使用系绳上的锍中心构建环肽
2022年9月28日
该协议介绍了通过半胱氨酸和蛋氨酸之间的双烷基化以及由炔丙基锍中心触发的简单硫醇 - 炔反应 合成 环肽。
在该协议中，构建了锍盐，可以充当与蛋白质半胱氨酸在特殊接近处反应的新手。该技术的优点是该反应快速高效，并且不含Met催化剂，并开发了一种简单有效的稳定肽的方法。首先，在500毫升烧杯或烧瓶中制备20%哌啶或50%吗啉和DMF的N-末端9-芴基-甲基氧羰基脱保护溶液。
然后，向色谱柱中加入10毫升脱保护溶液，并向溶液中注入氮气30分钟或两次，持续5分钟。通过真空泵排出溶液，并依次用二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂五次。要检测树脂为深黄色溶液，在少量树脂中加入一毫升N，N-二甲基甲酰胺，并向玻璃管中加入200微升5%茚三酮。
在130摄氏度下加热三分钟，以评估树脂颜色的变化。对于肽的偶联，在聚丙烯管中制备手稿中所述的混合物溶液，并将其溶解在三毫升N，N-二甲基甲酰胺中。然后，向溶液中加入173微升N，N-二异丙基乙胺或154微升N，N'二异丙基碳化二亚胺以使氨基酸失活。
接下来，将混合物加入装有树脂的色谱柱中，并用氮气鼓泡两个小时。偶联后，在少量树脂中加入1毫升N，N-二甲基甲酰胺，向玻璃管中加入200微升5%茚三酮。在130摄氏度下加热三分钟，同时树脂变为无色，这证实了在脱保护步骤之前没有游离氨基。
排干溶液后，如前所述洗涤树脂，并向色谱柱中加入10毫升脱保护溶液。然后，用氮气搅拌 30 分钟或两次，持续 5 分钟。再次，添加新鲜的溶液。
向带有树脂的色谱柱中加入10毫升无水甲醇进行脱水，并用氮气干燥以备下次使用。称取100毫克树脂到柱中，并在偶联步骤之前用二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂。通过在100毫升烧杯或烧瓶中加入三氟乙酸，三异丙基硅烷和二氯甲烷混合物来制备用于去除三苯甲基-L-半胱氨酸保护基的溶液，以除去保护基。
向色谱柱中加入5至10毫升制备的溶液以除去保护组10分钟。用氮气鼓泡重复六次，直到黄色完全消失。通过真空泵排出溶液后，如前所述清洗树脂。
然后，通过在50毫升烧杯或烧瓶中加入二卤接头和N，N-二异丙基乙胺与N，N-二甲基甲酰胺，制备与脱保护半胱氨酸反应的溶液。向色谱柱中加入5至10毫升的反应溶液，与受保护的半胱氨酸反应至少3小时，氮气鼓泡。同样，通过真空泵排出溶液并按顺序洗涤树脂，如前所述。
为了制备肽环化溶液，将三氟乙酸混合物加入通风橱中的20毫升烧杯或烧瓶中进行肽环化。然后，将5至10毫升的混合物溶液加入聚丙烯管中，并在三氟乙酸混合物下将树脂切割三小时。在脱水和洗涤树脂之前演示的偶联步骤之前，制备1%甲酸水溶液和1毫摩尔丙炔基溴，并加入到蛋氨酸肽溶液中。
接下来，在室温下摇动蛋氨酸和炔丙基溴的偶联反应12小时。反应后，将产物溶解在聚丙烯管和乙腈中，并通过0.22微米的过滤膜过滤。然后，立即通过反相HPLC纯化溶液，并将其冷冻干燥成粉末以备下次使用。
采用HPLC和LCMS光谱对半胱氨酸和蛋氨酸双烷基化合成的环状肽进行了表征， 结果表明差向异构体具有不同的保留时间和相同的分子量.差向异构体及其偶联产物的HPLC迹线证明了环肽与其产物之间的时间依赖性转化。采用LCMS法测定硫醇-炔型反应合成的环肽分子量，并用HPLC分离纯化肽。
通过质子核磁共振和异核单量子相干光谱进一步表征了肽，揭示了其化学位移。获得了环状肽与二硫苏糖醇和氧化氘之间时间依赖性转化的质子核磁共振波谱，以探索肽因锍环打开而具有的稳定性。结果表明，24 h后未形成添加物或开环产物。
该程序建立了合成环肽的有效策略。该反应表示，通过形成稳定环化肽的确认，选择性也得到了增强，表明环肽是有前途的药物催化剂。
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概述
本协议介绍了通过半胱氨酸和蛋氨酸之间的双烷基化以及由丙炔基砜中心触发的容易的硫醇-炔反应来合成环状肽。该方法高效，不需要Met催化剂，为稳定肽提供了一种直接的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 肽合成
背景
- 砜盐作为与半胱氨酸反应的物种。
- 该技术提供了快速高效的反应。
- 简化了肽的稳定化。
- 利用去保护溶液进行树脂制备。
研究目的
- 开发一种新的合成环状肽的方法。
- 提高肽稳定化的效率。
- 消除过程中对Met催化剂的需求。
使用的方法
- 使用哌啶或吗啉制备去保护溶液。
- 用二氯甲烷和DMF顺序清洗树脂。
- 使用宁氏试剂检测树脂颜色变化。
- 应用氮气泡沫促进反应。
主要结果
- 该方法成功稳定了环状肽。
- 在没有Met催化剂的情况下实现了快速反应时间。
- 树脂显示出明显的颜色变化，表明合成成功。
- 该协议对研究人员来说简单高效。
结论
- 该协议提供了一种环状肽合成的新方法。
- 它提高了肽稳定化技术的效率。
- 该方法对该领域的研究人员来说易于使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cyclic peptides are increasingly prioritized in drug discovery pipelines due to their stability and bioactivity, but scalable, efficient synthesis remains a bottleneck. The on-tether sulfonium center protocol enables rapid, catalyst-free cyclization, supporting robust generation of structurally diverse cyclic peptides. This capability enhances early-stage target validation and accelerates the transition from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables efficient synthesis of cyclic peptides for probing biological pathways and target engagement.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing stable, well-defined peptide scaffolds.
- Supports predictive confidence in target validation through reproducible peptide generation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized cyclic peptide libraries suitable for high-throughput screening workflows.
- Ensures reproducibility and purity via HPLC and LC-MS characterization.
- Provides quantitative outputs for reliable compound evaluation and assay calibration.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery to preclinical studies by generating peptides with confirmed stability profiles.
- Supports translational biomarker alignment through structurally consistent peptide reagents.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming peptide integrity under physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This synthesis protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a scalable route to cyclic peptide generation for downstream screening and preclinical validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway interrogation with rapid access to cyclic peptide probes.
- Screening: Supplies assay-ready peptides with validated purity and molecular weight for robust screening campaigns.
- Analytics: Employs HPLC, LC-MS, and NMR for quantitative assessment and structural confirmation.
- Translational Research: Maintains peptide stability and integrity for preclinical model evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synthesis platform adaptable to diverse peptide sequences and research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in peptide-based target validation.
- Operational Value: Streamlines synthesis, purification, and characterization for scalable peptide production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by enabling early, reliable peptide evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of peptide-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in solid-phase peptide synthesis and analytical chemistry.
- Needs access to HPLC, LC-MS, and NMR instrumentation for quality control.
- Demands cross-team standardization of synthesis and purification protocols.
- Adaptable to various peptide sequences but may require optimization for specific residues.
- Stability and reactivity should be confirmed for each new peptide scaffold synthesized.
