Name: 微粒相关α synuclein 聚合体对原代神经元的外源性管理--纤维形成的强大细胞模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解如何利用微粒相关α-synuclein聚合体建立原代神经元纤维形成模型。该方法无需耗时纯化预形成纤维，可直接观察聚集体在神经元中的传播与毒性机制。

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本工作得到了意大利大学与研究部（MIUR）职业回归资助计划（青年研究人员RLM计划）以及Scuola Normale Superiore的资助。我们感谢美国明尼苏达大学的Michael Lee教授提供了Prp Human A53T αS Tg小鼠，用于分离其中的聚集体。

使用野生型（WT）和转基因（Tg）动物的研究已获得批准，并完全遵守国家和国际关于实验动物福利与实验的法律法规（欧洲经济共同体理事会指令86/609，1987年12月12日，以及指令2010/63/EU，2010年9月22日）。本文所描述的所有实验方案均遵循本机构的动物护理指南。
1. 从患病的 A53T αS 转基因小鼠中分离与微粒体相关的 αS 聚集体
<ol>
	<li>配制匀浆缓冲液，其成分为 250 mM 蔗糖、20 mM HEPES、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、2 mM EDTA 和 1× 磷酸酶/蛋白酶抑制剂。将缓冲液置于冰上保存。</li>
	<li>使用聚四氟乙烯（Teflon）研磨杵，在冰浴条件下，按 1:10 (w/v) 的比例将新鲜或冷冻组织在匀浆缓冲液中匀浆，进行 10–15 次研磨。</li>
	<li>将初始匀浆液（1–2 mL）转移至微量离心管中，于 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟，使用制冷离心机去除沉淀中的细胞核和未破裂细胞（P1）。弃去 P1。</li>
	<li>将上清液（S1）转移至新的洁净微量离心管中，于 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 20 分钟，获得第二步上清液（S10）和沉淀（P10）。 
	注：P10 为粗制膜沉淀，含有线粒体和突触体，弃去 P10。</li>
	<li>将上清液（S10）转移至聚碳酸酯离心瓶（>1 mL）中，于 4 °C 条件下使用超速离心机和固定角转子（90 Ti）以 100,000 × g 离心 1 小时。 
	注：上清液为纯细胞质组分，沉淀 P100 含有与微粒体相关的 αS 聚集体。</li>
	<li>用 500 µL 匀浆缓冲液重悬 P100 沉淀，将 P100 转移至洁净的微量离心管中，于 4 °C 条件下使用制冷离心机以 10,000 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 100 µL 匀浆缓冲液重悬 P100 沉淀。 
	注：此组分为与微粒体相关的 αS 聚集体。</li>
	<li>在冰上对样品进行超声处理 2 秒 [设定输出功率为 1 瓦特（RMS）]。将样品储存在 -80 °C 条件下。</li>
	<li>次日，使用 BCA 分析法测定蛋白含量。</li>
</ol>
2. 蛋白质印迹
注意：通过蛋白质印迹法对微粒体相关α-突触核蛋白（αS）聚集体进行生化表征。
<ol>
	<li>在垂直电泳装置上制备4-20% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺梯度凝胶。</li>
	<li>加入1 µg微粒体相关αS组分，溶解于变性样品缓冲液中。</li>
	<li>在另一加样孔中，加入5 µL蛋白质标准品标记物。</li>
	<li>在Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液中以100 V电压运行电泳，直至蛋白质标记物迁移至凝胶底部。</li>
	<li>使用碱性碳酸盐缓冲液（10 mM NaCO3，3 mM NaHCO3，20% 甲醇）在4 °C条件下以200 mA恒定电流过夜（O/N）将蛋白质转印至硝酸纤维素膜。</li>
	<li>在室温下，将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS-非离子表面活性剂0.05%（PBS-T）溶液中，在摇床上封闭30分钟。</li>
	<li>用PBS-T短暂漂洗膜。</li>
	<li>将膜与Syn-1抗体（1:5,000）或pSer129-αS抗体（1:5,000）在含2.5%脱脂奶粉的PBS-T溶液中于4 °C摇床上孵育过夜（O/N）。</li>
	<li>在室温下，用PBS-T在摇床上洗涤膜10分钟。</li>
	<li>在室温下，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或抗兔二抗（1:3,000）在含2.5%脱脂奶粉的PBS-T溶液中孵育1小时。</li>
	<li>在室温下，用PBS-T在摇床上洗涤膜10分钟，重复3次。</li>
	<li>使用常规化学发光试剂盒检测信号。</li>
</ol>
3. 原代神经元培养
注意：原代神经元培养物取自野生型新生（P0）小鼠海马或皮层（C57BL/6品系）。整个操作过程（除离心步骤外）均在细胞培养罩内无菌条件下进行。
<ol>
	<li>处理盖玻片（18 mm &#216;用65%硝酸溶液在室温下处理至少12小时。</li>
	<li>移除硝酸。用10倍PBS清洗盖玻片两次，再用蒸馏水多次冲洗。</li>
	<li>将盖玻片放入24孔板中，用聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL，溶于无菌蒸馏水或1× PBS）在37℃下孵育1 h进行包被 &#176;C.</li>
	<li>去除多聚-D-赖氨酸，并用蒸馏水清洗盖玻片三次。于4℃保存 &#176;C，直至需要时</li>
	<li>通过断头法处死小鼠幼崽，并将头部与身体分离。将头部置于培养皿中，轻轻剥离皮肤。</li>
	<li>使用精细剪刀，在脑组织基部进行剪切以打开颅骨。将颅骨分为两半并小心移除。</li>
	<li>使用镊子从基部夹取脑组织，分离出大脑皮层和海马体，分别转移至两个含有含1%青霉素/链霉素的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）培养基的培养皿中。</li>
	<li>对每只动物重复步骤 3.6 和 3.7。注意整个过程不应超过 30 - 45 分钟。</li>
	<li>将收集的组织切碎，并转移至两个50 mL锥形管中（一个用于海马，一个用于皮层），每管加入10 mL含0.1%胰蛋白酶的HBSS培养基。在37℃水浴中孵育7分钟。 &#176;C. 
	注意：无需震荡。</li>
	<li>加入 1 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 10 &#181;向匀浆液中加入 g/mL DNase 以阻断胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将所得解离组织在 200 &#215; 在室温下以 g 离心 5 分钟，弃去上清液。 
	注意：沉淀物代表从组织中分离出的细胞。</li>
