Name: 对于拟肽与他们抗利什曼原虫活性混合赖氨酸型/精氨酸型单体及评价合成的有效方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学习利用固相合成技术制备含赖氨酸型和精氨酸型单体的拟肽，并评估其对墨西哥利什曼原虫的抗寄生虫活性。该方法为开发新型抗感染药物提供了有效途径。

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感谢工程与物理科学研究委员会（EPSRC）提供的经费支持（HLB）。同时感谢Sridévi Maalika Ramanoudjame在本实验操作拍摄过程中提供的协助。

1. 多肽类似物的固相合成
注意：肽拟物通过固相肽拟物合成的亚单体方法手动合成。该方法具有高效的偶联效率和良好的最终产物收率。固相合成还可在每步反应结束后轻松去除过量反应物，本文对该方法进行了改进，以允许使用不同的功能化阳离子单体即， 精氨酸型和赖氨酸型残基）包含在同一序列中。1,2
<ol>
	<li>线性肽模拟物的合成 
	注意：开始合成前需进行安全评估。所有反应均应在通风橱中进行，并根据需要佩戴适当的个人防护装备。即，一次性丁腈手套、护目镜和实验服）。使用以下试剂和溶剂时需特别小心。二甲基甲酰胺（DMF）疑似致畸物，二氯甲烷（DCM）为致癌物。 N,N二异丙基碳二亚胺（DIC）和哌啶对眼睛、皮肤及通过呼吸道吸入均有危害，可能引起皮肤致敏。肼类物质为疑似致癌物，吸入可致死，并可导致皮肤或眼睛严重灼伤。溴乙酸对皮肤、眼睛和呼吸道亦具危害性，接触后可能引起灼伤。三氟乙酸（TFA）为挥发性液体，可导致严重灼伤，操作时需格外小心。建议佩戴重型防护手套。
	<ol>
		<li>将0.12 g Fmoc保护的Rink Amide树脂（0.1 mmol，典型载量0.7 mmol/g）加入带有两个烧结片的带盖20 ml聚丙烯反应容器中。加入5 ml二甲基甲酰胺（DMF）溶胀树脂，并在室温下静置至少60分钟。使用固相萃取真空装置抽干DMF。</li>
		<li>为脱除溶胀树脂上的Fmoc保护基，加入2 ml哌啶溶液（20% DMF v/v）。将容器置于摇床平台上，室温下（450 rpm）振荡5分钟。通过真空装置移除溶液。
		<ol>
			<li>用2 ml哌啶溶液重复Fmoc脱保护，室温下振荡15分钟。如前所述排空溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入2 ml DMF洗涤树脂，混匀30秒，抽干DMF，重复此步骤三次。</li>
		<li>对于乙酰化反应，加入1 ml溴乙酸溶液（DMF中0.6 M）和0.2 ml N,N'二异丙基碳二亚胺溶液（DIC，50% DMF 溶液，v/v）。将反应容器在室温下振荡反应 20 分钟。滤除溶液，再用 2 ml DMF 洗涤树脂三次。</li>
		<li>加入1 ml胺溶液（1.5 M，DMF中），室温下振荡树脂60分钟。抽干溶液，再用2 ml DMF洗涤树脂三次。
		<ol>
			<li>添加精氨酸型单体时，遵循步骤1.7。根据目标肽拟物序列的不同，需加入不同的胺类试剂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重复步骤 1.1.4 和 1.1.5。</li>
		<li>引入胍基功能化单体（即, N精氨酸），向树脂中加入1 ml未保护的二胺溶液（DMF中1.5 M），室温下振荡反应60分钟。
		<ol>
			<li>吸去溶液，并用 2 ml DMF 洗涤树脂三次。</li>
			<li>加入2-乙酰基二甲基酮（0.2 g，1 mmol溶于0.5 ml DMF中，10当量），以将Dde基团引入游离伯胺，室温下振荡反应60分钟。滤除溶液，再用2 ml DMF洗涤树脂三次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>继续按照步骤1.1.4至1.1.7进行单体单元合成，直至获得目标序列。加入2 ml DMF洗涤树脂，并重复此步骤三次。</li>
		<li>为去除树脂上的Dde保护基，加入4 ml 2%肼溶液（DMF，v/v），室温下振荡反应3分钟。滤除溶液，重复此步骤三次。</li>
		<li>吸出溶液，再用 2 ml DMF 洗涤树脂三次。</li>
		<li>加入吡唑-1-羧基脒（每游离氨基6当量， 即每 NArg单体（以最小体积的DMF溶解） N,N二异丙基乙基胺或DIPEA（每游离胺基6当量），室温下振荡反应60分钟。</li>
		<li>吸干溶液，用2 ml二氯甲烷洗涤树脂3次。将树脂在空气中干燥10分钟，之后可保存至裂解步骤（第2节）。</li>
		<li>暂停合成时，用2 ml DMF洗涤树脂三次。加入2 ml DMF，密封反应容器，置于通风橱中室温下保存。 
		注意：除第二步置换反应外（因可能形成二酮哌嗪），其他任何置换步骤后均可暂停合成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>侧链去保护及从树脂上裂解
	<ol>
		<li>在合成过程中的任何阶段，如取代反应后、Dde保护基的添加或去除后，或最终序列构建完成后，均应进行测试性裂解，以检测合成的进展情况（纯度和质量）。
