微粒相关α synuclein 聚合体对原代神经元的外源性管理--纤维形成的强大细胞模型

该方法可以帮助回答 α-突触核蛋白领域的关键问题，例如阐明 α-突触核蛋白在体内的聚集扩散机制和毒性。该技术的主要优点是它不需要耗时地纯化 α-突触核蛋白预制原纤维。演示该程序的是 COLA 实验室的研究生 Lucia Rota。

要开始该过程，请准备均质缓冲液并将其保存在冰上。接下来，使用 Teflon 杵匀浆器以 10 至 15 次冲程，在 1 到 10 体积的冰冷匀浆缓冲液中对新鲜或冷冻组织进行匀浆。然后，将所有初始匀浆转移到微量离心管中，并在 4 摄氏度下以 1， 000 倍 G 离心 10 分钟，以去除所得沉淀中的细胞核和未破碎的细胞。

随后，丢弃结果沉淀。接下来，将上清液转移到干净的微量离心管中，并使用冷冻离心机在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心 20 分钟，以获得第二个上清液和沉淀。然后将该上清液转移至聚碳酸酯瓶中，使用超速离心机和固定角转子在 4 摄氏度下以 100， 000 倍 G 离心 1 小时。

用 500 微升均质缓冲液重悬 P100 粗沉淀。将 P100 粗沉淀转移到干净的微量离心管中，并在冷冻离心机中以 10， 000 倍 G 的速度在 4 摄氏度下离心 20 分钟。20 分钟后，弃去上清液，用 100 μL 匀浆缓冲液重悬 P100。

然后，在冰上对样品进行超声处理 2 秒钟，并将其储存在零下 80 摄氏度。要进行 Western Blot，请在垂直电泳仪上灌注梯度 4 至 20% tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶。将一微克微粒体相关的 α-突触核蛋白组分溶解在变性样品缓冲液中，并将其加载到凝胶上。

在另一个孔中，加载 5 μL 蛋白质标准标记物。在 tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液中以 100 伏电压电泳凝胶，直到蛋白质标志物到达凝胶末端。然后，使用碱性碳酸盐缓冲液将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。

将样品在冷藏室中过夜，恒定功率设置为 200 毫安。第二天，在轨道摇床上用含 5% 脱脂奶粉的 PBS-T 在室温下封闭膜 30 分钟。然后，用 PBS-T 短暂冲洗膜。

将膜与 SIN-1 的 1 比 5， 000 或 P-Ser129 α-突触核蛋白抗体在 2.5% 脱脂奶粉的 PBS-T 中孵育过夜，在冷藏室或冰箱中，在 4 摄氏度的轨道摇床上孵育过夜。第二天，在室温下用 PBS-T 在定轨摇床上洗涤膜 10 分钟。将膜与抗小鼠或抗兔 HRP 偶联的二抗在 2.5% 脱脂奶粉中的 PBS-T 溶液中，在室温下在定轨摇床上孵育 1 小时。

然后，在室温下用 PBS-T 在轨道摇床上洗涤膜 10 分钟，每次 3 次。通过常规化学发光试剂盒获取信号。为了处理神经元，拉动从三种不同患病转基因小鼠的脊髓中获得的微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体，以获得用原始匀浆缓冲液稀释的每微升 1 微克溶液。

接下来，去除三分之一的培养基，并用新鲜的神经元培养基轻轻更换。向细胞培养基中加入 1 微克混合的微粒体相关 α-s 聚集体。将神经元放回 37 摄氏度的培养箱中。

向样品中加入 1/3 的新鲜培养基，不更换培养基，每 3 天一次，持续一周。处理一周后，去除三分之一的培养基，并用含有 2%B27、10 微克/毫升庆大霉素和 2 毫摩尔谷氨酰胺的新鲜培养基轻轻更换。在固定细胞之前，每三天重复一次，持续一周。

为了进行免疫荧光，在化学通风橱中，用 2% 多聚甲醛和 PBS 在 5% 蔗糖溶液中在室温下固定神经元 15 分钟，不要摇晃。15 分钟后，取出固定液，用 PBS 短暂洗涤神经元 3 次。接下来，在室温下用 0.3% 非离子表面活性素的 PBS 溶液透化神经元 5 分钟。

然后，用 PBS 短暂洗涤神经元 3 次。在轨道摇床上，在室温下将神经元与 3% FBS 和 PBS 孵育 30 分钟，以阻断非特异性结合位点。之后，将神经元与溶解在 3% FBS 和 PBS 中的适当一抗在冷藏室或冰箱中，在 4 摄氏度的轨道振荡器上孵育过夜。

第二天，去除抗体溶液，用 PBS 短暂洗涤细胞 3 次。然后，将神经元与溶于 3% FBS 和 PBS 的适当荧光二抗在室温下在轨道振荡器上避光孵育 1 小时。取出抗体溶液，用 PBS 短暂洗涤 3 次。

接下来，在室温下在轨道摇床上避光放置 DAPI溶液对神经元进行染色 15 分钟。15 分钟后，取出抗体溶液，用 PBS 短暂洗涤 3 次。使用防褪色封固剂将盖玻片安装在载玻片上。

在这项研究中，将来自患病 A53T 转基因小鼠的一微克混合微粒体相关 α-突触核蛋白聚集体施用到皮质或海马神经元的培养基中，诱导 α-突触核蛋白包涵体的时间依赖性形成，聚集体特异性 α-突触核蛋白抗体呈阳性。处理两天后，这些聚集体表现为小的分散点状，在以后的时间点会变得更加丰富。两周后，α-突触核蛋白包涵体类似于长而成熟的珠状结构，遵循神经突模式在整个神经元培养物中大量分布，并与突触前和神经突标志物部分共定位。

在尝试此过程时，重要的是要记住调整微克微克级微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体与神经元板密度的比率，并从富含 α-突触核蛋白包涵体的组织中分离微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体。观看此视频后，您应该对如何从患病转基因小鼠中纯化微粒体相关的 α-突触核蛋白聚集体有很好的了解，以用作原代神经元的治疗方法，以诱导 α-突触核蛋白包涵体的形成。