	<li>用铺板培养基重悬细胞，该培养基含有 2% B27、2 mM 谷氨酰胺、6 mg/mL 葡萄糖、10% FBS、12.5 &#181;M 谷氨酸和 10 &#181;g/mL 庆大霉素</li>
	<li>将解离的神经元以每1皮质接种至12孔、每1海马接种至6孔的比例，接种于24孔板中涂有聚-D-赖氨酸的盖玻片上，每孔细胞数约为150,000–200,000个。将细胞置于37℃培养箱中培养。 &#176;C.</li>
	<li>第二天（第 体外，DIV 1）将铺板培养基更换为含2% B27、10 &#181;g/mL 庆大霉素和 2 mM 谷氨酰胺</li>
	<li>在 DIV 2 时，移除 1/3 培养基，并加入含 2.5 的新鲜培养基的 1/3 &#181;M 胞嘧啶阿糖胞苷处理 48 小时以减少胶质细胞污染。</li>
	<li>将神经元维持在37 &#176;C，并每隔三天更换一半的培养基。</li>
</ol>
4. 神经元处理
注意：处理在体外培养第7天（DIV 7）进行。所有步骤均在细胞培养超净台内以无菌条件操作。体外培养第7天皮层神经元培养密度的示例如图1所示。
<ol>
	<li>将从三只不同患病的转基因小鼠脊髓中获得的与微粒体相关的α-突触核蛋白（αS）聚集体混合，使用原始匀浆缓冲液稀释，配制成浓度为1 µg/µL的溶液。</li>
	<li>移除1/3培养基，并轻轻加入含有2% B27、1×庆大霉素和2 mM谷氨酰胺的新鲜培养基。</li>
	<li>向细胞培养基中加入1 µg混合后的微粒体相关αS聚集体。将神经元放回37 °C培养箱中继续培养。</li>
	<li>在接下来的一周内，每隔3天补充1/3体积的新鲜培养基。不要更换原有培养基，仅进行添加。</li>
	<li>处理1周后，移除1/3培养基，并轻轻替换为含有2% B27、10 µg/mL庆大霉素和2 mM谷氨酰胺的新鲜培养基。此后每隔3天重复此步骤。</li>
	<li>处理2周后（DIV 21），固定神经元细胞。</li>
</ol>
5. 免疫荧光
<ol>
	<li>在化学通风橱中，于室温下用含5%蔗糖的1× PBS中的2%多聚甲醛溶液固定神经元15分钟，期间不摇动。</li>
	<li>移除固定液，用1× PBS轻轻漂洗3次。 
	注意：所有漂洗步骤均需轻柔操作，因为原代神经元与多聚赖氨酸包被的盖玻片结合不牢固。</li>
	<li>在室温下，用含0.3%非离子型表面活性剂的1× PBS溶液对神经元进行透化处理，持续5分钟。</li>
	<li>用1× PBS轻轻漂洗3次。</li>
	<li>在室温下，将神经元置于含3%胎牛血清（FBS）的1× PBS溶液中孵育30分钟，以封闭非特异性结合位点，使用旋转摇床。</li>
	<li>在4 °C条件下，将神经元与适当的一抗抗体溶于含3% FBS的1× PBS溶液中，于旋转摇床上过夜孵育。 
	注意：使用的抗体包括 syn303（1:1,000）、小鼠源αS抗体（1:200）、pser129-αS（1:1,000）和Tau（1:10,000）。</li>
	<li>移除一抗溶液，用1× PBS轻轻漂洗3次。</li>
	<li>在室温避光条件下，将神经元与适当的荧光标记二抗溶于含3% FBS的1× PBS溶液中，在旋转摇床上孵育1小时。</li>
	<li>移除二抗溶液，用1× PBS轻轻漂洗3次。</li>
	<li>在室温避光条件下，将神经元与DAPI溶液（0.1 µg/mL溶于1× PBS）在旋转摇床上孵育15分钟进行染色。</li>
	<li>移除DAPI溶液，用1× PBS轻轻漂洗3次。</li>
	<li>使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种方法，通过向来源于野生型小鼠的脑源性原代神经元培养物中添加从αS转基因动物模型中分离纯化的与微粒体相关的αS聚集体，诱导形成αS包涵体。
本方案的关键步骤如下：微粒体与α-突触核蛋白（αS）聚集体的比率 &#181;微粒体相关微克 &#945;S聚集体/神经元及来源 &#945;S聚集体。如结果部分所示，优化比例至关重要 &#181;微粒体相关微克 &#945;每个神经元的S聚集体数量，因为在非最佳条件下操作可能导致细胞过早死亡或细胞内聚集过少（参见代表性结果部分）。因此，在DIV 7时评估神经元培养的密度至关重要（如图所示） 图1在开始处理之前。此外， &#945;S聚集体必须从患病组织中纯化 &#945;S Tg 小鼠， 即来自积累LB样包涵体的动物模型，这些包涵体的特征是磷酸化且不溶于去垢剂 &#945;S HMW 纤维
本方案可能的修改之处涉及用于分离微粒体的组织类型（冷冻或新鲜组织）及起始用量。尽管我们选用转基因小鼠脊髓组织（SpC），因其含有较高水平的 &#945;S型不溶性聚集体，该方案适用于从任何组织中分离与微粒体相关的聚集体，前提是该区域含有丰富的 &#945;S聚集体。冷冻样品也可使用，因为冻存不会影响与微粒体相关的聚集体或聚集体的纯化步骤 本身推荐的组织起始重量约为100–150 mg，但本方案适用于低至50 mg的起始材料（无上限重量限制）。然而，当组织量低于100 mg时，应采用1:20（w/v）的适当匀浆比例，以确保至少获得1 mL上清液S10，用于加载至聚碳酸酯离心管中进行超速离心沉淀。实际上，加载体积小于1 mL可能导致离心管塌陷并造成样品损失。增加匀浆体积将导致上清液更稀释，但微粒体沉淀的浓度不会受到影响。
本方案的一个局限性在于交叉接种效率较低，最近有报道称，在将人源αS PFFs施用于小鼠神经元培养物时，αS包涵体的形成存在这一问题，而使用小鼠源αS PFFs则无此问题24。由于增加施加至小鼠神经元培养物中外源性αS纤维的数量可克服该问题，因此我们建议，当所使用的纤维来源于其他αS变异体或不同物种时，应精细调整微粒体相关聚集物的用量，而非完全采用我们所描述的条件。
外源性 &#945;添加至培养基中的αS聚集体可来源于不同途径。 体外&#160;&#945;S PFFs 之前已被用作细胞内种子模板 &#945;细胞培养、原代神经元及动物模型中的 S 聚集体3,7,8,15与我们的方法相比，其中与微粒体相关的 &#945;S聚集体可在数小时内分离，而PFFs的形成耗时较长且步骤繁琐，需要经过多步纯化，并需额外检测以确认 &#945;αS 聚集体构象25此外，PFFs 来源于细菌表达的人源或鼠源 αS &#945;S, 即 缺乏真核生物典型的翻译后修饰，可能呈现不同的构象，其选择性成核与致病特性取决于所采用的成核方案（即 原纤维与纤维束5,8 导致不同的结果和结论。相比之下，单次给药 在体内 纯化的 &#945;αS聚集体确保了更真实的致病模板的传播，紧密模拟了形成过程 &#945;S 包涵体在动物模型和帕金森病（PD）患者中的研究。
作为该技术的未来应用，我们相信，只要从富含α-突触核蛋白（αS）包涵体的病变脑区分离微粒体，该方案即可成功用于从帕金森病（PD）患者或其他αS转基因动物模型的脑组织中分离出αS致病性种子。
据我们所知，这是首个允许从体内帕金森病（PD）模型中纯化出天然毒性αS物种，并将其用作种子模板以诱导原代神经元中αS包涵体形成的方法。
我们认为该方法具有极高的通用性，能够提供一种卓越的基于细胞的模型，用于研究α-突触核蛋白（αS）聚集的不同方面及其对细胞病理生理学的影响。由于αS包涵体的形成是一个复杂的过程，在培养细胞中难以复制，我们希望该模型将有助于深入理解急性致病机制，而这些机制在动物模型等慢性且更复杂的系统中往往难以识别。