		<ol>
			<li>从反应容器中转移约10颗树脂珠至一个新的8 ml聚丙烯烧结滤筒中。</li>
			<li>加入1 ml三氟乙酸裂解鸡尾酒溶液（含95% TFA、2.5% H2O，2.5% 三异丙基硅烷）并在室温下振荡反应90分钟。</li>
			<li>使用带砂芯的反应容器将三氟乙酸（TFA）裂解混合液从树脂中滤出，收集至10 ml圆底烧瓶中。</li>
			<li>使用旋转蒸发仪将裂解混合液蒸干，再将所得油状物溶于1 ml乙腈/水，用于LC-MS或分析型HPLC检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>最终裂解步骤：在用于合成的同一根带烧结聚丙烯反应柱中，加入4 ml TFA裂解液（95% TFA，2.5% H₂O，2.5% TIPS）2O，2.5% 三异丙基硅烷）并盖紧容器。室温下振荡反应90分钟。</li>
		<li>使用带砂芯的反应容器将三氟乙酸裂解混合液从树脂中滤出，收集至50 ml圆底烧瓶中。</li>
		<li>使用旋转蒸发仪蒸干裂解混合液。待三氟乙酸（TFA）完全去除后，产物应以油状物形式析出。为促进从粗油状物中彻底去除TFA，加入2 ml无水乙醚，此时肽拟物应发生沉淀。
		<ol>
			<li>用移液管吸除乙醚并弃去，或使用旋转蒸发仪蒸发。重复乙醚沉淀三次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将粗品peptoid溶解于10 ml乙腈/酸化水溶液（50%乙腈，0.1% TFA，v/v）中。转移至预先称重的容器中，在20 °C下冷冻并冻干成干燥粉末。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 表征与纯化
注意：可通过使用C18柱的反相高效液相色谱（HPLC）结合电喷雾液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对肽拟物的合成过程进行监测，并对最终产物进行分析评估。所有用于HPLC及LC-MS的溶剂均应新鲜配制。
<ol>
	<li>分析型高效液相色谱（HPLC）
	<ol>
		<li>称取1 mg肽模拟物置于小玻璃小瓶中。加入最小体积的乙腈使其溶解，再用水稀释至1 ml。确保肽模拟物完全溶解。</li>
		<li>取10 µl样品进样至分析型HPLC（建议采用0–100%溶剂B的梯度程序，运行30分钟，其中溶剂A为95%水、5%乙腈、0.05%三氟乙酸（TFA），溶剂B为95%乙腈、5%水、0.03% TFA），具体操作遵循仪器制造商的说明。</li>
		<li>在220 nm波长下检测紫外吸收光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电喷雾电离液相色谱-质谱（ESI LC-MS）
	<ol>
		<li>按照步骤2.1.1的方法配制1 mg/ml的肽模拟物溶液。</li>
		<li>取1 µl样品进样至电喷雾LC-MS，依据仪器制造商的操作说明，检测目标肽模拟物的分子量是否存在。</li>
		<li>使用肽模拟物计算器，按照计算器的说明核查目标肽模拟物序列的理论质量。26 该网络工具还可用于指认质谱中出现的任何缺失或加成产物。26</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）
	<ol>
		<li>将粗品肽模拟物溶解于2 ml酸化水/乙腈混合液（95%水、5% MeCN、0.1% TFA）中，按照仪器制造商的方案通过制备型反相HPLC进行纯化。梯度条件应根据分析型HPLC测得的洗脱时间确定，进样量则取决于色谱柱的尺寸。</li>
		<li>使用设定在220 nm波长的检测器进行检测。</li>
		<li>将洗脱组分收集至15 ml离心管中，于20 °C冷冻后冻干。</li>
		<li>根据制造商的方案，采用LC-MS和分析型HPLC对各组分重新分析，并合并纯化后的组分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 针对生物学测试 Leishmania mexicana 寄生虫
注意：合成开始前必须进行安全评估。 Leishmania mexicana 被列为英国的2类危害病原体，在开始检测前必须落实适当的控制措施。所有操作必须在2级微生物安全柜中进行，并根据需要佩戴适当的个人防护装备。即， 腈类手套、护目镜和实验服。
<ol>
	<li>寄生虫传代培养
	<ol>
		<li>解冻1 ml -150 °C冻存的菌种 利什曼原虫墨西哥种 将小瓶置于37 °C水浴中30秒以解冻M379。</li>
		<li>将储备液转移至含有10 ml Schneider昆虫培养基（pH 7.0，添加15%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素）的25 cm²培养瓶中3 带有非通气盖的细胞培养瓶</li>
		<li>26 °C 下孵育 72 小时</li>
		<li>在显微镜下（400倍放大）检查寄生虫状态。应为昆虫阶段的前鞭毛体，处于对数生长期的前循环型，含有大量正在分裂的细胞。</li>
