Name: 使用系绳上的锍中心构建环肽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 学习利用锍中心构建环肽的合成方法，通过半胱氨酸与甲硫氨酸的双烷基化反应实现高效环化。该技术无需金属催化剂，可快速稳定多肽结构，为药物研发提供新策略。

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我们感谢国家重点项目&amp;中国#38;D计划（2021YFC2103900）；国家自然科学基金项目（21778009 和 21977010）；广东省自然科学基金（2022A1515010996 和 2020A1515010521）；深圳市科技创新委员会项目（RCJC20200714114433053、JCYJ201805081522131455 和 JCYJ20200109140406047）；深圳-香港脑科学研究院—深圳市基础研究机构项目（2019SHIBS0004）。作者感谢期刊提供的支持 化学科学， 英国皇家化学学会，参考文献30 有机化学杂志，美国化学会，参考文献31。

1. 仪器设备准备
警告：吗啉、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、三氟乙酸（TFA）、哌啶、乙醚和甲醇具有毒性、挥发性和腐蚀性。这些试剂可通过吸入、摄入或皮肤接触对人体造成伤害。进行所有化学实验时，应使用防护装备，包括一次性手套、实验服和护目镜。
<ol>
	<li>按照 图1 所示，使用 Rink-酰胺 4-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂，通过标准的手动 Fmoc 固相多肽合成法（SPPS）29 构建所有多肽底物。</li>
	<li>构建线性多肽可选择以下两种方法之一：其一，使用缩合剂 2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）和 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）作为试剂；其二，使用 1-羟基苯并三唑（HOBT）和 N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）作为酰胺缩合试剂。根据多肽序列选择合适的合成方案。</li>
	<li>为建立手动多肽合成装置，将改装后的真空固相萃取设备置于通风橱中，并连接三通旋塞。然后将聚丙烯滤芯或玻璃反应器安装在设备上，并接入氮气（N2）气体。 
	注：改装真空固相萃取设备时，需移除萃取管，保留真空密封系统。</li>
	<li>将 MBHA 树脂装入树脂填充柱中，并用 DMF 溶解。调节三通旋塞至 N2 鼓泡状态，然后使用连接真空系统的蠕动泵除去柱内溶剂。根据以下公式计算所需氨基酸或缩合剂的用量： 
	氨基酸（g）和缩合剂（g） = 树脂用量（g） × 树脂载量（mmol/g） × 当量数（5 eq） × 分子量（g/mol） 
	&#8203;注：根据偶联多肽的长度选择合适的树脂装载体积。使用多个当量（eq）的氨基酸可使反应更充分。液体试剂需根据密度换算为体积。5 eq 表示计算所得化合物的投入量放大五倍。</li>
</ol>
2. 树脂准备
注意：根据偶联肽的长度选择上样树脂的量。
<ol>
	<li>称取302 mg Rink-amide MBHA树脂（载量为0.331 mM/g）至柱中（20 mL储液罐）。加入5–10 mL DCM或DMF，通入N2鼓泡溶胀30分钟。</li>
	<li>随后关闭N2开关，打开真空泵抽滤开关以除去溶剂。接着依次用DCM（5–10 mL）和DMF（5–10 mL）各洗涤树脂5次。</li>
</ol>
3. N端Fmoc脱保护
注意：吗啉脱保护需要 30 分钟，而哌啶脱保护需要 5 分钟。
<ol>
	<li>配制N端9-芴甲氧羰基（Fmoc）脱保护溶液：在玻璃容器中配制足量（500 mL）的20%（v/v）哌啶或50%（v/v）吗啉的DMF溶液，用于Fmoc基团的脱保护。</li>
	<li>向柱中加入10 mL去保护溶液，通入N₂鼓泡2 到……中&#160;溶液中孵育30分钟，或每次5分钟重复2次，并重复脱保护步骤2次。</li>
	<li>用真空泵抽干溶液，并用二氯甲烷（5–10 mL）和 N,N-二甲基甲酰胺（5–10 mL）依次洗涤树脂，各洗 5 次。</li>
	<li>每次脱保护后，使用5% 茚三酮（Kaiser试验）检测树脂，若溶液呈深黄色则表明Fmoc基团已完全去除，方可进行下一步偶联反应。具体操作如下：取少量树脂加入1 mL DMF，再加入200 µL 5% 茚三酮溶液至玻璃管中，于130 °C加热3 min，观察树脂颜色变化。</li>
	<li>用真空泵抽干溶液，并用二氯甲烷（5–10 mL）和 N,N-二甲基甲酰胺（5–10 mL）依次洗涤树脂，各洗 5 次。</li>
</ol>
4. 连接线性肽（图2）
注意：当合成肽序列包含两个或更多重复单元时，可直接选择氨基酸类型（如 Fmoc-AA-OH 或 Fmoc-AAA-OH 等）进行偶联反应。对于具有空间位阻的某些特殊氨基酸或较长氨基酸序列的肽，需适当延长偶联反应时间。
<ol>
	<li>以单个偶联步骤为例，以Cys残基的偶联为例（合成300 mg树脂规模）。在聚丙烯管中配制混合溶液，包含Fmoc-Cys(Trt)-OH（5当量，292 mg）和HATU（5当量，206 mg），或Fmoc-Cys(Trt)-OH（5当量，292 mg）和HOBT（5当量，106 mg），并用3 mL DMF溶解。</li>
	<li>向Cys溶液中加入173 µL DIPEA（10当量）或154 µL DIC（10当量）以活化氨基酸。让混合物预活化1分钟。将该混合液加入装有树脂的柱中，并用N2鼓泡反应2小时。 
	注：具体反应时间应根据5%茚三酮检测结果进行标准化确定。</li>
	<li>偶联完成后，取少量树脂加入1 mL DMF，再取200 µL 5%茚三酮溶液加入玻璃管中，在130 °C加热3分钟。观察树脂是否变为无色，以确认去保护步骤前无游离氨基存在。</li>
