微粒相关α synuclein 聚合体对原代神经元的外源性管理--纤维形成的强大细胞模型
June 26th, 2018
本协议的目标是提供一个基于细胞的系统,在体内复制α synuclein 聚合体的形成。细胞内阿尔法-synuclein 包裹体的种子在原代神经元的内化和传播的外源管理的原生微粒相关的阿尔法-synuclein 集分离的病阿尔法 synuclein 转基因小鼠。
该方法可以帮助回答 α-突触核蛋白领域的关键问题，例如阐明 α-突触核蛋白在体内的聚集扩散机制和毒性。该技术的主要优点是它不需要耗时地纯化 α-突触核蛋白预制原纤维。演示该程序的是 COLA 实验室的研究生 Lucia Rota。
要开始该过程，请准备均质缓冲液并将其保存在冰上。接下来，使用 Teflon 杵匀浆器以 10 至 15 次冲程，在 1 到 10 体积的冰冷匀浆缓冲液中对新鲜或冷冻组织进行匀浆。然后，将所有初始匀浆转移到微量离心管中，并在 4 摄氏度下以 1， 000 倍 G 离心 10 分钟，以去除所得沉淀中的细胞核和未破碎的细胞。
随后，丢弃结果沉淀。接下来，将上清液转移到干净的微量离心管中，并使用冷冻离心机在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心 20 分钟，以获得第二个上清液和沉淀。然后将该上清液转移至聚碳酸酯瓶中，使用超速离心机和固定角转子在 4 摄氏度下以 100， 000 倍 G 离心 1 小时。
用 500 微升均质缓冲液重悬 P100 粗沉淀。将 P100 粗沉淀转移到干净的微量离心管中，并在冷冻离心机中以 10， 000 倍 G 的速度在 4 摄氏度下离心 20 分钟。20 分钟后，弃去上清液，用 100 μL 匀浆缓冲液重悬 P100。
然后，在冰上对样品进行超声处理 2 秒钟，并将其储存在零下 80 摄氏度。要进行 Western Blot，请在垂直电泳仪上灌注梯度 4 至 20% tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶。将一微克微粒体相关的 α-突触核蛋白组分溶解在变性样品缓冲液中，并将其加载到凝胶上。
在另一个孔中，加载 5 μL 蛋白质标准标记物。在 tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液中以 100 伏电压电泳凝胶，直到蛋白质标志物到达凝胶末端。然后，使用碱性碳酸盐缓冲液将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
将样品在冷藏室中过夜，恒定功率设置为 200 毫安。第二天，在轨道摇床上用含 5% 脱脂奶粉的 PBS-T 在室温下封闭膜 30 分钟。然后，用 PBS-T 短暂冲洗膜。
将膜与 SIN-1 的 1 比 5， 000 或 P-Ser129 α-突触核蛋白抗体在 2.5% 脱脂奶粉的 PBS-T 中孵育过夜，在冷藏室或冰箱中，在 4 摄氏度的轨道摇床上孵育过夜。第二天，在室温下用 PBS-T 在定轨摇床上洗涤膜 10 分钟。将膜与抗小鼠或抗兔 HRP 偶联的二抗在 2.5% 脱脂奶粉中的 PBS-T 溶液中，在室温下在定轨摇床上孵育 1 小时。
然后，在室温下用 PBS-T 在轨道摇床上洗涤膜 10 分钟，每次 3 次。通过常规化学发光试剂盒获取信号。为了处理神经元，拉动从三种不同患病转基因小鼠的脊髓中获得的微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体，以获得用原始匀浆缓冲液稀释的每微升 1 微克溶液。
接下来，去除三分之一的培养基，并用新鲜的神经元培养基轻轻更换。向细胞培养基中加入 1 微克混合的微粒体相关 α-s 聚集体。将神经元放回 37 摄氏度的培养箱中。
向样品中加入 1/3 的新鲜培养基，不更换培养基，每 3 天一次，持续一周。处理一周后，去除三分之一的培养基，并用含有 2%B27、10 微克/毫升庆大霉素和 2 毫摩尔谷氨酰胺的新鲜培养基轻轻更换。在固定细胞之前，每三天重复一次，持续一周。
为了进行免疫荧光，在化学通风橱中，用 2% 多聚甲醛和 PBS 在 5% 蔗糖溶液中在室温下固定神经元 15 分钟，不要摇晃。15 分钟后，取出固定液，用 PBS 短暂洗涤神经元 3 次。接下来，在室温下用 0.3% 非离子表面活性素的 PBS 溶液透化神经元 5 分钟。
然后，用 PBS 短暂洗涤神经元 3 次。在轨道摇床上，在室温下将神经元与 3% FBS 和 PBS 孵育 30 分钟，以阻断非特异性结合位点。之后，将神经元与溶解在 3% FBS 和 PBS 中的适当一抗在冷藏室或冰箱中，在 4 摄氏度的轨道振荡器上孵育过夜。
第二天，去除抗体溶液，用 PBS 短暂洗涤细胞 3 次。然后，将神经元与溶于 3% FBS 和 PBS 的适当荧光二抗在室温下在轨道振荡器上避光孵育 1 小时。取出抗体溶液，用 PBS 短暂洗涤 3 次。
接下来，在室温下在轨道摇床上避光放置 DAPI溶液对神经元进行染色 15 分钟。15 分钟后，取出抗体溶液，用 PBS 短暂洗涤 3 次。使用防褪色封固剂将盖玻片安装在载玻片上。
在这项研究中，将来自患病 A53T 转基因小鼠的一微克混合微粒体相关 α-突触核蛋白聚集体施用到皮质或海马神经元的培养基中，诱导 α-突触核蛋白包涵体的时间依赖性形成，聚集体特异性 α-突触核蛋白抗体呈阳性。处理两天后，这些聚集体表现为小的分散点状，在以后的时间点会变得更加丰富。两周后，α-突触核蛋白包涵体类似于长而成熟的珠状结构，遵循神经突模式在整个神经元培养物中大量分布，并与突触前和神经突标志物部分共定位。
在尝试此过程时，重要的是要记住调整微克微克级微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体与神经元板密度的比率，并从富含 α-突触核蛋白包涵体的组织中分离微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体。观看此视频后，您应该对如何从患病转基因小鼠中纯化微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体有很好的了解，以用作原代神经元的治疗方法，以诱导 α-突触核蛋白包涵体的形成。
概述
本研究利用原代神经元提出了一种用于研究体内alpha-突触核蛋白聚集形成的细胞模型。通过使用来自患病转基因小鼠的外源性alpha-突触核蛋白聚集物，该研究旨在阐明聚集扩散和毒性的潜在机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经退行性疾病
背景
- Alpha-突触核蛋白与神经退行性疾病有关。
- 了解其聚集过程对于治疗干预至关重要。
- 当前研究聚集的方法通常需要大量纯化。
研究目的
- 开发一种简化的alpha-突触核蛋白聚集研究协议。
- 研究alpha-突触核蛋白聚集物在神经环境中的传播和毒性。
- 提供一个可靠的系统，避免复杂的纯化过程。
使用的方法
- 该研究利用原代神经元培养物检查细胞内聚集。
- 使用微离心和超离心分离来自患病转基因小鼠的小泡相关的alpha-突触核蛋白。
- 使用Western blot和免疫荧光分析蛋白聚集物。
- 神经元在两周的时间内被聚集物处理，每三天更换培养基一次。
主要结果
- alpha-突触核蛋白聚集物处理导致神经元中时间依赖性的不同包涵体形成。
- 这些聚集物最初表现为散落的点状，随时间发展成更成熟的结构。
- 使用聚集物特异性抗体确认了这些包涵体的存在。
结论
- 该研究展示了一种建模体内alpha-突触核蛋白聚集的新方法。
- 该方法增强了对alpha-突触核蛋白病理机制的理解。