		<li>通过将前循环型前鞭毛体传代至浓度为 5 x 105 每三天计数一次，每毫升中的寄生虫数量。使用改进型纽鲍尔血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化 L. mexicana 昆虫阶段到哺乳动物阶段的无菌无鞭毛体形式 27
	<ol>
		<li>第0天：准备10 ml对数期寄生虫培养物，浓度为5 × 105 每毫升含寄生虫的Schneider昆虫培养基（pH 7.0，添加15%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素）置于25 cm²培养瓶中3 带非通气盖的细胞培养瓶</li>
		<li>26 °C 培养 48 小时。</li>
		<li>第3天：取10 ml培养液转移至50 ml离心管中，447 x g离心5 min。</li>
		<li>弃去旧培养基，加入10 ml Schneider昆虫培养基（pH 5.5，添加20%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素）。用移液器将寄生虫沉淀在新培养基中轻轻重悬。</li>
		<li>使用改进型Neubauer血细胞计数板对寄生虫数量进行计数。稀释至浓度为5 x 105 寄生虫/毫升，加入pH 5.5的培养基，转移至25 cm²培养瓶3 细胞培养瓶</li>
		<li>在26 °C下孵育约6天。</li>
		<li>第9天：在显微镜下（400倍）观察寄生虫。此时它们应处于非复制性的、具有感染性的前鞭毛体阶段。</li>
		<li>使用改进型Neubauer血细胞计数板对寄生虫数量进行计数。稀释至浓度为5 x 105 寄生虫/毫升，pH 5.5 培养基。</li>
		<li>吸取10 ml细胞培养物，转移至细胞培养瓶中。在32 °C下培养5天。</li>
		<li>第14天：在显微镜下（400倍）观察寄生虫形态。此时寄生虫应处于致病性的无鞭毛体阶段，缺乏前鞭毛体所具有的鞭毛结构，并已准备好用于检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞毒性检测 L. mexicana 无菌无鞭毛体 
	注意：肽模拟物的生物学测试采用在96孔板中进行的高通量检测。本方案描述了其测试方法 L. mexicana 无菌的无鞭毛体，但相同的检测也可在适当培养基中对前鞭毛体阶段的寄生虫进行。将化合物以3–100 µM浓度与寄生虫共孵育60分钟，随后稀释10倍，继续孵育24小时。孵育结束后，加入基于刃天青的细胞活力检测溶液，通过测定各孔荧光值获得结果。例如，刃天青钠
	<ol>
		<li>配制化合物储备液。使用分析天平称取1 mg纯化后的最终肽拟态产物，加入适量分子生物学级二甲基亚砜（DMSO），配制成5 mM浓度的溶液。分装为每份6 µl，于-20 °C保存。</li>
		<li>在96孔板上配制化合物溶液（推荐的板布局可参见结果部分， 图6) 从100至3 µM，设三个重复。在第一行每孔加入2 µl的5 mM各化合物储备液（即， A) 使用多通道移液器向最上一排加入 48 µl 新鲜的 Schneider 昆虫培养基（pH 5.5，含 20% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S））。向其余各排（B - F）加入 25 µl Schneider 昆虫培养基。
		<ol>
			<li>通过移液枪从最上一排取25 µl溶液，加入下一排孔中并混匀。依次进行梯度稀释，直至最后一排，最后一排的25 µl溶液应弃去。</li>
			<li>使用两性霉素B（5 mM储备液）作为阳性对照，DMSO（2%溶液）作为阴性对照，每组设三个重复。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备寄生虫溶液：将培养物转移至50 ml离心管中，在447 x g下离心5 min。弃去旧培养基，加入10 ml Schneider昆虫培养基（pH 5.5，含20% FBS和1% P/S）。</li>
		<li>用移液器将寄生虫沉淀物轻轻悬浮于新鲜培养基中，使用改进型Neubauer血细胞计数板进行计数。将培养物稀释至8 × 10⁶个/mL。6 寄生虫/毫升</li>
		<li>加入 25 µl L. mexicana 将培养物加入每个孔中。在 32 °C 下孵育 60 分钟。</li>
		<li>从培养箱中取出培养板，从每个孔中移除 40 µl 溶液。</li>
		<li>加入90 µl新鲜培养基，在32 °C下培养24小时。</li>
		<li>每孔加入 10 µl 基于刃天青的细胞活力溶液，在 32 °C 下孵育 4 小时。</li>
