， 95 °C 10 秒（变性步骤） 45 °C-68 °C 30 秒（退火步骤） 68 °C （延伸步骤，每1000 bp 10秒至1分钟） 68 °C 3分钟（终止步骤），最后冷却至 4 °C.</li>
		<li>运行PCR产物，并在1%琼脂糖凝胶上使用DNA ladders检测条带。确定最佳退火温度（图5A）。使用下一步的最佳退火温度再次扩增某基因的3’非翻译区。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双酶切
	<ol>
		<li>在离心管中配制反应混合物，包含两种限制性内切酶 XhoI（或 AsiSI）和 NotI（表3）。将混合物在水浴中孵育3-4小时（37 °C).</li>
		<li>将双酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，然后在紫外光下切下条带。对于荧光素酶载体，在凝胶电泳前，需将双酶切后的载体与10 U碱性磷酸酶在37 °C反应1小时，以防止连接步骤中发生自连环化。</li>
		<li>从切下的条带中纯化双酶切的PCR产物和荧光素酶载体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR产物连接至荧光素酶载体
	<ol>
		<li>制作 20 μL 连接反应混合物，包括DNA连接酶（表4). 
		注意： PCR产物（插入片段）与荧光素酶载体的摩尔比可为3:1、1:1或2:1。</li>
		<li>短暂离心试管10-15秒，然后孵育于 16 °C 使用热循环仪过夜反应。 
		注意： 或者，可将试管置于 4 °C 连接持续 2-3 天。在此步骤中，PCR 插入片段将被克隆至海肾荧光素酶报告基因下游的区域图5B）。miRNA 与基因克隆的 3’ 非翻译区（UTR）结合可降低海肾荧光素酶活性。荧光素酶（Firefly luciferase）用于海肾表达水平的归一化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化与菌落 PCR
	<ol>
		<li>加入连接反应混合物（3-5 μL) 加入含有感受态细胞的离心管中。轻轻敲击管壁，置于冰上静置（20 分钟）。 
		注意：在加入连接反应混合物之前，需先将感受态细胞在冰上解冻。</li>
		<li>迅速而轻柔地将试管转移至加热块中。进行热激处理（42 °C （持续30秒至1分钟），将离心管置于冰上20分钟。</li>
		<li>在Luria-Bertani（LB）琼脂平板上涂布感受态细胞。将感受态细胞置于培养箱中培养。37 °C过夜。 
		注意： 氨苄青霉素（50-100 µg/mL) 存在于琼脂平板中。</li>
		<li>挑取单个菌落并重悬 E. coli 在含有超纯水的8联管中的一管内重悬。重复此步骤以完成重悬 E. coli 从随机选择的4-8个菌落中（图5C).</li>
		<li>转移 25 μL 的 E. coli 将悬液转移至另一组8联管中。此时共有两组试管 E. coli 悬浮液 
		注意： 一个试管用于菌落PCR，另一个用于接种。 E. coli 用于接种的悬液可暂时保存于 4 °C (图5C).</li>
		<li>使用菌落PCR E. coli 悬浮液。此步骤用于确定菌落是否含有插入片段。挑选最佳菌落进行接种，并分离携带某基因 3’ 非翻译区的荧光素酶载体。图 5C). 
		注意： 对所选基因的每个3’ UTR重复步骤5.1–5.5。按照所示PCR反应条件进行 表2 通过替换基因组DNA E. coli 悬浮液</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光素酶检测
	<ol>
		<li>准备一个24孔板。使用1-2 × 104 细胞在 500 μL 每孔细胞培养基. 不要使用含有青霉素/链霉素（P/S）的细胞培养基进行转染，因为使用P/S会降低转染效率。</li>
		<li>使用转染试剂，将50 ng荧光素酶载体与对照mimic或特异性miRNA mimic共同转染入细胞中图5D）。若需在多个浓度下筛选特定miRNA模拟物（miRNA mimic）的效果，应保持每孔中寡核苷酸的总量相同（见步骤2）。</li>
		<li>次日使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗孔内壁两次。</li>
		<li>应用 200 μL 向孔中加入裂解试剂，并在测定荧光素酶活性前充分完成细胞裂解。 
		注意： 将培养板置于摇床上至少15分钟。</li>
		<li>转移 5-10 μL 将细胞裂解液转移至新离心管中，并加入 100 μL 立即用移液器混匀溶液，并使用化学发光仪检测萤火虫荧光素酶活性。 
		注意： 读取萤光素酶活性持续10-15秒。</li>
		<li>添加 100 μL 在同一管中加入试剂II，然后用移液器吹打混匀两次。使用发光仪读取海肾荧光素酶活性10-15秒。对每个样品重复步骤5.6.5和5.6.6。</li>
		<li>计算海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶的比值（图5E). 
		注意： 萤火虫荧光素酶的活性代表了荧光素酶表达载体转染细胞的效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
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<li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

