Name: 化学修饰肽核酸对单链 rna 双链 rna 的序列特异和选择性识别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解化学修饰肽核酸对单链和双链RNA的序列特异性识别方法。本研究利用荧光光谱和紫外-可见光谱技术，揭示Q和L修饰PNA选择性结合双链RNA的分子机制，为RNA化学生物学研究提供重要实验方案。

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本工作由新加坡教育部（MOE）第一层次基金（RGT3/13 和 RG42/15，授予 G.C.）以及第二层次基金（MOE2013-T2-2-024 和 MOE2015-T2-1-028，授予 G.C.）资助。

已基于本文报道的研究工作提交了一项专利申请（专利号：PAT/179/14/15/PCT）。

RNA双链结合PNA寡聚体（例如，10聚体）属于中等大小的分子，因此在与大小相近或略大的RNA结合时，可表现出电泳迁移率的改变（例如，50聚体或更小）。如果RNA显著大于PNA，则向RNA中滴加PNA可能因凝胶迁移率变化有限而难以奏效。因此，在进行非变性PAGE实验时，可对较大的RNA进行截短处理。将大分子RNA滴加至荧光标记的PNA中，可通过非变性琼脂糖凝胶电泳监测三链结构的形成，样品加样于凝胶中部40。
在总RNA浓度保持恒定的非变性PAGE滴定实验中，我们通常使用1 µM的未标记RNA浓度，以便通过溴化乙锭对游离RNA和三链带进行高效染色。根据RNA结构的不同，低至0.2 µM的RNA浓度也可能足够31。未标记RNA的浓度（0.2 µM）决定了可准确测定的Kd值应约为0.2 µM或更高。也可使用其他染色染料以提高染色效率。此外，我们的未发表数据表明，Cy3荧光染料标记的RNA可用于非变性PAGE实验，以检测强结合事件。
由于2-氨基嘌呤仅具有中等程度的荧光性，2-氨基嘌呤荧光滴定法也仅限于测量解离常数（Kd）接近或高于0.2 µM的结合反应31。如果结合过程引起荧光信号的变化，则可通过荧光滴定法使用相对较亮的染料标记RNA或PNA，以定量溶液中相对较强的结合53,54,55。
通过双链RNA结合型肽核酸（dsRNA-binding PNAs）靶向RNA结构的策略目前仅在有限数量的RNA上得到验证。对于具有不同序列和碱基对组成的双链RNA，其结合特性可能存在差异。在设计三链形成肽核酸（TFPNAs）时，通常可选择双链中富含嘌呤的一条链。理解连续的Q·C-G三联体如何影响三链结构的稳定性至关重要。显然，需要开展更广泛的序列依赖性研究，以深入阐明TFPNAs的序列依赖性结合特性。
通过增加TFPNAs的长度和/或进一步修饰其碱基和骨架56,57，可进一步增强其结合亲和力。然而，连续的双链区域若不含非Watson-Crick结构的干扰，通常难以形成超过10个连续碱基对的稳定结构。可通过将TFPNAs与小分子偶联，以识别双链RNA区域附近存在的非Watson-Crick结构。原则上，TFPNA-小分子偶联物相较于单独的TFPNA或小分子，预期具有更高的结合亲和力和特异性。然而，用于偶联的连接臂的化学和物理性质必须经过优化58,59,60,61,62,63,64。
TFPNAs 能够优先结合双链 RNA（dsRNA），而非单链 RNA（ssRNA）或双链 DNA（dsDNA），这一特性表明，通过调控 RNA 的结构动态性及其与蛋白质和代谢物的相互作用，有望将 TFPNAs 开发为极具价值的化学探针和潜在的治疗性配体。通过将 TFPNAs 与细胞穿透性基团（如小分子、多肽和纳米颗粒）偶联，或与脂质体等超分子结构形成复合物，可能有助于其进入细胞5,6,12,17,25,31,41,65,66。进一步在 TFPNAs 上修饰生物成像标记物（如荧光团和放射性同位素），可能有助于在活体生物中对功能性 RNA 结构进行检测、成像和靶向定位。