	<li>使用真空泵抽干溶液，并依次用DCM（5–10 mL）和DMF（5–10 mL）各洗涤树脂5次。</li>
	<li>向柱中加入10 mL去保护溶液，用N2鼓泡30分钟，或分两次每次5分钟，加入新鲜溶液后重复去保护步骤2次。</li>
	<li>重复以下步骤：Fmoc基团的去保护；检测树脂去保护程度；洗涤树脂；氨基酸偶联；检测偶联反应。重复偶联步骤直至所有肽链合成完成。 
	&#8203;注：使用Kaiser试验监测每一步去保护是否完全，以及每一步氨基酸偶联是否彻底。或者，可从树脂上切下少量肽段，通过LC-MS检测以确认偶联成功。</li>
</ol>
5. Met 与 Cys 之间的双烷基化（图3）
<ol>
	<li>通过重复步骤 4.1–4.6 构建含有 Met 和 Cys 的线性肽。在线性肽偶联完成后，向装有树脂的柱中加入 10 mL 无水甲醇进行脱水，并用 N2 吹干以备下次使用（重复 2 次）。</li>
	<li>将上一步得到的 100 mg 树脂称量后装入柱中（20 mL 储液器），在偶联步骤前依次用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂。</li>
	<li>配制用于去除 Cys 三苯甲基（trt）保护基的溶液。在玻璃容器中配制足量（100 mL）TFA/TIS/DCM（3:5:92）混合液，用于去除保护基。</li>
	<li>向柱中加入 5–10 mL TFA/TIS/DCM（3:5:92）溶液，反应 10 分钟以去除保护基。重复六次，并持续通入 N2 气泡，直至黄色完全消失。</li>
	<li>用真空泵抽干溶液，并依次用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂 5 次。</li>
	<li>配制与去保护 Cys 反应的溶液。在玻璃容器中配制足量（50 mL）反应混合液（DMF），其中包含二卤代连接子（2 当量）和 DIPEA（4 当量），用于与去保护的 Cys 反应。</li>
	<li>向柱中加入 5–10 mL 反应溶液，在通入 N2 的条件下反应至少 3 小时。反应完成后，用无水甲醇脱水，并用 N2 吹干以备后续使用。</li>
	<li>用真空泵抽干溶液，并依次用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂 5 次。</li>
	<li>配制用于肽环化的溶液：在通风橱内的玻璃容器中配制足量（20 mL）TFA 混合液（TFA:TIS:H2O = 95:2.5:2.5），用于肽环化反应。</li>
	<li>将 5–10 mL TFA 混合液加入聚丙烯管中，在 TFA 混合液中裂解树脂，反应 3 小时。 
	注意：TFA 具有强腐蚀性和刺激性，肽裂解过程应在通风橱中进行。</li>
	<li>执行步骤 7.1–7.5，通过反相液相纯化（HPLC）获得线性肽溶液。将溶液冷冻干燥以备后续使用。</li>
</ol>
6. 丙炔基锍盐环化反应（图4）
<ol>
	<li>通过重复步骤 4.1–4.6 构建含 Met 和 Cys 的线性肽。在线性肽偶联完成后，向装有树脂的柱中加入 10 mL 无水甲醇进行脱水，并用 N2 吹干以备下次使用（重复两次）。</li>
	<li>称取上一步得到的树脂 100 mg 置于柱中（20 mL 储液器），在偶联步骤前用 DCM（5–10 mL）和 DMF（5–10 mL）洗涤树脂。</li>
	<li>执行步骤 7.1–7.5，通过 HPLC 获得线性肽溶液，并如前所述将样品冷冻干燥，以备后续使用。</li>
	<li>配制 1% HCOOH 水溶液（体积比）和 1.0 mM 丙炔基溴（5 当量），加入至 Met 肽溶液中（0.2 mM，1 当量；0.2 mL MeCN/H2O [1:1, v/v]）。</li>
	<li>随后，在室温下振荡反应 12 小时，完成 Met 与丙炔基溴的偶联反应。</li>
	<li>反应结束后，将产物溶解于聚丙烯管中的乙腈中，并通过 0.22 µm 滤膜过滤。然后立即通过反相 HPLC 纯化溶液，并冷冻干燥成粉末以供后续使用。</li>
	<li>最后一步，将含丙炔基溴的肽加入聚丙烯管中，通过添加 (NH4)2CO3 溶液将反应体系 pH 维持在 8.0，并在 37 °C 下振荡反应 12 小时。此步骤得到丙炔基锍盐环肽。</li>
	<li>收集最终反应混合物：将其溶解于聚丙烯管中的乙腈中，并通过 0.22 µm 滤膜过滤。然后立即通过反相 HPLC 纯化溶液，并冷冻干燥成粉末以供后续使用。</li>
</ol>
7. 环肽的纯化
<ol>
	<li>通过重复步骤 4.1–4.6 在 Rink-酰胺 MBHA 树脂上构建线性肽底物。在线性肽偶联完成后，向装有树脂的柱中加入 10 mL 无水甲醇进行脱水，并用 N2 吹干以备后续使用（重复两次）。</li>
	<li>在通风橱中配制足量的裂解试剂（TFA/H2O/TIS，v/v/v，95:2.5:2.5）。向聚丙烯管中加入 1–5 mL TFA 混合溶液，在 TFA 裂解试剂中裂解树脂 3 小时。</li>
	<li>随后，在柱中用 N2 气流依次吹干树脂。或者，使用滤膜装置过滤树脂并收集肽溶液。然后向肽溶液中加入 20 mL 乙醚以沉淀肽，于 3,500 × g 离心 5 分钟，重复两次。收集粗肽沉淀物，并在 N2 气流下吹干以进行下一步操作。</li>
	<li>将 200 mg 粗肽溶解于 4 mL 乙腈-水溶液中，置于聚丙烯管内，经 0.22 µm 滤膜过滤。将滤液转移至 HPLC 进样小瓶内衬中，将内衬放入配备 C18 5 µm、4.6 mm × 250 mm 色谱柱和 1 mL 进样环的半制备型反相 HPLC 系统的自动进样器中。</li>
	<li>采用含 0.1% TFA 的水相与乙腈进行梯度洗脱（5%–95% 乙腈，30 分钟），纯化并分离肽，同时在 254 nm 处监测 HPLC 谱图。通过 LC-MS 确认肽的分子量，收集目标肽溶液，并冷冻干燥成粉末以供后续使用。</li>
</ol>