		<li>使用酶标仪测量荧光（λex = 540 nm，λem = 600 nm），具体操作按照制造商说明书进行。通过扣除空白培养基孔的平均背景值，并以DMSO对照组为基准进行归一化后，比较各孔的荧光强度以分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在化学生物学和药物化学领域，肽拟物（peptoids）正受到越来越多的关注，其应用包括新型治疗剂3-5、细胞递送载体18,20以及诊断工具29。通常，这些序列带有正电荷，以实现对病原体相对于哺乳动物细胞的选择性识别、穿透细胞膜的能力，并有助于在水相体系中的溶解性。文献中已有大量仅含有模拟赖氨酸或精氨酸残基的阳离子型肽拟物实例。然而迄今为止，由于缺乏合适的合成方法，同时在同一序列中包含这两种阳离子残基的肽拟物的合成一直受到阻碍。本文所述的方案可高效地合成混合阳离子型肽拟物，具有很高的应用价值，因为它为调控两亲性肽拟物的生物学和化学性质提供了可行途径。
我们的方法对常用的亚单体肽模拟物合成法进行了改进，可在同一序列中引入赖氨酸型和精氨酸型单体。该方法在室温下进行偶联反应，并采用成熟的保护基化学策略，因此预期可适用于大多数研究团队。为实现对精氨酸型残基的正交保护，首先在标准取代条件下加入未保护的二胺，随后使用Dde-OH在60分钟内完成保护。可选用多种不同链长的二胺，从而引入侧链长度为2至6个碳原子的取代基。 即， 1,2-乙二胺至1,6-己二胺。Dde-OH保护基在DMF中溶解性良好，是一种高效且选择性优异的伯胺保护基。Dde保护基对仲胺无影响， 例如未受保护的肽模拟物链N端。30 一个局限性在于所有合成步骤均为手动完成；然而，预计所开发的偶联条件将使该方法适用于自动肽/拟肽合成仪。
树脂上Dde保护基的脱保护使用2%肼的DMF溶液进行，以释放游离胺基，随后在树脂上利用吡唑-1-羧基脒对游离胺基进行胍基化反应。每摩尔树脂上的游离胺基使用6当量吡唑-1-羧基脒和6当量DIPEA。即，每种六个当量 NArg类型单体的偶联）。该反应效率同样较高，且吡唑-1-羧基脒试剂在DMF中具有良好的溶解性。室温反应60分钟后，通常可通过LC-MS检测确认反应完成。
由于亚单体法具有较高的通用性，在取代步骤中可使用多种多样的伯胺，因此可能需要优化条件以提高偶联效率、产物总收率或纯度。31 对于上述讨论的序列，无需特殊条件即可实现成功的偶联反应。然而，对于较难进行的取代反应，可采用更长的取代时间或更高的胺浓度。即，对于亲核性较差或空间位阻较大的胺类）。某些胺在DMF中可能无法完全溶解，此时建议将其溶解于 NN-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）或其他适用于固相反应的适当溶剂，如先前报道的亚单体合成肽拟态物的综合方法中所述。32 为了引入侧链中含有未保护杂原子的单体，其他研究团队已证实使用氯乙酸进行乙酰化是有效的。33 此外，该方法还可使用其他树脂，以获得具有不同C端官能团的肽拟物。王氏树脂和2-氯三苯甲基氯树脂在肽拟物的单体亚单元合成中被常规使用。例如，本课题组已成功将该方法应用于2-氯三苯甲基氯树脂。2 不同的固体载体需要采用与本文所述Rink Amide不同的负载方法（取决于所用的特定树脂），因此在合成前应查阅相关文献予以确认。
与多肽合成类似，从树脂上最终裂解peptoid的条件也可根据特定序列进行优化。本方案中使用了TFA裂解混合液（以三异丙基硅烷和水作为捕获剂）。本文所述peptoid仅含有Boc保护基团，该基团具有适度的酸不稳定性。为确保含有较多保护残基或酸不稳定性较低的保护基团的序列能够完全去保护，可能需要更长的裂解时间（即，对于含有Pbf或叔丁酯保护基团的序列，建议裂解时间超过2小时。对于具有特殊侧链的肽，也可使用其他替代性清除剂（例如，对于含有半胱氨酸或甲硫氨酸等含硫侧链的肽，常使用乙二硫醇或2-巯基乙醇）。
本实验所采用的生物学检测方法是一种标准的细胞毒性试验，可根据不同细胞系进行调整。需要注意的是，每块96孔板都应包含足够的对照，以确保所得结果的可靠性。在本实验中，两性霉素B作为阳性对照，因为它是治疗该疾病的已知药物；而DMSO作为阴性对照，因为它是用于配制化合物储备液的溶剂。如果使用其他细胞系，则应在使用前获取并验证合适的替代对照。将利什曼原虫（L. mexicana）与浓度范围为100至2 µM的拟肽（peptoid）共同孵育1小时，然后将寄生虫与拟肽的混合溶液稀释10倍，进行过夜孵育（即，最初含有100 µM拟肽储备液的孔，稀释后浓度为10 µM）。
在实验结束时，向每个孔中加入细胞活力试剂（占孔总体积的10%）。活力寄生虫孔（粉红色）、无活力寄生虫的对照孔（蓝色）以及活力寄生虫数量介于两者之间的孔之间，可观察到明显的颜色变化。荧光强度与活细胞数量成正比，反映细胞的代谢活性；在代谢活跃的细胞中，非荧光性的刃天青染料（resazurin）通过还原反应转化为荧光性的试卤灵（resorufin）34。本实验中，细胞活力试剂的孵育时间已针对L. mexicana进行了优化。当接种不同细胞浓度或不同细胞系（例如，该方法也可用于哺乳动物细胞）的孔板时，活力试剂的孵育时间可能有所不同。根据所使用的具体酶标仪型号，在进行荧光检测前需进行相应考虑。应去除孔中的任何气泡，以确保读数准确。某些酶标仪从孔板底部读数，此时应使用平底96孔板；其他仪器可能从孔板上方读数，因此在检测前应移除孔板盖。 
未来，本方案可能适用于能够并行合成多条序列的自动化合成仪。此外，利用该方法也可实现环状肽拟物的合成。本方案为研究人员提供了一种实用的合成步骤，可用于构建含有赖氨酸型和精氨酸型单体的新型肽拟物骨架，在材料科学或药物研发等多个领域具有潜在应用价值。

