化学修饰肽核酸对单链 rna 双链 rna 的序列特异和选择性识别
September 21st, 2017
我们报告了合成和纯化多肽核酸 (巴氨酸) 齐聚物的协议。本文介绍了复式修饰 PNAs 识别 RNA 的生物化学和生物物理方法。
本方法文章的总体目标是介绍我们实验室用于研究化学修饰的肽核酸对双链 RNA 的分子识别的详细方案。该方法可以帮助回答 RNA 化学生物学领域的关键问题，例如 RNA 结构的检测和靶向。该技术的主要优点是设计原则可适用于任何 RNA 双链体结构的靶向。
演示该程序的是我实验室的助理研究员 Desiree Toh。要开始此过程，将 4 微升 35% 甘油溶液添加到先前制备的 RNA PNA 样品中并轻轻混合。使用微量移液器和凝胶上样吸头，小心地将每个样品的 20 μL 添加到先前制备的聚丙烯酰胺凝胶中，确保不会引入任何气泡。
在 250 V 的恒定电压下运行凝胶 5 小时。5 小时后，关闭电源并从凝胶支架上取下玻璃板。然后撕下凝胶密封胶带，拆卸玻璃板。
轻轻地从玻璃板上取下凝胶，并将其放入装有 350 毫升去离子水的容器中。小心地将 35 μL 溴化乙锭加入容器中，并将其放在平台摇床上低速放置 30 分钟。处理完溴化乙锭溶液后，用 1.5 至 2 升蒸馏水冲洗凝胶。
然后使用具有 532 纳米绿色激光和 610 纳米发射滤光片的成像仪扫描凝胶。使用免费软件量化凝胶条带强度。将适量的 2-氨基嘌呤标记的双链 RNA 转移到干净的 1.5 毫升试管中。
然后使用真空浓缩器浓缩 RNA 溶液。接下来，从先前制备的主储备液中转移适当体积的各种浓度的目标 PNA，以分离 1.5 mL 试管。使用真空浓缩器浓缩 PNA 溶液。
将 975 μL 孵育缓冲液添加到含有干燥 RNA 的试管中，并充分混合以确保所有 RNA 都溶解。短暂离心 RNA 溶液后，将试管放入预热的加热块中 10 分钟，使其退火。完成后，关闭加热块，让样品冷却至室温。
向每个含有干燥 PNA 的试管中加入 75 微升 RNA，并充分混合。让样品在室温下放置至少 1 小时后，在 4 摄氏度下孵育过夜。现在，将适量的 2-氨基嘌呤标记的单链 RNA 转移到单独的 1.5 ml 试管中。
将适当体积的各种浓度的靶向 PNA 从主储备液转移到含有单链 RNA 的相应试管中。干燥样品后，向每个试管中加入 75 微升孵育缓冲液并充分混合。将每根试管放入预热的加热块中 10 分钟，对每个样品进行退火。
让样品冷却至室温后，在 4 摄氏度下孵育过夜。然后，将每个样品的 70 微升转移到 1 厘米见方的比色皿中。将比色皿放入荧光分光光度计中，测量 330 至 550 纳米波长范围内的发射。
测量完成后，从比色皿中取出缓冲液。用蒸馏水冲洗比色皿，然后用氮气干燥。对所有样品重复测量后，绘制荧光强度与波长的关系图。
将适量的单链 RNA 转移到单独的 1.5 mL 试管中。然后将适当体积的靶向 PNA 从主储备液转移到含有单链 RNA 的相应试管中。干燥样品后，向每个试管中加入 130 μL 孵育缓冲液并充分混合。
将每根试管放入预热的加热块中 10 分钟，对每个样品进行退火。让样品冷却至室温后，在 4 摄氏度下孵育过夜。现在，将每个样品的 130 μL 转移到一个 8 微池比色皿中，其中一个比色皿含有孵育缓冲液。
使用紫外-可见分光光度计，测量每个样品在 260 纳米处的吸光度。在 15 至 95 摄氏度的升温下测量，然后以每分钟 0.5 摄氏度的斜坡速率从 95 摄氏度降至 15 摄氏度。在两次反相 HPLC 纯化后获得 PNA 低聚物。
PNA 的身份可以通过 MALDI/TOF 分析来确认。非变性 PAGE 数据表明，Q 和 L 修饰的 PNA 只能识别具有 C-G 对的双链 RNA 区域。这种特异性和增强的识别是通过 T-A-U-L-G-C 和 Q-C-G PNA RNA 两个基于三重形成的
。一项 2-氨基嘌呤荧光滴定研究表明，Q 和 L 修饰的 PNA 与靶向双链 RNA 结合，但不与单链 RNA 结合。含有 Q 残基的 PNA 不显示热熔解转变，表明由于 Watson Watson-Crick 样 Q-G 对中的空间冲突，没有与单链 RNA 结合。与未修饰的 PNA P1 相比，由于 Watson-Crick 样 L-G 对中的空间冲突，含有 L 残基的 PNA P4 和 P5 对的相应 RNA PNA 双链体的熔解温度较低。
紫外吸光度检测的热熔解数据与 2-氨基嘌呤荧光滴定数据一致，后者也表明含有 Q 和 L 残基的 PNA 与单链 RNA 不强烈结合。掺入 Q 碱基比 L 碱基更不稳定，因为 Q 碱基在形成类似 Watson-Crick 的 Q-G 对时具有更显着的空间冲突。一旦掌握，如果执行得当，可以在一周内完成各种实验。
在此程序之后，可以执行其他方法，例如探测和靶向细胞中的 RNA 结构，以回答其他问题，例如我们是否可以通过使用双链 RNA 结合 PNA 来检测 RNA 结构并调节 RNA 功能。该技术开发后，为 RNA 生物学和疾病领域的研究人员探索 RNA 结构靶向治疗开发铺平了道路。
概览
本文介绍了合成和纯化具有修饰残基的肽核酸（PNA）寡聚物的协议。它详细描述了通过这些修饰的PNA来表征RNA双聚体识别的生化和生物物理方法。
关键研究组成部分
科学领域
- RNA化学生物学
- 肽核酸
- 分子识别
背景
- PNA寡聚物可以通过化学修饰来增强其结合性能。
- 理解RNA结构识别对于分子生物学中的各种应用至关重要。
- 修饰的PNA可以针对特定的RNA双聚体结构。
- 表征方法包括荧光和UV-Vis光谱分析。
研究目的
- 提供详细的协议，用于研究修饰的PNA对RNA的识别。
- 探索PNA与双链RNA和单链RNA的结合效率。
- 建立适用于各种RNA结构的方法。
使用的方法
- PNA寡聚物的合成和纯化。
- 电泳用于分析RNA-PNA相互作用。
- 荧光分光光度法用于测量结合亲和力。
- UV-Vis分光光度法用于热熔解分析。
主要结果
- 修饰的PNA显示了对特定RNA双聚体的增强识别。
- Q和L修饰的PNA选择性地与双链RNA结合。
- 热熔解数据表明结合稳定性存在差异。
- 发现Q残基由于立体碰撞而使结合不稳定。
结论
- 建立的协议可以促进RNA靶向的进一步研究。
- 理解PNA修饰可以导致改进的RNA检测方法。