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<li>Shi, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+stapling+of+unprotected+peptides+via+chemoselective+methionine+bisalkylation%2Fdealkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation.</a> Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).</li>
<li>Merrifield, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+synthesis.+Nobel+lecture%2C+8+December+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984.</a> Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).</li>
<li>Wang, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+tethered+peptide+ligand+rapidly+and+selectively+modifies+protein+cysteine+in+vicinity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity.</a> Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).</li>
<li>Hou, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+triggered+thiol-yne+reaction+for+cysteine+modification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification.</a> The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).</li>
<li>Reguera, L., Rivera, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+reaction+toolbox+for+peptide+macrocyclization+and+stapling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的合成方法提供了一种利用肽序列中的Cys和Met合成环肽的途径，其中基本的线性肽通过常规的固相肽合成技术构建。对于Cys与Met之间的双烷基化环肽合成，整个合成路线可分为三个主要步骤：树脂上Cys的脱保护、连接子的偶联，以及在三氟乙酸裂解溶液中Cys与Met之间的环化反应。值得注意的是，Cys保护基的去除被发现是后续成环反应的关键步骤。因此，需对Trt-Cys进行脱保护处理，直至溶液不再呈现明显的黄色为止。进一步研究表明，通过Cys与Met之间双烷基化方法开发的环肽可拓展应用于多种肽的环合，前提是该肽含有Cys和Met这两种氨基酸。此外，肽序列和连接子也可根据实验设计进一步调整（图5）。因此，有必要通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）对合成过程进行监测。
对于硫醇-炔型反应中的环状肽，首先在树脂上通过常规的固相肽合成技术构建线性肽，随后在液相溶液中进行以下反应。粗肽从树脂上裂解后，通过反相高效液相色谱法进行纯化。将肽溶液与炔丙基溴混合，加入0.2 mL的MeCN/H2O (1:1, v/v) ...