α-突触核蛋白（αS）蛋白包涵体的积聚是帕金森病（PD）和α-突触核蛋白病的显著且重要的特征1。遗憾的是，尽管动物模型能够提供足够的细胞和生化环境，以诱导蛋白纤维形成所必需的聚集过程2，但在细胞培养中复制类似路易小体（LB）的复杂聚集体的形成仍然困难且具有挑战性。
本文介绍一种在培养细胞中诱导 αS 包涵体形成的方法，该包涵体类似于在动物模型和帕金森病（PD）患者中获得的蛋白质聚集体，实验中使用了从脑组织分离的小鼠原代神经元。本方案基于将来自有症状 αS 转基因（Tg）小鼠的微粒体相关 αS 聚集体外源性施加于小鼠海马或皮层原代神经元。该方法利用了 αS 有毒构象异构体的扩散与传播能力，当这些聚集体被加入培养基后，可被细胞内吞，并诱导形成成熟的 αS 阳性聚集体3,4,5,6,7,8。
最初，在细胞培养中获得αS纤维形成的常规方法是通过常规转染方案或病毒介导的感染来过表达相应的αS cDNA9。在前一种情况下，形成类似路易小体（LB）的αS聚集体是偶然发生的，效率较低，且依赖于细胞类型；而第二种方案可在感染后24至48小时内诱导形成不溶性纤维，包括高分子量（HMW）物种10。在这些方法中，聚集体的形成可能是由于αS蛋白含量过高且失衡，导致蛋白不溶，而非由决定聚集的αS构象病理性转变所引起。相反，本文所介绍的技术并不改变αS的表达水平，而是通过外源性纤维的内化诱导广泛的蛋白聚集。此外，通过施加外源性纤维形成αS聚集体是一个耗时较长的过程，需要数天至数周才能充分完成，这使我们能够以时间序列的方式研究αS包涵体形成的早期和中间阶段，并将其与细胞的生化变化相关联。因此，该方法是一种有价值的细胞模型构建手段，可用于在显微镜下研究αS纤维形成与细胞病理生理学之间的关系。
此外，尽管给予来自患病的αS转基因（Tg）小鼠的未经处理的脑组织提取物11,12 或人类帕金森病（PD）脑组织6,13 能够诱导转基因（Tg）或野生型（WT）动物中αS沉积，但将相同方法应用于细胞培养时并未取得同样成功，可能是因为所用样本中聚集体含量较低，且缺乏分离天然αS毒性物种的标准方法14因此， 体外 迄今为止，αS 的预形成纤维（PFFs）一直是诱导细胞和动物模型中 αS 包涵体形成的首选聚集体来源3,4,6,7,15,16然而，通过我们的实验方案，我们证明了从αS转基因小鼠中分离出的与微粒体相关的αS聚集物，能够有效诱导原代神经元内路易体样αS包涵体的积累。
在我们的实验室中，微粒体相关的αS聚集物是从表达人源A53T αS基因的患病转基因小鼠脊髓（SpC）组织中分离得到的，该基因在小鼠朊病毒蛋白（PrP）启动子的调控下表达[Prp人源A53T αS转基因小鼠，G2-3品系17]。这些小鼠表现出年龄依赖性的神经退行性表型，包括显著的运动功能障碍以及中枢神经系统内形成由磷酸化、泛素化和不溶性αS构成的包涵体，表型通常在9个月龄后开始出现。一旦出现运动功能障碍，表型会迅速发展为从后肢开始的瘫痪，并在2至3周内导致死亡。αS聚集物的积累与疾病表现呈平行关系。在运动功能障碍刚出现时处死的小鼠，其脊髓、脑干和小脑中均显示出显著程度的αS聚集。无需等待瘫痪发生后再处死小鼠。无症状期小鼠是指9月龄、尚未表现出运动功能障碍的动物。