- 这些发现对于未来神经退行性疾病的研究和潜在治疗策略有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method provides a physiologically relevant cell model for studying pathogenic alpha-synuclein aggregation directly from diseased tissue, bypassing recombinant fibril production. It enables mechanistic de-risking of alpha-synuclein-targeted therapeutics by using authentic seeding species that mimic in vivo inclusions. The approach supports target validation and phenotypic screening in Parkinson's disease research with improved predictive confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using endogenous, disease-derived alpha-synuclein aggregates.
- Operational Value: Eliminates time-consuming recombinant fibril purification, accelerating target engagement studies.
- Predictive Value: Uses pathogenic seeding species isolated from transgenic mice, improving translational relevance for target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, time-dependent intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated alpha-synuclein.
- Operational Value: Produces a standardized, reproducible readout for compound screening in primary neurons.
- Assay Readiness: Supports scalable platform development for evaluating aggregation inhibitors or modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models intracellular inclusion formation that colocalizes with presynaptic and neurite markers, reflecting pathogenic spread.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of aggregation over two weeks with defined media replenishment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo-like pathology using tissue-derived aggregates from diseased models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through phenotypic screening of aggregation modulators in a disease-relevant neuronal system.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on aggregation mechanisms and toxicity using authentic seeding species.
- Screening: Provides assay-ready neuronal cultures with quantifiable inclusion formation as a functional readout.
- Analytics: Enables Western blot and immunofluorescence detection of aggregate-specific and phosphorylated alpha-synuclein.
- Translational Research: Uses microsomes-associated aggregates from diseased tissue to enhance preclinical predictive value.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal model for iterative target de-risking across alpha-synuclein-focused programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation via disease-relevant, endogenous alpha-synuclein species.
- Operational Value: Standardized isolation and administration protocol improves reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by using pathogenic aggregates over artificial fibrils.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on aggregation inhibition in a physiologic model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuron culture and subcellular fractionation techniques.
- Dependent on access to transgenic mouse tissue rich in pathological alpha-synuclein inclusions.
- Necessitates ultracentrifugation equipment for microsomes-associated aggregate isolation.
- Requires optimization of aggregate-to-neuron ratio based on plating density.
- Limited by tissue availability and need for fresh or frozen diseased tissue sources.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Isolation of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates from Diseased A53T Alpha-synuclein Transgenic Mic
2:30
Western Blot
4:32
Neurons Treatment
5:40
Immunofluorescence
7:45
Results: Time-dependent Induction of Alpha-synuclein Deposition After Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates
8:35
Conclusion