由于近期在发现RNA调控和催化多种生物过程中的作用方面取得的进展，RNA正逐渐成为重要的生物标志物和治疗靶点1,2,3。传统上，反义链通过沃森-克里克（Watson-Crick）双链体的形成与单链RNA（ssRNA）结合3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。最近，研究人员设计了可经由霍格斯坦（Hoogsteen）氢键与双链RNA（dsRNA）结合的三链形成肽核酸（TFPNAs）（图1）3,28,29。在大多数传统反义靶向RNA中均存在双链RNA区域，包括pre-mRNA和mRNA、pre-或pri-miRNA3，以及许多其他非编码RNA1,26,27。利用TFPNAs通过三链结构靶向双链RNA可能具有优势，因其具备结构特异性，并在恢复因疾病而失调的RNA正常功能方面具有巨大潜力。
Rozners最近发表的研究工作 等，以及我们3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41，报道了相关研究工作&#160;在提高修饰型TFPNAs对双链RNA的选择性结合能力及增强其亲和力方面。我们已开发出合理设计的PNA单体的合成方法（图2包括硫代-伪异胞嘧啶（L）单体30 以及胍基修饰的5-甲基胞嘧啶（Q）单体31通过多种生物化学和生物物理表征方法，我们证明了含有L和Q残基的相对较短的PNA（6-10个残基）可分别增强对双链RNA中Watson-Crick G-C和C-G碱基对的识别能力。此外，与未修饰的PNA相比，含有L和Q残基的PNA对双链RNA的结合表现出相较于单链RNA和双链DNA更高的选择性。胍基官能团42 Q碱基的存在使PNA能够进入HeLa细胞31.
在我们的实验室中，我们采用手动Boc化学法（Boc或t-Boc代表叔丁氧羰基，参见图2）进行PNA的固相肽合成4。使用Boc作为氨基保护基团的PNA单体合成较为便利，因为与芴甲氧羰基（Fmoc）氨基保护基团相比，Boc基团体积位阻较小，这在PNA单体与固相载体偶联时可能具有优势。Boc基团对酸敏感，可在PNA合成过程中用含20-50%三氟乙酸（TFA）的二氯甲烷（DCM）溶液在固相载体上轻松去除。可使用自动肽合成仪合成PNA寡聚物；然而，自动合成通常需要3-5倍过量的PNA单体。而手动合成所需PNA单体量显著减少（仅需2-3倍过量），且每次偶联反应可通过凯撒试验（Kaiser test）43轻松监测。此外，由于Boc去除步骤中需使用具有腐蚀性的TFA，许多自动合成仪并不适用于Boc策略的合成。
PNA 寡聚体可通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行纯化，随后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行分子量表征（图 3 和 4）30,31。我们采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来监测三链结构的形成，因为游离的 RNA 双链结构与 PNA 结合形成的三链复合物通常具有不同的迁移速率（图 5）30,31。如果能够对 RNA 双链和 PNA·RNA2 三链条带实现有效的染色后显色，则无需进行标记。非变性 PAGE 实验所需的样品量相对较少。然而，上样（孵育）缓冲液与电泳缓冲液（pH 8.3）可能不同，这会导致检测仅限于动力学稳定的三链结构，因为 pH 8.3 的条件可能显著破坏三链结构的稳定性。
2-氨基嘌呤是腺嘌呤（6-氨基嘌呤）的一种异构体；其荧光强度（发射峰约为370 nm）对局部结构环境的变化敏感，适用于监测PNA结合位点附近掺入2-氨基嘌呤残基后的三链结构形成（图6）31。与许多在可见光范围内发射荧光的染料不同，标记了2-氨基嘌呤的RNA可在室光条件下暴露而不会发生光漂白。与通常需要pH 8.3运行缓冲液的PAGE实验不同，基于2-氨基嘌呤的荧光滴定法可在指定pH的单一溶液中测量结合反应，因此可能实现对相对微弱且动力学不稳定的结合在平衡状态下的测量与检测。
通过紫外吸收检测的热熔实验可测定双链（图7）31和三链结构30,32,44,45的热稳定性。三链结构的熔解过程是否呈现明显的相变，取决于其长度和序列组成。若加热与冷却曲线能够重叠，则可从中获得热力学参数。等温滴定量热法（ITC）32可更准确地测定热力学参数；然而，ITC通常需要相对大量的样品。