<table><tbody><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>1 M，pH = 7–7.6</td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0390-100ml</td><td>pH=8 0.5 M</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>NAHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-6X1L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>PhosStop&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>4906837001</td><td>磷酸酶抑制剂</td></tr><tr><td>BCA 蛋白质测定试剂盒</td><td>Euroclone</td><td>EMPO14500</td><td></td></tr><tr><td>Criterion TGX 4-20% 免染胶，18 孔</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>5678094</td><td></td></tr><tr><td>支撑型硝酸纤维素膜&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1620097</td><td>0.2 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>印迹级封闭剂&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>1706404</td><td>脱脂奶粉</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学发光底物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>硝酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004411000</td><td>65%</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1014355118NR1</td><td>18 mm x&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14170-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL，100 mL</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D5796-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15400054</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>B27 补充剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Glutamax&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050-038</td><td>100x</td></tr><tr><td>DNA酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Euroclone</td><td>EC50182L</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1446600-1G</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15710</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10888-022&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷（AraC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>90 Ti 转子</td><td>贝克曼</td><td>N/A</td><td>超速离心机转子</td></tr><tr><td>Optima L-90K 超速离心机</td><td>贝克曼</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 抗体，克隆 42&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>610786</td><td>抗小鼠 WB：1:5000</td></tr><tr><td>Syn303抗体&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>824301</td><td>抗小鼠 IF：1:1000</td></tr><tr><td>Tau 抗体&amp;nbsp;</td><td>Synaptic Systems</td><td>314&amp;nbsp;002</td><td>抗兔 IF：1:10,000</td></tr><tr><td>pser129-&amp;alpha;S抗体&amp;nbsp;</td><td>藤原等人惠赠，参考文献19</td><td></td><td>抗兔 WB：1:5000</td></tr><tr><td>pser129-&amp;alpha;S抗体</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>抗兔&amp;nbsp; IF：1:1000</td></tr><tr><td>小鼠 &amp;alpha;S (D37A6) XP&amp;nbsp;</td><td>细胞信号传导</td><td>4179</td><td>抗兔荧光二抗 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的抗兔抗体&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A27039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠抗体&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Microson XL-2000&amp;nbsp;</td><td>Misonix</td><td></td><td>超声波破碎仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超滤瓶（橡树岭瓶），PCB，16×76 mm，组件，诺瑞尔盖，Beckman型</td><td>科学服务欧盟</td><td>S4484</td><td>超速离心管</td></tr><tr><td>AXIO Observer 倒置光学显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>非离子型表面活性剂&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