- 这些发现为RNA化学生物学的更广泛领域做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Chemically modified peptide nucleic acids (PNAs) enable sequence-specific recognition of double-stranded RNA (dsRNA) over single-stranded RNA (ssRNA), providing a selective probe for RNA structural targets. This selectivity supports target validation in RNA chemical biology by distinguishing functional duplexes from transient ssRNA species. The method contributes to mechanistic de-risking in early discovery by confirming binding specificity before downstream investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by confirming PNA binding to specific dsRNA sequences with C-G pairs.
- Operational Value: Uses non-denaturing PAGE and 2-aminopurine fluorescence to quantify binding affinities and selectivity.
- Predictive Value: Distinguishes dsRNA-selective binding from non-specific ssRNA interactions, reducing false positives in target identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence and thermal melting data for dose-response and selectivity profiling.
- Reproducibility: Standardized gel electrophoresis and spectrophotometry enable cross-laboratory validation of PNA-RNA interactions.
- Scalability: Supports testing of multiple RNA hairpins or duplexes with single-base mutations to map binding specificity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated dsRNA recognition supports progression to cellular probing of RNA structures.
- Biomarker Alignment: Selective binding to structured RNA enables detection of disease-associated RNA conformations.
- Risk Mitigation: Lack of ssRNA binding reduces off-target risk in therapeutic ligand design.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where selective dsRNA recognition informs prioritization of RNA-targeted modalities.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring PNA binding to defined dsRNA constructs versus ssRNA controls.
- Screening: Enables assay development for selectivity screening using fluorescence titration and thermal shift assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs including binding affinity (Kd), thermal stability (Tm), and selectivity ratios.
- Translational Research: Confirms structural selectivity necessary for cellular target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating PNA modifications across diverse RNA targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through selective dsRNA recognition over ssRNA.
- Operational Value: Standardized workflows for synthesis, purification, and biophysical characterization.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions based on binding selectivity and thermal stability profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of PNA leads with demonstrated dsRNA specificity.
Implementation Considerations
- Expertise in peptide nucleic acid synthesis via Boc-chemistry solid-phase methods.
- Access to reverse-phase HPLC, MALDI-TOF, and non-denaturing PAGE systems.
- Fluorescence and UV-Vis spectrophotometry for binding and thermal analysis.
- Standardization of incubation buffers, annealing protocols, and gel staining procedures.
- Adaptation considerations for varying RNA length, structure, and modification compatibility.