肽拟物（或聚-N取代的甘氨酸）是一类肽模拟物，具有与肽相似的性质，因此在药物和材料应用方面正受到越来越多的关注。在肽中，每个氨基酸的侧链连接在酰胺骨架的α-碳原子上；而在肽拟素（peptoids）中，侧链则连接在骨架氮原子上。这一关键结构差异使肽拟素具有更强的抗蛋白水解能力。
肽模拟物通常采用由Zuckermann首创的亚单体方法进行合成 等人， 其中，肽模拟物单体可通过将连接于固相载体上的氨基进行连续的卤代乙酰化，再用伯胺取代卤素原子而逐步构建。1 我们课题组近期对该亚单体方法进行了改进，首次实现了在同一肽模拟物序列中引入赖氨酸型和精氨酸型肽模拟物残基。2 这种手动固相肽拟物合成方法使用市售试剂和常见的实验室设备，使大多数实验室均可开展。研究表明，肽拟物对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌具有显著的抑制活性，其效果可与多种已知的抗菌肽相媲美。3-9
在我们的研究中，肽模拟物（peptoids）已被用作治疗被忽视的热带病——利什曼病的新型抗感染化合物。5,10 利什曼病在全球80多个国家呈地方性流行，估计全球有超过1200万人受到感染。11 该疾病由原生动物寄生虫引起，通过白蛉叮咬传播。Leishmania 属的寄生虫可导致皮肤利什曼病，这种病症会引起瘢痕形成以及黏膜组织损伤，也可导致危及生命的内脏利什曼病，后者会造成致命的器官损害。目前尚无针对该病的疫苗，现有治疗手段依赖少数几种具有严重副作用的药物。此外，对现有药物的耐药性正成为一个日益严重的问题，因此迫切需要开发新的治疗方法，以有效应对未来的利什曼病治疗需求。12-16
在这些抗菌应用中，通常将肽模拟物设计为具有两亲性，包含阳离子型和疏水性单体的混合物。3,4 这可使肽模拟物对细菌细胞具有一定的选择性，降低对哺乳动物细胞的毒性，并提高其作为分子转运体的活性。17-20 文献中大多数抗感染肽模拟物含有阳离子侧链，这些侧链完全由氨基官能化的赖氨酸型单体或精氨酸型残基组成。此外，还合成了肽-肽模拟物嵌合体，其中阳离子链由氨基酸赖氨酸或精氨酸构成，以研究阳离子基团对活性和毒性的影响。21-25
多聚赖氨酸类肽可利用市售的Boc保护胺通过简便的方法合成。已有报道的多聚精氨酸类肽可通过使用吡唑-1-羧基脒作为胍基化试剂的方法制备18。然而，该方法必须在类肽从树脂上裂解下来且侧链的Boc保护基团被去除后才能进行，因此序列中每一个赖氨酸型残基都会转化为精氨酸残基。为了更精确地调控化合物的化学与生物学性质，我们开发了一种新方法，首次实现了在同一类肽序列中引入双重阳离子功能（例如，NLys 和 NArg）2。
本文描述了两种新型肽模拟物的合成、纯化及表征，这些肽模拟物在同一序列中同时含有赖氨酸型和精氨酸型残基。该方法采用正交的N-Boc和N-Dde树脂保护策略，并以吡唑-1-甲脒作为胍基化试剂。本文还描述了这些肽模拟物在针对引起皮肤利什曼病的病原体——墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana）的细胞毒性实验中的生物学评价。该方法为获得具有双重阳离子功能的肽模拟物及其生物活性评估提供了实用途径。预计该方法将有助于未来肽模拟物研究领域合成两亲性肽模拟物。