多年来，在细胞培养中无法复制不溶性α-突触核蛋白（αS）包涵体的形成，一直是研究帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中αS聚集的一大限制。最近，通过将患病的αS转基因小鼠或PD患者脑组织提取物外源性接种而开发出的新型动物模型，为建立更合适的αS聚集细胞模型带来了新的希望。然而，对于培养细胞而言，直接施用未经处理的脑组织提取物的效果远不如在小鼠中显著，因此目前外源性聚集物的理想来源仍不明确。 体外 预先形成的αS纤维
我们已开发出一种方法，通过外源性施加与微粒体相关联的天然αS聚集体——一种从转基因小鼠病变区域分离出的高毒性αS物种——在原代神经元中诱导细胞内αS包涵体的形成。这种与微粒体囊泡相关联的αS聚集体组分可被细胞高效内化，并诱导形成富含聚集态及磷酸化αS的细胞内包涵体。相较于 体外由重组αS制成的预先形成的纤维相比，我们的方法更快，并且确保了致病性接种所使用的αS聚集体是直接从帕金森病动物模型中提取的真实聚集体，从而更紧密地模拟了实际获得的包涵体类型 体内因此，获取富含αS包涵体的组织是必不可少的。
我们认为，该方法将提供一种多功能的基于细胞的模型，用于研究αS聚集及其相关细胞病理生理学的微观特征in vivo，并为建立更精确、更复杂的帕金森病细胞模型体系奠定基础。