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）1在药物研究与开发中发挥着关键作用。通过化学手段构建具有固定构象的稳定化多肽，是开发PPI模拟基序的最重要方法之一2。迄今为止，已有多种靶向PPIs的环状多肽被开发用于临床应用3。大多数多肽被限制为α-螺旋构象，以降低构象熵，并提高其代谢稳定性、靶标结合亲和力以及细胞通透性4,5。在过去20年中，研究人员已将Cys6,7、赖氨酸（lysine）8,9、色氨酸（tryptophan）10、精氨酸（arginine）11以及Met12,13的侧链引入非天然氨基酸中，以将多肽固定为环状构象。这类环状多肽可靶向独特的化学空间或特定位点，从而引发共价反应，形成蛋白质-多肽共价结合14,15,16,17。在Yu等人近期的一项研究中，氯乙酰胺被锚定在多肽配体的结构域上，实现了与蛋白质的高度特异性共价偶联反应18。此外，Walensky等人进一步将丙烯酰胺和芳基磺酰氟（ArSO2F）等亲电弹头引入多肽中19，以形成稳定的多肽共价抑制剂，并增强多肽抑制剂的抗肿瘤效果。因此，引入额外的功能基团以实现对蛋白质-多肽配体的共价修饰具有重要意义20。这些基团不仅能与多肽侧链上的蛋白质发生反应，还能稳定多肽的二级结构21。然而，由于合成路线复杂以及化学基团存在非特异性结合问题，由多肽配体诱导的共价修饰蛋白的应用仍受到限制22,23。因此，迫切需要开发有效的环状多肽合成策略。
受环肽多种策略的启发2,24,25,26，本实验方案旨在建立一种简单且高效的肽链稳定化方法。此外，我们注意到，当稳定肽的侧链基团在空间上接近肽配体时，可与靶蛋白发生共价反应。2013年，Deming课题组开发了一种新型选择性修饰肽甲硫氨酸的方法，填补了甲硫氨酸缺乏化学修饰手段的空白27。基于上述背景，Shi 等人聚焦于通过侧链成环形成锍盐中心的研究。当肽配体与靶蛋白结合时，锍盐基团可与空间邻近的半胱氨酸蛋白发生共价反应。近年来，Shi 等人设计了一种新的环肽稳定化方法28。该方法利用含巯基的还原剂将环肽上的锍盐还原，可逆地恢复为甲硫氨酸。然而，该反应效率较低，不利于后续的生物学应用研究。在本研究中，设计了甲硫氨酸-半胱氨酸以及丙炔溴-半胱氨酸的成环反应，使环肽侧链上保留单一的锍盐结构。该锍盐作为新型反应弹头，在空间邻近条件下可与蛋白中的半胱氨酸发生共价反应。简而言之，通过分子内烷基化反应，将含有半胱氨酸和甲硫氨酸突变的肽链环化，从而生成连接臂上的锍盐中心。在此过程中，侧链桥的形成对环肽至关重要。总体而言，本方案详细描述了一种基于锍盐的肽环化方法，该方法仅需简单的反应条件和操作步骤即可实现，旨在为拓展其在生物学领域的广泛应用提供一种潜在的技术途径。

