对于拟肽与他们抗利什曼原虫活性混合赖氨酸型/精氨酸型单体及评价合成的有效方法

该程序的总体目标是在同一类肽序列中引入赖氨酸和精氨酸型单体，并评估这些化合物对墨西哥利什曼原虫的活性，墨西哥利什曼原虫是被忽视的热带病皮肤利什曼病的致病寄生虫。皮肤利什曼病迫切需要新的治疗方法，该程序可以帮助识别和开发类肽作为这种被忽视的热带病的一类新型潜在抗感染药物。该方案的主要优点是可以合成包含混合阳离子官能团的类肽。

这是非常可取的，因为它可以帮助调节序列的生物活性。虽然这针对寄生虫的哺乳动物形式进行测试，但它也可用于对抗墨西哥利什曼原虫的昆虫阶段或应用于哺乳动物细胞系。这种方法的视觉演示非常有用，因为它显示了合成的逐步性质以及墨西哥利什曼原虫生命周期中各个阶段的寄生虫培养。

要开始此过程，请按照文本方案中的概述在二甲基甲酰胺中制备溶液。然后，将 0.1 毫摩尔 Fmoc 保护的溜冰场酰胺树脂加入到带有两个筛板的 20 毫升聚丙烯反应容器中。加入 5 毫升二甲基甲酰胺，让容器在室温下静置 60 分钟。

然后，使用固相萃取真空平台排空 DMF。接下来，加入 2 毫升准备好的哌啶溶液。将容器放在摇床平台上，在室温下以 450 RPM 的速度摇晃 5 分钟。

使用真空站排空溶液。然后，加入 2 毫升哌啶溶液，在相同条件下振荡 15 分钟。振荡完成后，通过真空站排空溶液。

加入 2 毫升 DMF 并混合 30 秒以清洗树脂。排干 DMF 并重复洗涤 3 次。要开始亚单体合成，请加入 1 毫升制备的溴乙酸溶液和 0.2 毫升制备的 DIC 溶液。

在室温下摇晃 20 分钟。然后，沥干溶液并每次使用 2 毫升 DMF 洗涤 3 次。加入 1 毫升准备好的胺溶液。

然后，在室温下摇动填料 60 分钟。排干溶液，每次使用 2 ml DMF 洗涤树脂 3 次。接下来，加入 1 毫升溴乙酸溶液和 0.2 毫升 DIC 溶液。

在室温下摇晃 20 分钟。然后，沥干溶液并每次使用 2 毫升 DMF 洗涤 3 次。要引入胍官能化单体，请在树脂中加入 1 mL 未保护的二胺溶液。

在室温下摇晃 60 分钟。然后，沥干溶液并用 2 毫升 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 0.5 毫升制备的 2-乙酰二美酮溶液。

在室温下摇晃 60 分钟。然后，沥干溶液并用 2 毫升 DMF 洗涤树脂 3 次。继续亚单体合成，直到获得所需的序列。

然后，加入 4 毫升准备好的肼溶液，并在室温下摇动 3 分钟。沥干溶液并重复 3 次。然后，每次洗涤使用 2 毫升 DMF 洗涤树脂 3 次。

肽类序列中的每个游离胺中加入 DIPEA 和六当量的吡唑-1-羧脒。在室温下摇晃 60 分钟。振荡完成后，沥干溶液。

每次洗涤使用 2 毫升二氯甲烷将树脂洗涤 3 次。将树脂风干 10 分钟，然后储存以备将来使用。胺添加后可进行测试裂解，以检查合成进度。

为了开始最终切割，将 4 mL 切割混合物添加到用于合成的同一熔块反应柱中，并覆盖容器。在室温下摇晃 90 分钟。然后使用烧结的反应容器，将树脂中的裂解混合物过滤到圆底烧瓶中。

使用旋转蒸发器蒸发裂解混合物。加入 2 毫升无水乙醚以沉淀类肽。使用移液管，取出乙醚并丢弃。

然后，重复乙醚沉淀 3 次。沉淀完成后，将粗肽溶解在 10 毫升准备好的乙腈和酸化水溶液中。转移到预先称重的容器中。

然后，在零下 20 摄氏度下冷冻并冻干成干粉，准备通过反相 HPLC 进行纯化。培养墨西哥利什曼原虫寄生虫并转化到 axenic 无鞭毛细胞阶段后，按照文本方案中概述的制备化合物储备溶液开始细胞毒性测定。如文本方案中所述，将 2 微升 5 毫摩尔肽原液、两性抗菌素 B 对照和 DMSO 对照添加到 96 孔板的顶行。

使用多通道移液器，向顶行添加 48 μL 新鲜培养基。向所有其他行中加入 25 μL 新鲜培养基。接下来，从顶行吸取 25 μL 溶液，将其添加到下行并混合，进行连续稀释。

对整个板重复稀释，丢弃从底行移液的最后 25 μL。然后，将寄生虫培养物转移到 50 毫升离心管中。以 447 g 离心 5 分钟。

倒出旧培养基，加入 10 毫升新鲜培养基。接下来使用移液器，将寄生虫沉淀轻轻重悬于新培养基中。使用 Neubauer 改进的血细胞计数器计数，并将培养物稀释至每毫升 800 万个寄生虫。

稀释培养物后，向每个孔中加入 25 微升寄生虫。将板在 60 摄氏度下孵育 32 分钟。孵育完成后，从每个孔中取出 40 μL 溶液。

向每个孔中加入 90 μL 新鲜培养基，并在 32 摄氏度下孵育 24 小时。然后，向每个孔中加入 10 μL 基于刃天青的细胞活力溶液。在 32 摄氏度下孵育 4 小时。

孵育完成后，使用酶标仪测量荧光。通过去除平均背景并将 resect 归一化后孔的荧光与 DMSO 对照进行比较来分析数据。在这项研究中，每种肽使用 120 毫克的溜冰场酰胺树脂合成了两种类肽。

通过反相高压液相色谱纯化产物，合并与目标质量相对应的馏分，获得白色粉末。此处显示了两种类肽收集的量，对于纯度超过 90% 的级分，产量约为 30%。使用分析反相 HPLC 评估产品纯度，并在 220 纳米处观察酰胺主链的吸光度。

类肽都被认为是同质的。针对 L Mexicana 的细胞毒性测定的代表性结果如下所示。在细胞培养级 DMSO 中制备化合物的 5 毫摩尔储备液，并至少一式三份测试两次，以确保数据可靠。

可以看出，类肽 B 在降低活寄生虫的百分比方面比类肽 A 更有效，两者均具有剂量依赖性效应。看完这种方法后，您应该对如何合成、表征和纯化含有赖氨酸型和精氨酸型单体的类肽，以及如何在针对墨西哥利什曼原虫的细胞毒性测定中使用它们有一个很好的了解。我们将双重阳离子官能团添加到类肽中的方法只为常用的类肽合成亚单体方法增加了一个额外的简单步骤。

按照这种方法，可以添加不同长度的赖氨酸或精氨酸型亚单体，以帮助增加文库多样性，例如，具有 2 到 6 个碳链长度的侧链。在尝试类肽合成时，记住在步骤之间充分清洗填料非常重要，以防止不必要的添加或缺失产物。该方法为研究人员探索混合阳离子官能化类肽的生物活性铺平了道路，并将该活性与仅含有赖氨酸或精氨酸型单体的活性进行比较。

最后，不要忘记本方案中使用的寄生虫和几种试剂可能非常危险。因此，请务必始终使用足够的个人防护设备，并在适当的情况下在通风柜或微生物安全柜内工作。