按照上述方案及图2中的总结，我们从三只患病的A53T αS转基因小鼠中纯化出与微粒体相关的αS聚集体（图3）。微粒体是含有内质网、高尔基体和小型突触囊泡的粗制膜沉淀组分。微粒体沉淀组分相对于其他组分的纯度程度，此前已通过特异性细胞器标志物进行了评估18。
分离后，通过变性SDS-PAGE对αS聚集体进行生化表征，随后与Syn-1或丝氨酸129位点磷酸化的αS（pSer129-αS）抗体孵育。与症状前（PreS）和年龄匹配的非转基因（nTg）小鼠相比，来自病鼠的微粒体可与αS聚集体共沉淀。与微粒体相关的αS物种表现出αS聚集体的典型特征，例如高分子量（HMW）去垢剂抗性物种的积累、丝氨酸129位点的磷酸化19以及C端和N端截短片段（有关与微粒体相关的αS聚集体的完整表征，请参见文献18,20,21）。这些是基本要求，因为单体αS不能被细胞有效内化，也无法诱导αS沉积7,15,22。在重悬P100沉淀时切勿使用任何去垢剂（离子型或非离子型），因其可能对细胞有害。此外，为避免样本间的变异性，将来自三只不同病鼠的与微粒体相关的αS聚集体混合后用于神经元处理。
将来自患病A53T小鼠的微粒体相关αS聚集体（1 µg）加入皮层或海马神经元的培养基中，可诱导αS包涵体随时间依赖性形成，这些包涵体对聚集体特异性αS抗体（如Syn303（图4、5）或pser129-αS（图5））呈阳性。处理两天（2d）后，这些聚集体表现为细小、散在的点状结构，并在后续时间点逐渐增多。两周后，αS包涵体呈现为长条状、成熟的串珠样结构，在神经元培养物中广泛分布，沿神经突走行，并部分与突触前标记物和神经突标记物共定位（图5）。偶尔可见新形成的αS包涵体与胞体共定位，或覆盖整个神经突过程，形似坏死的神经突。
尽管与微粒体相关的αS聚集体组分在神经元培养物中能够有效扩散，但其用量必须根据铺板的神经元数量精确调整（图1）。事实上，超过推荐的比例， µg 微粒体相关聚集体：神经元数量，将在数天内诱导细胞过早死亡（图6），而微粒体相关αS聚集体的量不足则会导致处理两周后包涵体数量稀少且减少，与早期时间点所获得的结果相似（图 4A).
<img alt="细胞培养显微镜图像、细胞生长模式、科学研究、显微分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1．皮层神经元培养物。 显示皮层神经元培养物在接种后第 7 天（DIV 7）密度的代表性图像。图像使用倒置光学显微镜以 10 倍物镜拍摄。比例尺 = 100 µm。<a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="匀浆过程流程图；组织离心步骤；αS 聚集体分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2。从小鼠 SpC 中分离与微粒体相关的 αS 聚集体。 从患病小鼠 SpC 中纯化与微粒体相关的 αS 聚集体的流程图。<a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质表达的Western印迹分析；α-突触核蛋白水平，疾病状态；显示的蛋白条带。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3。从患病、发病前A53T αS转基因小鼠及非转基因小鼠中分离微粒体组分。 Western印迹分析显示，从三只患病（Sick）、发病前（PreS）及年龄匹配的非转基因（nTg）小鼠中分离得到的纯化微粒体相关αS聚集体。患病小鼠为表现出运动和神经功能障碍（包括αS包涵体积累）的A53T αS转基因小鼠；而发病前动物为健康的9月龄A53T αS转基因小鼠，尚未表现出任何与αS病理相关的表型。nTg小鼠为患病小鼠的同窝对照，不携带αS转基因，因此不会发展出αS诱导的病理变化。每种纯化组分取1 µg进行变性SDS-PAGE电泳，随后转移至硝酸纤维素膜，并使用Syn-1或pSer129-αS抗体进行免疫印迹。仅从患病小鼠中分离的微粒体组分含有在丝氨酸129位点磷酸化、并表现出C端和N端截短的高分子量（HMW）去垢剂抗性αS聚集体。本图改编自Colla et al.18。<a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="s303 和 DAPI 荧光显微镜图像（2天、1周、2周）；柱状图比较 syn303/N 阳性细胞核百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图 4．给予与微粒体相关的αS聚集体后αS沉积的时间依赖性诱导。（A） 使用来自三只不同患病小鼠的微粒体相关αS聚集体组分（1 µg）处理的原代海马神经元的免疫荧光染色。在处理2天（2d）、1周（1w）或2周（2w）后固定神经元，并用syn303（S303，1:1000）抗体进行免疫染色，该抗体特异性识别氧化和聚集形式的αS。细胞核用DAPI复染。共聚焦图像使用激光扫描共聚焦显微镜拍摄，物镜放大倍数为63X。比例尺 = 50 µm。（B） 背景扣除后，使用Image J软件的颗粒计数插件对总荧光强度进行定量分析。数据根据每视野细胞核数量（DAPI计数）进行归一化，并以2D时S303荧光信号的百分比表示。数据以均值 ± 标准差表示（n = 5）。**p &lt;0.001，****p &lt;0.00001，单因素方差分析（One-way ANOVA），随后进行Fisher's LSD事后检验。<a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元细胞中α-突触核蛋白与Tau蛋白共定位的荧光显微镜图像，合并分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5。细胞内αS包涵体与皮层神经突网络共定位。 使用来自患病转基因小鼠的微粒体相关αS聚集体处理皮层神经元的代表性共聚焦图像。处理2周后，固定神经元，并用聚集体特异性抗体 [S303 (A, B) 或 pser129-αS, 1:1,000 (C)] 与神经突标记物 [小鼠αS, 1:200 (A, B) 或 Tau, 1:10,000 (C)] 进行双重染色。荧光信号的共标显示，新形成的珠状αS结构与神经突网络存在部分共定位。偶尔可见αS包涵体在神经元胞体中积聚（A, B，箭头所示）。图像采用激光扫描共聚焦显微镜获取，物镜放大倍数为63X。比例尺 = 50 µm。本图经Colla et al.20 修改。 <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清大图。</a>
<img alt="荧光显微镜图像及柱状图，显示经不同条件处理后DAPI染色的细胞核计数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6．添加亚适量的微粒体相关αS聚集体对神经元具有毒性。用不同浓度的微粒体相关αS聚集体处理神经元后进行DAPI染色，结果显示细胞死亡。 (A) 皮层神经元分别用1、2 µg从患病小鼠中提取的微粒体相关αS聚集体或不含聚集体的缓冲液 (B) 处理，并进行DAPI染色。荧光图像使用20X物镜的落射荧光显微镜获取。比例尺 = 100 µm。(B) 使用Image J软件计数DAPI阳性细胞。柱状图显示，随着加入神经元培养体系中的微粒体相关αS聚集体浓度增加，细胞核数量减少。数据表示为对照组的百分比，以均值±标准差表示（n = 5），***p &lt;0.0001，采用单因素方差分析，随后进行Fisher's LSD事后检验。 <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本实验方案的目的是提供一种基于细胞的系统，用以模拟α-突触核蛋白聚集体的形成 体内源自患病的α-突触核蛋白转基因小鼠的天然微粒体相关α-突触核蛋白聚集体，可通过外源性施加并被原代神经元内化，在细胞内引发α-突触核蛋白包涵体的种子化及传播。