<table><tbody><tr><td>4A分子筛，直径1-2毫米颗粒&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-甲基二苯甲基胺盐酸盐（MBHA）&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;&amp;Yuml;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font0&quot;&gt;HCl&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(苯并三唑-1-基-氧基)三吡咯烷基膦六氟磷酸盐（PyBOP）</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>凯泽测试试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>未修饰的PNA单体</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>硫代苯甲醚</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-乙二硫醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>三氟甲磺酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&amp;reg; 100 RP-18 封端（5 &amp;micro;m) LiChroCART&amp;reg; 250-4</td><td>默克密理博</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA 寡核苷酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>定制化&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-亚甲基双丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10倍浓度Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液，pH 8.3</td><td>第1个碱基</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭（10 mg/mL）</td><td>伯乐（Bio-rad）&amp;nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>高精度比色皿（石英 Suprasil，200–2500 nm）</td><td>Hellma Analytics&amp;nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

化学修饰的肽核酸对双链rna相对于单链rna的序列特异性与选择性识别

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNA 正逐渐成为重要的生物标志物和治疗靶点。因此，开发能够识别 RNA 序列和结构的化学探针及治疗性配体具有广阔前景。近年来已开发出经化学修饰的肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）寡聚物，可实现对 RNA 双链的序列特异性识别。PNA 具有化学稳定性高、骨架呈电中性且类似肽的特性。PNA 可通过手动 Boc 法固相肽合成方法相对容易地合成。合成后的 PNA 采用反相高效液相色谱（HPLC）进行纯化，随后通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定其分子量。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术有助于三链结构形成的成像，因为经过精心设计的游离 RNA 双链与 PNA 结合形成的三链复合物通常具有不同的迁移速率。使用溴化乙锭染色后的非变性 PAGE 常是一种简便且信息丰富的技术，可用于表征 PNA 寡聚物的结合亲和力与特异性。通常可采用多个含有单碱基对突变的 RNA 发夹结构或双链结构，来系统表征 PNA 的结合特性，如结合亲和力和特异性。2-氨基嘌呤是腺嘌呤（6-氨基嘌呤）的异构体；其荧光强度对局部结构环境变化敏感，适用于监测在 PNA 结合位点附近引入 2-氨基嘌呤残基后的三链形成过程。2-氨基嘌呤荧光滴定实验还可用于验证修饰型 PNA 对目标双链 RNA（dsRNA）相较于单链 RNA（ssRNA）的结合选择性。紫外吸收检测的热熔实验可用于测定 PNA-RNA 双链及 PNA·RNA2 三链的热稳定性。本文中，我们描述了含修饰残基的 PNA 寡聚物的合成与纯化方法，并介绍了用于表征修饰型 PNA 对 RNA 双链识别能力的生化与生物物理方法。