确定具有特定miRNA功能的真实靶基因的策略对于理解miRNA的多种作用至关重要。鉴定miRNA的靶基因有助于解读miRNA在细胞内调控的细胞信号事件。揭示miRNA功能上重要的靶基因可为开发基于miRNA的癌症治疗方案提供基础性知识。
多种方法可用于检测细胞系和组织中分离的总RNA的miRNA表达水平，例如微阵列、小RNA文库测序、深度测序、逆转录酶原位PCR以及Northern印迹法24,25,26。对miRNA进行高通量表达谱分析，有助于深入理解癌症发生背后的遗传机制。基于探针的miRNA检测方法常用于验证表达谱数据，也适用于对少数感兴趣的miRNA进行筛选。然而，利用基于探针的实时PCR检测成熟miRNA水平时，其应用受限于无法判断成熟miRNA的调控是发生在转录阶段，还是通过成熟过程的调控实现的。基于染料的实时PCR和Northern印迹法已被用于检测miRNA前体的水平<sup cla...

microRNA（miRNA）是一类小型调控性RNA，主要通过与靶基因的3’非翻译区（3’ UTR）相互作用，调节信使RNA（mRNA）的翻译过程及其降解1。miRNA的表达可受到转录水平和转录后水平机制的调控。此类调控机制的失衡会导致多种疾病（包括癌症）中miRNA表达水平的异常和特异性改变2。单个miRNA可与多种不同的mRNA发生相互作用，相应地，单个mRNA也可受到多种miRNA的共同调控。因此，细胞内信号网络受到特异性表达的miRNA的复杂影响，从而可能引发并加剧生理紊乱和疾病进程2,3,4,5,6。尽管已在多种癌症中观察到miRNA表达的改变，但调控癌细胞行为并与miRNA相互关联的分子机制在很大程度上仍不清楚。
越来越多的证据表明，miRNA 的致癌或抑瘤作用取决于癌症的类型。例如，miR-155 通过靶向叉头框 O3（FOXO3）促进结直肠癌的细胞增殖、转移和化疗耐药性7,8。相反，miR-107 通过调控神经源性位点 Notch 同源蛋白 2（NOTCH2）的表达，抑制胶质瘤细胞的侵袭9。评估 miRNA 与其靶标之间的相互作用，对于深入理解 miRNA 在健康和疾病状态下调控各种生物学过程的机制至关重要10。此外，发现 miRNA 的真实靶标可为进一步开发基于 miRNA 的癌症治疗策略（联合多种抗癌药物）提供精细调控的手段。然而，miRNA 研究领域的主要挑战在于识别 miRNA 的直接靶标。本文提供了可重复的实验方法，用于确定 miRNA 的靶基因。成功的 miRNA 靶标鉴定实验设计包含多个步骤和考量因素（图 1）。比较肿瘤细胞与正常细胞中成熟 miRNA 的表达水平，是筛选目标 miRNA 的常用方法之一（图 1A）。对选定的 miRNA 进行功能研究，检测其对细胞增殖的影响，有助于缩小目标 miRNA 潜在候选靶基因的范围（图 1B）。基于 miRNA 已验证的生物学功能，需结合文献和数据库的系统性综述以及 miRNA 靶标预测程序，以获取与基因功能最相关的信息（图 1C）。通过实施荧光素酶报告基因实验（结合基因 3’ 非翻译区（UTR）的克隆）、实时定量 PCR 和蛋白质印迹（Western blotting）等实验，可鉴定目标 miRNA 的真实靶基因（图 1D）。本实验方案的目标是提供一系列关键实验的详细方法，包括探针法实时聚合酶链式反应（PCR）、转染 miRNA 模拟物后的磺酰罗丹明 B（SRB）检测、剂量-反应曲线的绘制，以及结合基因 3’ UTR 克隆的荧光素酶报告基因实验。本方案有助于更深入理解单个 miRNA 的功能及其在癌症治疗中的潜在应用。