多年来，在细胞培养中无法复制不溶性α-突触核蛋白（αS）包涵体的形成，一直是该领域研究的一大限制……

该方法有助于解答α-突触核蛋白研究领域中的关键问题，例如阐明α-突触核蛋白在体内的聚集传播机制及其毒性作用。该技术的主要优势在于无需耗时地纯化预先形成的α-突触核蛋白纤维。本次实验操作将由COLA实验室的研究生Lucia Rota进行演示。开始实验前，配制匀浆缓冲液并将其置于冰上。接着，使用聚四氟乙烯（Teflon）研杵匀浆器，在冰上以组织体积1:10比例的冰冻匀浆缓冲液中对新鲜或冷冻组织进行匀浆，研磨10至15次。随后，将初始匀浆液全部转移至微量离心管中，在4°C条件下以1,000 × g离心10分钟，以去除沉淀中的细胞核和未破碎的细胞。随后，弃去沉淀物。接下来，将上清液转移至一个新的洁净微量离心管中，使用预冷的离心机在4°C条件下以10,000 × g离心20分钟，以获得第二次的上清液和沉淀。然后将此上清液转移至聚碳酸酯离心管中，使用超速离心机和固定角转子在4°C条件下以100,000 × g离心1小时。用500微升匀浆缓冲液重悬P100粗沉淀。将P100粗沉淀转移至一支洁净的微量离心管中，在4°C条件下，于冷冻离心机中以10,000 × g离心20分钟。20分钟后，弃去上清液，并用100微升匀浆缓冲液重悬P100沉淀。然后，将样品在冰上超声处理两秒钟，并于-80°C保存。进行Western Blot时，在垂直电泳装置上制备4%至20%的梯度Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶。将一微克微粒体相关α-synuclein组分溶解于变性上样缓冲液中，然后上样至凝胶。在另一孔中加入5 µL蛋白标准品标记物。使用Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液，以100伏电压电泳，直至蛋白标记物迁移至凝胶底部。随后，使用碱性碳酸盐缓冲液将蛋白转印至硝酸纤维素膜上。将样品在低温室中孵育过夜，恒定电流设置为 200 毫安。次日，在室温下用含 5% 脱脂奶粉的 PBS-T 缓冲液在摇床上封闭膜 30 分钟。随后，用 PBS-T 缓冲液短暂漂洗膜。将膜在冷室或4°C冰箱中，于含2.5%脱脂奶粉的PBST缓冲液中，与SIN-1（1:5,000稀释）或P-Ser129 α-突触核蛋白抗体（1:5,000稀释）在旋转摇床上孵育过夜。次日，在室温下用PBST缓冲液在旋转摇床上洗涤膜10分钟。随后，将膜在含2.5%脱脂奶粉的PBST缓冲液中，与HRP标记的抗小鼠或抗兔二抗（1:3,000稀释）在室温下于旋转摇床上孵育1小时。然后，在室温下用 PBS-T 在轨道摇床上洗涤膜，每次 10 分钟，共洗涤三次。使用常规化学发光试剂盒检测信号。处理神经元时，从三只不同患病转基因小鼠的脊髓中提取与微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体，用原始匀浆缓冲液稀释，配制成浓度为 1 微克/微升的溶液。接着，移除三分之一的培养基，并轻轻加入新鲜的神经元培养基。向细胞培养基中加入一微克混合的微粒体相关α-s聚集体。将神经元放回37摄氏度的培养箱中。每隔三天，向样品中添加三分之一的新鲜培养基，一周内不更换培养基。处理一周后，移除三分之一的培养基，并轻柔地替换为含有2% B27、10 微克/毫升庆大霉素和2毫摩尔谷氨酰胺的新鲜培养基。每三天重复一次，持续一周，然后固定细胞。进行免疫荧光染色时，在化学通风橱中，将神经元用含5%蔗糖的2%多聚甲醛PBS溶液在室温下固定15分钟，期间不摇动。15分钟后，移除固定液，用PBS短暂洗涤神经元3次。接着，在室温下用含0.3%非离子型表面活性剂的PBS溶液对神经元进行5分钟的通透处理。随后，用 PBS 快速洗涤神经元三次。将神经元置于含 3% FBS 的 PBS 中，在室温下于旋转摇床上孵育 30 分钟，以封闭非特异性结合位点。之后，将神经元与适当的一抗（溶于含 3% FBS 的 PBS 中）在 4°C 的冷室或冰箱中，于旋转摇床上过夜孵育。第二天，移除抗体溶液，用 PBS 简短洗涤细胞三次。然后，在避光条件下，将神经元与溶于 3% FBS 和 PBS 中的适当荧光标记二抗在室温下于摇床上孵育一小时。移除抗体溶液，再用 PBS 简短洗涤三次。接下来，在室温避光条件下，将神经元置于摇床上用 DAPI 溶液染色 15 分钟。染色结束后，移除抗体溶液，用 PBS 快速洗涤三次。使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固在载玻片上。本研究中，将来自患病A53T转基因小鼠的微粒体相关α-突触核蛋白聚集体（每微克）加入皮层或海马神经元的培养基后，可诱导神经元内α-突触核蛋白包涵体呈时间依赖性形成，且对聚集态特异性α-突触核蛋白抗体呈阳性。处理两天后，这些聚集体表现为少量散在的点状结构，并在后续时间点逐渐增多。两周后，α-突触核蛋白包涵体呈现为长条状、成熟的串珠样结构，沿神经突分布模式广泛分布于神经元培养物中，并部分与突触前标记物及神经突标记物共定位。在进行该实验操作时，重要的是要记住调整微粒体相关α-突触核蛋白聚集体的微克数与接种神经元密度之间的比例，并且应从富含α-突触核蛋白包涵体的组织中分离微粒体相关α-突触核蛋白聚集体。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从患病的转基因小鼠中纯化微粒体相关α-突触核蛋白聚集体，并将其用于原代神经元处理，以诱导α-突触核蛋白包涵体的形成。