<table><tbody><tr><td>聚丙烯固相萃取小柱（带两个筛板）</td><td>Crawford Scientific</td><td>12131017 和 12131015</td><td>本制备中使用的 20 ml 和 6 ml 羧酸酯柱</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>东京化工产业（欧洲）</td><td>T0431-100g</td><td>&gt;98%；注意：可引起严重灼伤和呼吸道刺激</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&#039;&lt;/em&gt;二异丙基碳二亚胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td><td>&gt;98%；注意：对眼睛、皮肤和呼吸道吸入有害，可能引起过敏反应</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>HPLC 级；注意：疑似致畸物</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fischer Scientific</td><td>10407440</td><td>高效液相色谱级</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Fischer Scientific</td><td>10354263</td><td>99.8%；注意：疑似致癌物</td></tr><tr><td>溴乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>&gt;99%；注意：可引起灼伤，对皮肤、眼睛和呼吸道有害</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-(-)-α-甲基苄胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>115568-100G</td><td>98%；注意：吞食有害，与皮肤接触有毒，可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤，用于合成 Nspe 单体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,4-二氨基丁烷</td><td>东京化学工业（欧洲）</td><td>A1373-25g</td><td>&gt;98%；注意：可引起严重皮肤灼伤和眼损伤，用于合成 NLys 单体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,2-二氨基乙烷</td><td>东京化学工业（欧洲）</td><td>A1371-25g</td><td>&gt;97%；警告：可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤，用于合成 Nae 单体</td></tr><tr><td>1,2-二氨基丁烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D13208-100G</td><td>99%；警告：易燃液体和蒸气，吞咽或吸入有害，皮肤接触有毒，可引起严重皮肤灼伤和眼损伤，用于NhArg单体的合成</td></tr><tr><td>1,4-二氨基乙烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td><td>&gt;99.5%；警告：易燃液体和蒸气，吞咽或吸入有害，皮肤接触有毒，可引起严重皮肤灼伤和眼损伤，用于NnArg单体的合成&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402516-10G</td><td>以盐酸盐形式；注意：吞食有害，可能引起过敏性皮肤反应，造成严重眼损伤</td></tr><tr><td>一水合肼</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>试剂级；注意：疑似致癌物，吸入致命，对皮肤和眼睛可造成严重灼伤</td></tr><tr><td>2-乙酰基二甲酮</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink Amide 树脂</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 目，高载量</td></tr><tr><td>哌啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>&gt;99.5%，属于管制物质，购买前必须获得适当许可；注意：高度易燃液体和蒸气，吞食有害，与皮肤接触或吸入有毒，可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤，对水生生物有害并具有长期持续影响</td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%；警告：易燃液体和蒸气，可引起皮肤刺激和严重眼刺激</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>施奈德昆虫培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>粉末状培养基需按照生产商说明书在使用前配制；用于生物学实验前，需使其升温至室温</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>平底（便于从底部进行荧光检测）、组织培养处理</td></tr><tr><td>溶剂储液罐</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>使用多通道移液器</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Starlab 集团</td><td>S1111-3810，S1113-1810，S1111-6810</td><td>移液器枪头的体积取决于所使用的移液器。10&amp;nbsp;&amp;micro;l，10 - 200&amp;nbsp;&amp;micro;l 和 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l 建议用于检测</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; 细胞培养瓶</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（分子生物学级）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>缩写：P/S</td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>两性霉素B三水合物，VetranalTM 分析标准品</td></tr></tbody></table>