<table><tbody><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA 上样染料</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>RD006</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>8 孔联排管盖</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010535</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>8 孔联排管</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010580</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>A6283-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>琼脂糖 A</td><td>Bio Basic</td><td>D0012</td><td>500 g</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Bio basic Canada Inc</td><td>AB0028</td><td>25 g</td></tr><tr><td>AriaMx 96 孔联排管</td><td>Agilent Technologies</td><td>401493</td><td>用于实时 PCR</td></tr><tr><td>AriaMx 实时 PCR 系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>G8830A</td><td>qPCR 扩增、检测和数据分析</td></tr><tr><td>AsiSI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0630</td><td>10,000 单位/mL</td></tr><tr><td>CAPAN-1 细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-79</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养罩</td><td>Labtech</td><td></td><td>型号：LCB-1203B-A2</td></tr><tr><td>带 V 型槽的计数室</td><td>Paul Marienfeld</td><td>650010</td><td>细胞计数器</td></tr><tr><td>CutSmart 缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>10X 浓度</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DNA 凝胶回收试剂盒</td><td>Bionics</td><td>DN30200</td><td>200 次制备</td></tr><tr><td>DNA Marker</td><td>NIPPON Genetics EUROPE</td><td>MWD1</td><td>1 Kb DNA Marker</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>100 单位</td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测系统</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>100 次检测</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HIT 感受态细胞</td><td>Real Biotech Corporation(RBC)</td><td>RH617</td><td>感受态细胞</td></tr><tr><td>HPNE 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-4023</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂培养基</td><td>Bio Basic</td><td>SD7003</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>0.75 mL</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td>0.75 mL</td></tr><tr><td>荧光检测仪</td><td>Promega</td><td></td><td>型号：E5311</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>TECAN</td><td></td><td>Infinite F50</td></tr><tr><td>miRNA 阴性对照模拟物</td><td>Ambion</td><td>4464058</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>miRNA-107 模拟物</td><td>Ambion</td><td>4464066</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>50 次制备</td></tr><tr><td>Mupid-2plus（电泳系统）</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>型号：AD110</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td>20,000 单位/mL</td></tr><tr><td>Oligo explorer 程序</td><td>GeneLink</td><td></td><td>用于引物设计</td></tr><tr><td>光学管条盖（8 孔联排）</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td>用于实时 PCR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>PANC-1 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14040117</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>质粒 DNA 小量提取 S&amp;V 试剂盒</td><td>Bionics</td><td>DN10200</td><td>200 次制备</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶</td><td>TaKaRa</td><td>R050A</td><td>250 单位</td></tr><tr><td>摇床</td><td>TECAN</td><td></td><td>振荡平台</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Labtech</td><td></td><td>型号：LSI-3016A</td></tr><tr><td>Sigmaplot 14 软件</td><td>Systat Software Inc</td><td></td><td>用于剂量-反应曲线生成</td></tr><tr><td>磺基罗丹明 B 粉末</td><td>Sigma</td><td>S1402-5G</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SYBR Green 预混液</td><td>Smobio</td><td>TQ12001805401-3</td><td>双链 DNA 结合荧光染料</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td>25,000 U</td></tr><tr><td>TaqMan 预混液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>200 次反应，不含 AmpErase UNG</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-107）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>检测编号：000443（50 次 RT，150 次 PCR 反应）</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-301）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>检测编号：000528（50 次 RT，150 次 PCR 反应）</td></tr><tr><td>TaqMan miR RT 试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>1,000 次反应</td></tr><tr><td>Thermo CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱（BB15）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>37 &amp;deg;C 和 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养</td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma</td><td>T4661-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Veriti 96 孔梯度 PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>用于 DNA（或 cDNA）扩增</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>20,000 单位/mL</td></tr></tbody></table>

