外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

该方法有助于解答α-突触核蛋白研究领域中的关键问题，例如阐明α-突触核蛋白在体内的聚集传播机制及其毒性作用。该技术的主要优势在于无需耗时地纯化预先形成的α-突触核蛋白纤维。本次实验操作将由COLA实验室的研究生Lucia Rota进行演示。

开始实验前，配制匀浆缓冲液并将其置于冰上。接着，使用聚四氟乙烯（Teflon）研杵匀浆器，在冰上以组织体积1:10比例的冰冻匀浆缓冲液中对新鲜或冷冻组织进行匀浆，研磨10至15次。随后，将初始匀浆液全部转移至微量离心管中，在4°C条件下以1,000 × g离心10分钟，以去除沉淀中的细胞核和未破碎的细胞。

随后，弃去沉淀物。接下来，将上清液转移至一个新的洁净微量离心管中，使用预冷的离心机在4°C条件下以10,000 × g离心20分钟，以获得第二次的上清液和沉淀。然后将此上清液转移至聚碳酸酯离心管中，使用超速离心机和固定角转子在4°C条件下以100,000 × g离心1小时。

用500微升匀浆缓冲液重悬P100粗沉淀。将P100粗沉淀转移至一支洁净的微量离心管中，在4°C条件下，于冷冻离心机中以10,000 × g离心20分钟。20分钟后，弃去上清液，并用100微升匀浆缓冲液重悬P100沉淀。

然后，将样品在冰上超声处理两秒钟，并于-80°C保存。进行Western Blot时，在垂直电泳装置上制备4%至20%的梯度Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶。将一微克微粒体相关α-synuclein组分溶解于变性上样缓冲液中，然后上样至凝胶。

在另一孔中加入5 µL蛋白标准品标记物。使用Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液，以100伏电压电泳，直至蛋白标记物迁移至凝胶底部。随后，使用碱性碳酸盐缓冲液将蛋白转印至硝酸纤维素膜上。

将样品在低温室中孵育过夜，恒定电流设置为 200 毫安。次日，在室温下用含 5% 脱脂奶粉的 PBS-T 缓冲液在摇床上封闭膜 30 分钟。随后，用 PBS-T 缓冲液短暂漂洗膜。

将膜在冷室或4°C冰箱中，于含2.5%脱脂奶粉的PBST缓冲液中，与SIN-1（1:5,000稀释）或P-Ser129 α-突触核蛋白抗体（1:5,000稀释）在旋转摇床上孵育过夜。次日，在室温下用PBST缓冲液在旋转摇床上洗涤膜10分钟。随后，将膜在含2.5%脱脂奶粉的PBST缓冲液中，与HRP标记的抗小鼠或抗兔二抗（1:3,000稀释）在室温下于旋转摇床上孵育1小时。

然后，在室温下用 PBS-T 在轨道摇床上洗涤膜，每次 10 分钟，共洗涤三次。使用常规化学发光试剂盒检测信号。处理神经元时，从三只不同患病转基因小鼠的脊髓中提取与微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体，用原始匀浆缓冲液稀释，配制成浓度为 1 微克/微升的溶液。

接着，移除三分之一的培养基，并轻轻加入新鲜的神经元培养基。向细胞培养基中加入一微克混合的微粒体相关α-s聚集体。将神经元放回37摄氏度的培养箱中。

每隔三天，向样品中添加三分之一的新鲜培养基，一周内不更换培养基。处理一周后，移除三分之一的培养基，并轻柔地替换为含有2% B27、10 微克/毫升庆大霉素和2毫摩尔谷氨酰胺的新鲜培养基。每三天重复一次，持续一周，然后固定细胞。

进行免疫荧光染色时，在化学通风橱中，将神经元用含5%蔗糖的2%多聚甲醛PBS溶液在室温下固定15分钟，期间不摇动。15分钟后，移除固定液，用PBS短暂洗涤神经元3次。接着，在室温下用含0.3%非离子型表面活性剂的PBS溶液对神经元进行5分钟的通透处理。

随后，用 PBS 快速洗涤神经元三次。将神经元置于含 3% FBS 的 PBS 中，在室温下于旋转摇床上孵育 30 分钟，以封闭非特异性结合位点。之后，将神经元与适当的一抗（溶于含 3% FBS 的 PBS 中）在 4°C 的冷室或冰箱中，于旋转摇床上过夜孵育。

第二天，移除抗体溶液，用 PBS 简短洗涤细胞三次。然后，在避光条件下，将神经元与溶于 3% FBS 和 PBS 中的适当荧光标记二抗在室温下于摇床上孵育一小时。移除抗体溶液，再用 PBS 简短洗涤三次。

接下来，在室温避光条件下，将神经元置于摇床上用 DAPI 溶液染色 15 分钟。染色结束后，移除抗体溶液，用 PBS 快速洗涤三次。使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固在载玻片上。

本研究中，将来自患病A53T转基因小鼠的微粒体相关α-突触核蛋白聚集体（每微克）加入皮层或海马神经元的培养基后，可诱导神经元内α-突触核蛋白包涵体呈时间依赖性形成，且对聚集态特异性α-突触核蛋白抗体呈阳性。处理两天后，这些聚集体表现为少量散在的点状结构，并在后续时间点逐渐增多。两周后，α-突触核蛋白包涵体呈现为长条状、成熟的串珠样结构，沿神经突分布模式广泛分布于神经元培养物中，并部分与突触前标记物及神经突标记物共定位。

在进行该实验操作时，重要的是要记住调整微粒体相关α-突触核蛋白聚集体的微克数与接种神经元密度之间的比例，并且应从富含α-突触核蛋白包涵体的组织中分离微粒体相关α-突触核蛋白聚集体。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从患病的转基因小鼠中纯化微粒体相关α-突触核蛋白聚集体，并将其用于原代神经元处理，以诱导α-突触核蛋白包涵体的形成。