一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

本方案描述了含有两种不同功能化阳离子单体的线性肽拟物的手动固相合成方法。在此过程中，可在同一肽拟物序列中引入氨基功能化的“赖氨酸”和胍基功能化的“精氨酸”肽拟物单体。该方法采用树脂上保护策略，使用N-(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚乙基))乙基（Dde）保护基，其保护条件与赖氨酸单体的Boc保护正交。随后进行的脱保护步骤可高效地在树脂上进行胍基化反应，从而形成精氨酸残基。该方案与常用的肽拟物亚单体合成法兼容，可使用常规实验室设备和市售试剂制备简单的肽拟物。文中还描述了两种混合肽拟物的代表性合成、纯化与表征过程。此外，介绍了这些化合物在针对Leishmania mexicana的筛选实验中作为潜在抗感染剂的评价方法。L. mexicana是一种原虫寄生虫，是皮肤利什曼病的致病因子，该病为一种被忽视的热带病，全球感染人数高达1200万。

作为代表性结果，将描述两种含有两个赖氨酸型单体和两个精氨酸型单体、各由12个残基组成的肽拟物的合成与表征。同时也展示了细胞毒性实验的后续结果。
两种肽拟物[(NnArgNspeNspe)(NaeNspeNspe)]2 (a) 和 [(NhArgNspeNspe)(NLysNspeNspe)]2 (b) 采用各120 mg Rink Amide树脂（载量 = 0.79 mmol/g）合成。所有乙酰化和取代步骤均按上文所述进行，所用试剂均为商业购买。对于这些残基，取代步骤中使用的胺分别为：Nspe (S)-(-)-α-甲基苄胺，Nae N-(tert-丁氧羰基)-1,2-二氨基乙烷，NLys N-(tert-丁氧羰基)-1,4-二氨基丁烷。对于精氨酸衍生物残基，采用以下未保护的二胺进行偶联：NhArg 1,4-二氨基丁烷或 NnArg 1,2-二氨基乙烷，随后在树脂上用2-乙酰基二甲基酮（Dde-OH）进行保护。整个序列合成完成后，通过肼解脱除Dde保护基，得到游离胺用于胍基化。
<img alt="两种肽的化学结构比较图；包含结构分析关键词。" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. Peptoid 结构 (a) [(NnArgNspeNspe)(NaeNspeNspe)]2 和 (b) [(NhArgNspeNspe)(NLysNspeNspe)]2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="化学合成过程示意图，显示了胺基保护与脱保护步骤及带有反应箭头的反应过程。" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 合成混合型精氨酸/赖氨酸肽模拟物的方法。 i. 采用二胺在亚单体法中的标准取代步骤；ii. 加入 Dde-OH，反应 90 分钟以保护游离胺基；iii. 继续采用亚单体法添加单元以延长肽模拟物链；iv. 使用含 2% 肼的 DMF 溶液脱除 Dde 保护基；v. 在树脂上利用吡唑-1-甲脒和 DIPEA 在 DMF 中对游离胺基进行胍基化；vi. 通过酸解从树脂上裂解产物并脱除 Boc 保护基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
从树脂上裂解并冻干后，粗产物为白色粉末：(a) 154 mg，(b) 163 mg。采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化产物，使用配备紫外-可见检测器（λ = 250 nm）的液相色谱泵，在分析柱（250 mm × 10 mm，5 µm）上进行，进样量不超过 50 mg，流速为 2 ml/min。收集对应目标分子量的组分，合并后得到白色粉末：(a) 54 mg，(b) 65 mg，最终收率约为 30%，产物纯度 >90%。
纯化后最终化合物的身份通过配备超高效液相色谱（UPLC）和光电二极管阵列检测器的三重四极杆质谱仪进行 LC-MS 分析确认（见图 3）。采用同一台质谱仪对 [M+2H]2+ 离子进行精确质量测定。测得以下计算值与实测值高度一致（图 4）：(a) 计算值 = 896.0026 amu，实测值 = 896.0038 amu；(b) 计算值 = 952.0691 amu，实测值 = 952.0730 amu。
<img alt="用于肽分析的液相色谱-质谱数据及TIC与质谱图。" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 纯化肽模拟物的液相色谱-质谱分析。 （a）m/z = 1,792 和 （b）m/z = 1,903。其中上方为总离子流图（TIC），中间为液相色谱-质谱图，下方为220 nm处的紫外色谱图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="质谱图，飞行时间质谱正离子模式，实测值与计算值对比，质荷比分析，肽类鉴定。" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. peptoid 的精确质谱数据（a）和（b）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
采用分析型反相高效液相色谱（RP-HPLC）评估产物纯度（使用分析柱 4.6 mm × 100 mm，3.5 µm，配备带紫外-可见光检测器的液相色谱泵；流速 = 1 ml/min），在220 nm处检测，该波长对应酰胺键骨架的吸光度。图5a 和 5b 显示化合物具有均一性。
<img alt="色谱结果；化合物分离分析的吸光度与保留时间关系图。" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 纯化后的肽模拟物 (a) 和 (b) 的分析型高效液相色谱。 采用 0–100% 流动相 B 的梯度洗脱，持续 30 分钟，柱温箱温度为 40 °C（流动相 A = 95% H2O, 5% MeCN, 0.05% TFA；流动相 B = 95% MeCN, 5% H2O, 0.03% TFA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
纯化的肽模拟物（a）和（b）在针对L. mexicana 无菌培养的无鞭毛体的细胞毒性实验中进行了测试。L. mexicana 的冻存菌种经解冻后，转化为适合实验的无鞭毛体阶段。解冻后72小时，寄生虫应处于对数生长期的昆虫阶段前鞭毛体，呈分裂循环形式，含有大量分裂中的细胞。此时可通过调节pH和温度转变条件，将寄生虫转化为无鞭毛体阶段27。转化第9天时，寄生虫将进入非复制性的感染性后鞭毛体阶段。最终在第14天，寄生虫应达到致病性无鞭毛体阶段，此时寄生虫失去前鞭毛体所具有的典型鞭毛结构28。
将化合物用细胞培养级 DMSO 配制成 5 mM 的储备液，并在至少两个独立实验中进行三次重复测试，以确保获得可靠的数据集。一个典型的 96 孔板设计如图 6所示。在实验结束时，向每个孔中加入细胞活力检测试剂，并按所述方法测定荧光值，以计算各测试浓度下寄生虫的存活率（见图 7）。计算得到的 ED50 值分别为：peptoid (a) >100 µM，peptoid (b) 37 µM。误差线表示孔间变异的标准差，可见大多数误差线的范围是合理的。
<img alt="详细说明两性霉素B、肽模拟物、DMSO药物筛选方案的稀释实验表格。" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 针对两种肽模拟物溶液（包含阳性和阴性对照）进行细胞毒性检测的代表性96孔板设计。 med+ = 培养基（Schneider's昆虫培养基，pH 5.5，含20% FBS，1% P/S）。L. mex. = 在med+中浓度为8 × 106/ml的寄生虫培养液。AmphoB = DMSO中5 mM溶液。Peptoid = DMSO中5 mM储备液。空孔应加入无菌水。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="存活率柱状图；化合物浓度影响肽模拟物A/B和两性霉素B；剂量-反应数据。" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7. 针对细胞毒性的检测结果 L. mexicana 使用肽模拟物（a）和（b）培养无菌无鞭毛体寄生虫。 可以看出，肽模拟物（b）在降低可存活寄生虫百分比方面比肽模拟物（a）更有效，且两种化合物均呈现剂量依赖性效应。误差线表示各孔之间的变异，以标准差形式展示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在同一序列中合成具有混合阳离子功能的肽模拟物（赖氨酸型和精氨酸型单体）的方案，并描述了这些化合物对引起皮肤利什曼病的原虫寄生虫Leishmania mexicana的后续测试方法。