反相高效液相色谱法可用于纯化PNA寡聚物。通过两轮高效液相色谱纯化，即可获得高纯度的PNA寡聚物（图3）。PNA的结构可通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析加以确认（图4）。
非变性PAGE是一种简便且信息丰富的技术，可用于表征PNA寡核苷酸的结合亲和力和特异性。我们通常使用多个含有单碱基对突变的RNA发夹结构或双链体来分析其结合特性（图5）。如图5所示的非变性PAGE结果明确表明，Q和L修饰的PNA能够识别含有C-G碱基对的双链RNA区域（图5B，下图），但不能识别不含C-G碱基对的区域（图5B，上图）。这种特异且增强的识别作用是通过形成T·A-U、L·G-C和Q·C-G PNA·RNA2碱基三联体实现的（图1A、C、D）。此外，也可使用单个或多个位点突变的多种PNA来验证修饰PNA结合性能的提升。我们已证实，在孵育缓冲液中添加2 mM Mg2+对结合能力无显著影响31。
我们通过2-氨基嘌呤荧光滴定实验证明，Q和L修饰的PNA能够结合靶向的双链RNA区域（图6A、6C、6D），但不能结合单链RNA（图6B、6E、6F）。PNA P3与2-氨基嘌呤标记的双链RNA结合的解离常数（Kd）为0.8 ± 0.1 µM。当P3浓度变化时，2-氨基嘌呤标记的单链RNA在370 nm处的荧光强度基本保持不变，表明PNA P3不与单链RNA结合。
含有Q残基的PNA（P2和P3）未显示出热熔解转变（图7），表明其无法与单链RNA（ssRNA）结合。这是由于在类似Watson-Crick配对的Q-G碱基对中存在空间位阻。与未修饰的PNA P1相比，含有修饰L残基但不含Q残基的PNA P4和P5，其对应的RNA-PNA双链体的熔解温度降低，这是由于类似Watson-Crick配对的L-G碱基对中同样存在空间位阻。紫外吸收检测的热熔解数据与2-氨基嘌呤荧光滴定结果一致，后者也显示含有Q和L残基的PNA对单链RNA的结合能力可忽略不计（图6B、6E、6F）。引入Q碱基比引入L碱基更具 destabilizing 作用，因为Q碱基在形成类似Watson-Crick的Q-G配对时产生的空间位阻比类似Watson-Crick的L-G配对（图1E）更为显著（图1F）。
<img alt="RNA-DNA 碱基配对示意图；Hoogsteen 配对与 Watson-Crick 配对；化学结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：稳定碱基三联体与不稳定碱基对结构的化学结构。（A-D）T·A-U（A）、C+·G-C（B）、L·G-C（C）和 Q·C-G（D）的 PNA·RNA2 大沟碱基三联体。（E, F）类似 Watson-Crick 的不稳定 PNA-RNA 碱基对 L-G（E）和 Q-G（F）。字母 R 代表 RNA 的糖-磷酸骨架。氢键以黑色虚线表示。该图引自参考文献31。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Boc-PNA 变体的化学结构图，展示肽核酸的合成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：PNA 单体的化学结构。 图示四种 PNA 单体（T、C、L 和 Q）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多肽合成示意图，包含粗品及再纯化后的色谱结果、保留时间分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：PNA 寡聚物的化学结构及其通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行的纯化。 （A）PNA 序列 P3 的化学结构。