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科研

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Neuroscience

神经科学

微粒相关α synuclein 聚合体对原代神经元的外源性管理--纤维形成的强大细胞模型

本视频展示了经α-突触核蛋白（αS）聚集体处理的神经元的免疫染色过程。首先，用αS聚集体处理神经元，随后对其进行固定、通透化，并加入封闭液进行处理。接着依次加入一抗、荧光标记的二抗以及细胞核染料。最后将样品封片，并在显微镜下观察。...

α-突触核蛋白聚集体处理神经元的免疫染色

本视频演示了将α-突触核蛋白纤维注射到小鼠体内以诱导神经炎症的过程。这些纤维被注射到表达突变型α-突触核蛋白的转基因小鼠腹腔内。当纤维到达中枢神经系统后，会进入神经元并诱导突变蛋白发生聚集。这些聚集物会扩散至邻近的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞。小胶质细胞识别这些聚集物后被激活，引发神经炎症，从而损伤神经元。...

通过注射α-突触核蛋白纤维在小鼠中诱导神经炎症

本视频展示了在经α-突触核蛋白预形成纤维预处理的胚胎小鼠多巴胺能神经元中，定量α-突触核蛋白聚集的过程。该方法详细说明了通过免疫荧光技术对含有α-突触核蛋白聚集体的多巴胺能神经元进行固定、染色和定量分析的步骤。...

研究α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠多巴胺能神经元中的聚集

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）。...

检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

向表达人类α-突触核蛋白A53T家族性突变和萤火虫荧光素酶的Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠腹腔或舌部外周注射α-突触核蛋白纤维，可诱导其中枢神经系统产生神经病理学改变，包括神经炎症。...

转基因小鼠外周接种α-突触核蛋白纤维后神经炎症的生物发光成像

本文的目的是概述由单体α-突触核蛋白生成纤维、后续质量控制以及在体内使用预先形成的纤维的步骤。...

由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

本文介绍了一种用于研究原代小鼠多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集的详细实验方案。通过预先形成的α-突触核蛋白纤维诱导神经元内磷酸化α-突触核蛋白的聚集。对免疫荧光标记的细胞进行自动化成像并结合无偏倚的图像分析，使该方案成为适用于中高通量筛选抑制α-突触核蛋白聚集药物的可靠方法。...

研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

本研究分析了在帕金森病临床前模型中诱导神经炎症、神经变性及运动功能障碍所需的病毒载体剂量和暴露时间。这些编码人源α-突触核蛋白的载体被递送至黑质 ，以重现与帕金森病相关的突触核蛋白病理变化。...

分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

本方案描述了一种鼻内给予α-突触核蛋白聚集体的方法。该方法有助于研究帕金森病中α-突触核蛋白从嗅黏膜向嗅球的传播过程。...

α-突触核蛋白聚集体鼻内给药技术

了解如何利用微粒相关α-synuclein聚合体建立原代神经元纤维形成模型。该方法无需耗时纯化预形成纤维，可直接观察聚集体在神经元中的传播与毒性机制。

外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

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