本方案描述了含有两种不同功能化阳离子单体的线性肽拟物的手动固相合成方法。在此……

本实验的总体目标是在同一肽模拟物序列中引入赖氨酸型和精氨酸型单体，并评估这些化合物对引起被忽视热带病——皮肤利什曼病的病原体墨西哥利什曼原虫的活性。目前迫切需要为皮肤利什曼病开发新型治疗药物，而本实验方法有助于识别并开发肽模拟物作为该被忽视热带病的一类新型潜在抗感染药物。本方案的主要优势在于能够合成含有混合阳离子功能的肽模拟物。这是非常理想的，因为它有助于调控序列的生物活性。尽管该方法针对的是寄生虫的哺乳动物形态，但也可用于墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana）的昆虫阶段，或应用于哺乳动物细胞系。对该方法进行可视化演示非常有用，因为它展示了合成过程的逐步特性，以及在墨西哥利什曼原虫生活周期不同阶段的寄生虫培养情况。开始此实验步骤时，按照文本方案在二甲基甲酰胺中配制溶液。然后，向一个带有两个烧结滤片的带盖20毫升聚丙烯反应容器中加入0.1毫摩尔Fmoc保护的Rink酰胺树脂。加入5毫升二甲基甲酰胺，并在室温下静置60分钟。然后，使用固相萃取真空装置排干 DMF。接着，加入 2 毫升配制好的哌啶溶液。将容器置于摇床平台上，在室温下以 450 RPM 振荡 5 分钟。使用真空工作站排空溶液。随后加入2毫升哌啶溶液，在相同条件下振荡15分钟。振荡完成后，通过真空工作站排空溶液。加入 2 毫升 DMF，混匀 30 秒以洗涤树脂。排干 DMF，并重复洗涤三次。开始单体亚单元合成时，加入 1 毫升配制好的溴乙酸溶液和 0.2 毫升配制好的 DIC 溶液。在室温下振荡20分钟。然后倒出溶液，并用二甲基甲酰胺（DMF）每次2毫升，洗涤三次。加入1毫升制备好的胺溶液。然后，在室温下将树脂振荡60分钟。弃去溶液，并用二甲基甲酰胺（DMF）每次2毫升，洗涤树脂3次。接着，加入1毫升溴乙酸溶液和0.2毫升N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）溶液。室温下振荡20分钟。然后倾去溶液，每次用2毫升DMF洗涤，共洗涤三次。为了引入胍基功能化单体，向树脂中加入1毫升未保护的二胺溶液。室温下振荡60分钟。然后，倒掉溶液，并用2毫升DMF洗涤树脂三次。加入0.5毫升配制好的2-乙酰基二甲酮溶液。室温下振荡60分钟。然后倾去溶液，并用2毫升DMF洗涤树脂三次。继续进行单体亚单元合成，直至获得目标序列。然后加入 4 mL 配制好的肼溶液，在室温下振荡 3 分钟。弃去溶液，重复此步骤 3 次。随后用 2 mL DMF 洗涤树脂，每次洗涤重复 3 次。在peptoid序列中每个游离胺上加入DIPEA和六当量的吡唑-1-羧基脒。室温下振荡反应60分钟。振荡结束后，除去溶液。用二氯甲烷每次2毫升，洗涤树脂三次。将树脂在空气中干燥10分钟，保存以备后续使用。在加入胺类试剂后，可进行小规模裂解以检测合成反应的进展情况。开始最终裂解时，向合成所用的同一烧结反应柱中加入 4 毫升裂解混合液，并盖住反应容器。在室温下震荡反应 90 分钟。随后，利用烧结反应柱将裂解混合液从树脂中过滤至圆底烧瓶中。使用旋转蒸发仪蒸发裂解混合液。加入2毫升无水乙醚以沉淀肽拟物。用移液器吸除乙醚并弃去。然后，重复乙醚沉淀三次。沉淀完成后，将粗品肽拟物溶解于10毫升配制好的乙腈和酸化水溶液中，转移至已称重的容器中。然后，在-20摄氏度下冷冻，并冻干成干燥粉末，以备进行反相高效液相色谱纯化。在培养利什曼原虫墨西哥株（Leishmania mexicana）并转化为无菌无鞭毛体阶段后，按照文本方案中的说明制备化合物储备液，开始进行细胞毒性检测。按照文本方案中的说明，将5毫摩尔的肽模拟物储备液、两性霉素B对照品和DMSO对照品各2微升加入96孔板的最上一排。使用多通道移液器，向最上一排加入 48 微升新鲜培养基。向其余所有排加入 25 微升新鲜培养基。接下来，从最上一排吸取 25 微升溶液，加入下一排并混匀，以此进行连续梯度稀释。对整块板进行重复稀释，弃去从最底行吸取的最后25微升。然后，将寄生虫培养物转移至50毫升离心管中。在447 × g条件下离心5分钟。弃去旧培养基，加入10毫升新鲜培养基。随后用移液器将寄生虫沉淀在新培养基中轻轻重悬。使用改进型Neubauer血细胞计数板进行计数，并将培养物稀释至每毫升含800万个寄生虫。培养物稀释后，向每孔加入25 µL寄生虫。在32 °C条件下孵育平板60分钟。孵育结束后，从每孔中移除40 µL溶液。向每个孔中加入 90 µL 新鲜培养基，在 32 °C 下培养 24 小时。然后，向每个孔中加入 10 µL 基于刃天青的细胞活力检测溶液，在 32 °C 下继续培养 4 小时。孵育完成后，使用酶标仪测量荧光。通过减去平均背景值，并将归一化后的各孔荧光值与DMSO对照组进行比较，分析数据。在本研究中，分别使用120毫克Rink酰胺树脂合成了两种肽拟物。产物通过反相高压液相色谱进行纯化，收集对应目标分子量的组分，并以白色粉末形式获得。此处显示两种肽拟物的收率约为30%（纯度超过90%的组分）。通过分析型反相高效液相色谱评估产物纯度，并在220纳米波长下检测，该波长对应酰胺骨架的吸光度。两种peptoid均显示出均一性。此处展示了针对L. Mexicana的细胞毒性实验的代表性结果。化合物用细胞培养级DMSO配制成5 mM的母液，并至少重复两次、每次设三个复孔进行测试，以确保数据的可靠性。可以看出，肽模拟物B在降低可存活寄生虫百分比方面比肽模拟物A更有效，且两者均呈现剂量依赖性效应。通过观看本方法视频，您应能够充分掌握如何合成、表征和纯化含有赖氨酸型和精氨酸型单体的肽模拟物，并了解如何将其应用于墨西哥利什曼原虫的细胞毒性检测。我们向肽模拟物中引入双重阳离子功能的方法，仅在常用的亚单体肽模拟物合成法基础上增加了一个简单的步骤。采用该方法，可添加不同长度的赖氨酸或精氨酸型亚单体，以增加文库的多样性，例如侧链长度为二至六个碳原子的亚单体。在进行肽拟物合成时，必须特别注意在各步骤之间充分洗涤树脂，以防止产生非预期的插入或缺失副产物。该方法为研究人员探索混合阳离子功能化肽拟物的生物活性，并将其活性与仅含赖氨酸或精氨酸型单体的肽拟物进行比较，提供了可行路径。最后，请务必注意，本实验方案中使用的寄生虫及多种试剂可能具有极高危险性。因此，必须始终佩戴适当的个人防护装备，并在必要时于通风橱或生物安全柜内进行操作。

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Research

科研

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Biochemistry

生物化学

对于拟肽与他们抗利什曼原虫活性混合赖氨酸型/精氨酸型单体及评价合成的有效方法

本文概述了一种简单且通用的手动肽拟态物合成方法，该方法仅需基本设备和市售试剂，可在大多数实验室中轻松实现肽拟态物的合成。文中详细描述了由36个单体组成的两亲性肽拟态物的合成、纯化与表征过程，并阐述了其自组装形成高度有序纳米片的特性。...

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基于多胺的自组装肽两亲分子（PPAs）及相关生物材料的简便合成方案

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OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定

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抗菌肽及其模拟物的制备与检测

学习利用固相合成技术制备含赖氨酸型和精氨酸型单体的拟肽，并评估其对墨西哥利什曼原虫的抗寄生虫活性。该方法为开发新型抗感染药物提供了有效途径。

一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

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