（B, C）粗品 PNA P3 的 RP-HPLC 数据（B）以及再纯化后 PNA P3 的 RP-HPLC 数据（C）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱结果；m/z 与强度关系图；分析化合物 P3；计算质量与实测质量对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4： 纯化后的 PNA P3 的 MALDI-TOF 质谱图。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA发夹结构相互作用；示意图、凝胶电泳、结合曲线；三链体形成分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5： RNA发夹结构与PNA序列及其通过非变性PAGE进行的结合特性表征。（A）RNA发夹结构（rHP1和rHP2）、PNA P3，以及PNA P3与rHP2之间形成的PNA·RNA2三链体。（B）rHP1和rHP2与PNA P3结合的非变性PAGE（12%）结果。孵育缓冲液为200 mM NaCl、0.5 mM EDTA、20 mM HEPES，pH 7.5。上样RNA发夹结构（rHP1和rHP2）浓度为1 µM，体积为20 µL。泳道中PNA浓度从左至右分别为0、0.2、0.4、1、1.6、2、4、10、16、20、28和50 µM。PNA P3不与rHP1结合（上图），但可与rHP2结合（下图）。（C）P3与rHP2结合的Kd测定。三链体形成比例（Y）随PNA浓度作图。本图改编自参考文献31。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA-RNA 三链体，双链稳定性；荧光光谱；结合亲和力曲线；光谱数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：PNA P3 与 2-氨基嘌呤标记的 RNA 结合的荧光滴定研究。 RNA 序列中的 2-氨基嘌呤残基标记为“2”。孵育缓冲液为 200 mM NaCl、0.5 mM EDTA、20 mM HEPES，pH 7.5。（A）P3 与一条 2-氨基嘌呤标记的双链 RNA（dsRNA2-2AP）之间形成的 PNA·RNA2 三链体。（B）P3 与一条 2-氨基嘌呤标记的单链 RNA（ssRNA2-2AP）之间可能形成的 PNA-RNA 双链体。（C、E）在 pH 7.5 条件下，2-氨基嘌呤标记的 RNA 双链体（1 µM）和单链 RNA（1 µM）在不同浓度 P3 存在下的荧光发射光谱。约 475 nm 处的峰源于 PNA 中 L 碱基的微弱荧光发射。（D、F）基于 RNA 双链体和单链 RNA 的 2-氨基嘌呤荧光强度（370 nm 处）随 PNA P3 浓度变化的曲线所确定的 Kd 值。该图改编自参考文献31。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="RNA双链稳定性；熔解曲线；图表；ssRNA1，P1-P5相互作用；热变性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：RNA-PNA双链的热熔解实验结果。 孵育缓冲液组成为200 mM NaCl、0.5 mM EDTA、20 mM NaH2PO4，pH 7.5。所有样品体积为130 µL，含有5 µM单链RNA（ssRNA1）和PNA。(A) 单链RNA（ssRNA1）、PNA（P1、P2、P3、P4和P5）以及PNA P3与ssRNA1以平行取向形成的假想PNA-RNA双链结构。图中显示了类似Watson-Crick配对的Q-G和L-G碱基对之间的空间位阻。(B) 不同PNA与ssRNA1结合后的熔解曲线。具有熔解转变的曲线标示了相应的熔解温度。该图改编自参考文献31。