一种体外评估肿瘤细胞中microrna水平、功能及相关靶基因的实验方案

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

微小RNA（miRNA）是一类小分子调控性RNA，已被证实可在多种疾病（包括癌症）中调节众多细胞内信号通路。这些小分子调控性RNA主要与其靶标信使RNA（mRNA）的3’非翻译区（3’ UTR）相互作用，最终导致mRNA翻译过程受抑以及靶标mRNA降解增强。根据其表达水平和细胞内功能，miRNA可作为癌基因或抑癌基因mRNA的调控因子。在数百甚至数千个通过计算预测出的潜在靶基因中，鉴定出某个miRNA的真实靶基因，是阐明该miRNA功能及其基本分子机制的关键步骤。目前已有多种miRNA靶基因预测程序可用于搜索可能的miRNA-mRNA相互作用。然而，最具挑战性的问题是如何验证某个miRNA的直接靶基因。本实验方案描述了一套可重复的关键方法策略，用于鉴定与miRNA功能相关的靶基因。本方案提供了一个实用的操作指南，逐步介绍如何利用基于探针的实时聚合酶链式反应（PCR）、转染miRNA模拟物后的磺酰罗丹明B（SRB）检测、剂量-反应曲线绘制、荧光素酶报告基因检测，以及目的基因3’ UTR的克隆等技术，揭示miRNA的表达水平、功能及其相关靶mRNA，从而全面理解特定miRNA的生物学作用。

成功且准确地验证miRNA水平对于数据解读至关重要，这使得能够根据miRNA在疾病发生和发展中预期发挥的作用对其进行分类。采用基于探针的定量PCR法，在三种胰腺细胞系中检测了miRNA-107和miRNA-301的表达水平。在同一反应中同步合成特定miRNA和参考基因的cDNA，可提高数据的可重复性。PANC-1和CAPAN-1为人源胰腺导管腺癌细胞系，而HPNE是通过携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的逆转录病毒表达载体转导而获得的永生化胰腺导管细胞系。与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞中miRNA-107显著降低（图2C）。与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞中miRNA-301的表达水平显著上调。这些结果与先前报道一致：miRNA-107在胰腺癌细胞中存在表观遗传学失活，而miRNA-301在胰腺导管腺癌细胞中的表达水平高于正常胰腺导管细胞16,17。
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-...

本实验方案采用基于探针的实时聚合酶链式反应（PCR）、磺酰罗丹明B（SRB）检测、3’非翻译区（3’ UTR）克隆以及荧光素酶检测，以验证特定miRNA的靶基因并研究miRNA的功能。