我们报告了含有修饰残基的肽核酸（PNA）寡聚体的合成与纯化方案。同时描述了用于表征修饰PNA识别RNA双链体的生物化学与生物物理方法。

化学修饰的肽核酸对双链RNA相对于单链RNA的序列特异性与选择性识别

RNA 正日益成为重要的生物标志物和治疗靶点。因此，开发化学探针和治疗性配体具有巨大潜力……

本文方法的总体目标是介绍我们实验室用于研究化学修饰的肽核酸识别双链 RNA 分子机制的详细实验方案。该方法有助于解答 RNA 化学生物学领域中的关键问题，例如 RNA 结构的检测与靶向。该技术的主要优势在于其设计原理可适用于任意 RNA 双链结构的靶向识别。示范该实验操作的是我实验室的研究助理 Desiree Toh。开始此操作时，向预先制备好的 RNA PNA 样品中加入 4 µL 的 35% 甘油溶液，并轻轻混匀。使用移液器和加样枪头，小心地将每份样品各 20 µL 加入预先制备好的聚丙烯酰胺凝胶中，注意避免引入气泡。以250伏恒定电压电泳运行五小时。五小时后，关闭电源，从电泳装置上取下玻璃板。随后移除凝胶封边胶带，并拆卸玻璃板。轻轻将凝胶从玻璃板上取下，放入盛有 350 毫升去离子水的容器中。小心向容器中加入 35 微升溴化乙锭，并将容器置于平台摇床上，以低速摇动 30 分钟。弃去溴化乙锭溶液后，用 1.5 至 2 升蒸馏水冲洗凝胶。然后使用配备532纳米绿色激光和610纳米发射滤光片的成像仪扫描凝胶。使用免费软件对凝胶条带强度进行定量。将适量的2-氨基嘌呤标记的双链RNA转移至洁净的1.5毫升离心管中。然后使用真空浓缩仪浓缩RNA溶液。接着，从先前配制的主储备液中，将不同浓度的目标PNA分别转移至不同的1.5毫升离心管中。使用真空浓缩仪浓缩PNA溶液。向含有干燥RNA的离心管中加入975微升孵育缓冲液，充分混匀以确保所有RNA完全溶解。短暂离心RNA溶液后，将离心管放入预热的加热金属块中，进行10分钟退火处理。完成后关闭加热金属块，让样品冷却至室温。向含有干燥PNA的各管中加入75 µL RNA，并充分混匀。室温静置至少1小时后，于4 °C过夜孵育。现在，将适量的2-氨基嘌呤标记的单链RNA转移至不同的1.5 mL离心管中。将不同浓度的目标PNA从主溶液中分别转移至含有单链RNA的相应离心管中。样品干燥后，向每管中加入75微升孵育缓冲液，并充分混匀。将各管置于预热的金属浴中，进行10分钟退火处理。待样品冷却至室温后，于4°C下孵育过夜。随后，将每份样品中的70微升转移至1厘米方形比色皿中。将比色皿放入荧光分光光度计中，测量330至550纳米波长范围内的发射光谱。测量完成后，从比色皿中移除缓冲液。用蒸馏水冲洗比色皿，并用氮气吹干。在完成所有样品的测量后，以波长为横坐标，绘制荧光强度曲线。将适量的单链RNA转移至若干个1.5毫升离心管中。随后，从主储备液中吸取相应体积的靶向PNA，分别加入含有单链RNA的各管中。样品干燥后，向每管中加入130微升孵育缓冲液，并充分混匀。将每个样品置于预热的金属浴中孵育10分钟以进行退火。随后让样品冷却至室温，并在4摄氏度下孵育过夜。接着，将每个样品中的130微升转移至八联微量比色皿中，其中一个孔加入孵育缓冲液作为对照。使用紫外-可见分光光度计，在 260 纳米处测量每个样品的吸光度。以每分钟 0.5 摄氏度的升温速率，从 15 摄氏度升至 95 摄氏度进行测量，随后再以相同速率从 95 摄氏度降至 15 摄氏度。PNA 寡聚体经两次反相高效液相色谱纯化后获得。可通过MALDI/TOF分析确认PNA的身份。非变性PAGE数据表明，Q和L修饰的PNA只能识别含有C-G碱基对的双链RNA区域。这种特异且增强的识别是通过T-A-U-L-G-C和Q-C-G PNA-RNA形成的两个三链结构实现的。一项2-氨基嘌呤荧光滴定研究表明，含有Q和L修饰的PNA能够结合靶向的双链RNA，但不能结合单链RNA。含有Q残基的PNA未显示出热熔解转变，表明由于Watson-Crick样Q-G配对中的空间位阻，无法与单链RNA结合。与未修饰的PNA P1相比，含有L残基的PNA P4和P5因其Watson-Crick样L-G配对中的空间位阻，对应的RNA-PNA双链体熔解温度较低。紫外吸收检测的热变性数据与2-氨基嘌呤荧光滴定数据一致，后者同样表明含有Q和L残基的PNA不会与单链RNA强烈结合。引入Q碱基比引入L碱基更具有 destabilizing 作用，因为Q碱基在形成类似Watson-Crick的Q-G配对时会产生更显著的空间位阻。一旦掌握，若操作得当，各项实验可在一周内完成。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，例如在细胞内探测和靶向RNA结构，以回答更多问题，比如我们是否能够利用双链RNA结合型PNA来检测RNA结构并调控RNA功能。该技术一经建立，便为RNA生物学与疾病领域的研究人员探索以RNA结构为靶点的治疗开发铺平了道路。

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化学修饰肽核酸对单链 rna 双链 rna 的序列特异和选择性识别

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