一种体外评估肿瘤细胞中microRNA水平、功能及相关靶基因的实验方案

微小RNA（miRNAs）是一类小分子调控RNA，已被证实可在多种疾病（包括……）中调节众多细胞内信号通路

获取神经微小RNA（microRNA）与其靶基因之间的相互作用对于理解microRNA在健康和疾病状态下调控各种生物学过程的功能至关重要。本实验方案描述了一种可重复的策略，用于鉴定microRNA的靶基因，并对microRNA的功能进行验证，因为直接验证microRNA靶点具有挑战性。本方案可为单个microRNA的功能及其在癌症治疗中的意义提供深入见解。半数抑制浓度的计算不仅对于microRNA研究，而且对于其他抗癌药物的有效性评价都是一种重要的方法。我们的实验方案将有助于新研究人员，因为我们描述了理解细胞中microRNA水平的基本方法。开始实验时，使用细胞计数器对细胞进行计数。将细胞接种于96孔板中。次日，配制一系列转染混合物，用于以不同终浓度的microRNA对照mimic和microRNA-107 mimic转染细胞。从25微摩尔的microRNA对照mimic或microRNA-107 mimic储备液中，用微量离心管将对照mimic或microRNA-107 mimic稀释后加入含减血清培养基中，并与转染试剂一同加入。使用微量移液器轻轻混匀含有寡核苷酸的混合物。在细胞培养操作台中孵育10分钟后，再次轻轻混匀含有寡核苷酸的混合物，然后将50 µL混合物加入每个孔中。将转染后的细胞置于细胞培养孵育箱中继续培养。小心吸去培养板各孔中的细胞培养液，立即向每孔加入100微升10%三氯乙酸（TCA）。将含有10% TCA的培养板置于4摄氏度环境中静置一小时。随后，通过将培养板浸入盛有自来水的容器中，反复清洗数次。轻敲培养板以去除孔内多余的水分，直至无可见水滴残留，并将培养板干燥。向每个孔（包括空白孔）中加入50 µL的0.4% SRB溶液。轻轻振荡培养板，直至0.4% SRB溶液均匀覆盖各孔底部。然后，将培养板孵育40至60分钟。孵育结束后，用1%乙酸洗涤培养板，直至未结合的染料完全洗去。向各孔（包括空白孔）中加入100微升10毫摩尔的Tris碱溶液。将培养板置于摇床上孵育10分钟。在492纳米波长下测定吸光度。利用SRB实验的吸光度值，计算每组平均吸光度的百分比及其标准差。将原始数据（包括处理浓度、平均吸光度和标准偏差）导入软件，并垂直对齐数据。单击“创建图表”选项卡，选择“简单散点误差线图”。将工作表列选为符号值，然后单击下一步。在“数据格式”面板中，选择 X-Y 数据对，然后单击“下一步”。在“选择数据”面板中，选择相应的数据列。单击“完成”以创建图表。双击 X 轴以修改坐标轴缩放的刻度类型。将刻度类型从线性更改为对数。将起始和结束范围值分别修改为 0.01 和 200。右键单击任意散点图，选择“曲线拟合”，进入“用户自定义”子类别。选择剂量反应曲线，点击后续按钮，然后点击完成。转到报告选项卡，然后检查 n、k 和 R 值。按照随附的文字实验方案运行 PCR。随后将反应混合物合并于同一管中，加入限制性内切酶 Exo1 和 Not1，进行双酶切消化。将混合物在37摄氏度水浴中孵育三至四小时。将双酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。然后在紫外光下切下条带。从切下的条带中纯化双酶切的PCR产物和荧光素酶载体。通过配制含有DNA连接酶的20微升连接反应体系，将PCR产物连接至荧光素酶载体中。将离心管短暂离心10至15秒。使用PCR仪在16摄氏度下过夜孵育连接反应。第二天，将连接产物加入含有感受态细胞的离心管中进行转化。轻轻敲击离心管，置于冰上静置20分钟。将离心管迅速而轻柔地转移至42摄氏度的加热块中，孵育30秒至1分钟。热激后，将离心管置于冰上20分钟。将感受态细胞涂布于LB琼脂平板上。将感受态细胞在37摄氏度的培养箱中过夜培养。次日，挑取单个菌落，将大肠杆菌重悬于含有超纯水的8联管中，并重复此步骤，从4至8个随机选择的菌落中分别重悬大肠杆菌。将25微升大肠杆菌悬液转移至另一组8联管中。使用大肠杆菌悬液进行菌落PCR。在24孔板中准备荧光素酶检测。每孔加入一至两倍十的四次方个细胞，置于500微升细胞培养基中。在过夜孵育后，使用转染试剂将50纳克荧光素酶载体与对照mimic或特异性microRNA mimic共同转染入细胞中。次日，用磷酸盐缓冲液洗涤孔内物质两次。每孔加入200微升裂解试剂，在检测荧光素酶活性前充分完成细胞裂解。持续震荡培养板至少15分钟。取5至10微升细胞裂解液转移至新离心管中，加入100微升试剂一，并立即用移液器吹打混匀。随后使用发光仪检测萤火虫荧光素酶活性，读数时间为10至15秒。在同一管中加入100微升试剂二，然后用移液器吹打混匀两次。最后，使用发光仪读取海肾荧光素酶活性10至15秒。RT-PCR显示，在PANC-1和CAPAN-1细胞中，与HPNE细胞相比，miR-107显著减少。与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞中miR-301的表达水平显著上调。本研究中的SRB实验明确表明，在转染miR-107模拟物后，PANC-1细胞的增殖能力下降。对miR-107的11个潜在靶基因的筛选结果显示，只有突触核蛋白γ（synuclein gamma，SNCG）——一种肿瘤细胞生长的正向调控因子——能与miR-107直接相互作用，并在PANC-1细胞中发挥作用，表明miR-107可通过调控SNCG的表达，负向调节PANC-1细胞的增殖。使用四氢化碳基物质和CFSE的成年细胞增殖实验可用于筛选microRNA模拟物等分子的作用效果，具体应用取决于细胞类型。根据microRNA的实验验证功能，在进行荧光素酶报告基因实验之前，需系统性地查阅数据库并利用靶点预测程序，以缩小候选靶基因的范围。在评估microRNA与抗癌药物联用效率时，采用本方案计算组合指数，进而获得经调整的IC值，具有显著优势。

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遗传学

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