<table><tbody><tr><td>1,3-双(溴甲基)苯</td><td>Energy</td><td>D0215</td><td></td></tr><tr><td>1,3-二甲基巴比妥酸</td><td>Energy</td><td>A46873</td><td></td></tr><tr><td>1H NMR 和 HSQC</td><td>Bruker</td><td>&amp;nbsp;AVANCE-III 400</td><td></td></tr><tr><td>1-羟基苯并三唑水合物</td><td>Energy</td><td>E020543</td><td></td></tr><tr><td>2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）</td><td>Energy</td><td>A1797</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基吡啶</td><td>Energy</td><td>Y31130</td><td></td></tr><tr><td>6-氨基己酸</td><td>Energy</td><td>A010678</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Energy</td><td>A01021454</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>碳酸铵</td><td>Energy</td><td>12980</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td>Energy</td><td>W330229</td><td></td></tr><tr><td>数字加热冷却干浴器</td><td>&amp;nbsp;Thermo Scientific</td><td>88880029</td><td></td></tr><tr><td>二异丙基乙胺（DIPEA）</td><td>Energy</td><td>W320014</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Energy</td><td>A10027</td><td></td></tr><tr><td>电喷雾电离质谱</td><td>SHIMADZU2020</td><td>&amp;nbsp;LC-MS2020</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R30101</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R30201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R30501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R30601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R30701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Boc)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R30902</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31001</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31301</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser(tBu)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31801</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(tBu)-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R31901</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td>R32001</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Energy</td><td>W810042</td><td></td></tr><tr><td>高效液相&lt;br/&gt; 色谱</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-2030</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>吗啉</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-二异丙基碳二亚胺</td><td>Energy</td><td>B010023</td><td></td></tr><tr><td>茚三酮试剂</td><td>Energy</td><td>N7285</td><td></td></tr><tr><td>丙炔基溴</td><td>Energy</td><td>W320293</td><td></td></tr><tr><td>Rink 酰胺 MBHA 树脂</td><td>南京肽研生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固相萃取（SPE）样品收集板</td><td>&amp;nbsp;Thermo Scientific</td><td>60300-403</td><td></td></tr><tr><td>四(三苯基膦)钯</td><td>Energy</td><td>T1350</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Energy</td><td>B010737</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>J&amp;K</td><td>101398</td><td></td></tr><tr><td>三异丙基硅烷（TIS）</td><td>Energy</td><td>T1533</td><td></td></tr></tbody></table>

利用连接臂上的硫鎓中心构建环状多肽

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

近年来，环肽因其优异的生物活性而在药物发现领域受到越来越多的关注，并已进入临床应用。因此，探索有效的环肽合成策略对其在药物发现领域的应用至关重要。本文报道了一种利用树脂上或分子内（分子间）双烷基化反应高效合成环肽的详细实验方案。采用该方案，通过固相肽合成技术，在树脂上同时偶联半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）来合成线性肽；进一步地，通过双烷基化反应合成环肽 通过 利用可调节的连接链和链上锍中心实现甲硫氨酸（Met）与半胱氨酸（Cys）之间的双烷基化。整个合成路线可分为三个主要步骤：树脂上Cys的脱保护、连接链的偶联，以及在三氟乙酸（TFA）裂解溶液中Cys与Met之间的环化反应。此外，受锍中心反应性的启发，将丙炔基引入Met以触发巯基-炔加成反应，从而形成环肽。随后，粗肽经干燥后溶于乙腈，通过高效液相色谱（HPLC）进行分离和纯化。采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）确认环肽的分子量，并进一步通过HPLC验证环肽在还原剂存在下的稳定性。此外，通过核磁共振分析了环肽中的化学位移 1氢核磁共振（1氢核磁共振（H NMR）谱图。总体而言，本方案旨在建立一种合成环肽的有效策略。

所有线性肽均采用标准手动Fmoc固相合成法在Rink-酰胺MBHA树脂上合成。如图5A所述，构建了一种模型环状六肽（Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2）。值得注意的是，通过甲硫氨酸烷基化反应生成了一个新的连接臂手性中心，两种差向异构体环肽（Ia、Ib）经反相HPLC确认。此外，通过反相HPLC峰面积积分确定了差向异构体的转化率及其比例。由线性六肽Ac-WMAAAC-NH2生成的环化产物Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH2（1-Ia和1-Ib）表现出不同的保留时间但具有相同的分子量（图5B）。接下来，进一步测试了该环肽对不同官能团的耐受性，结果如图5C所示。使用双卤素连接子评估了10种线性肽的成环效率，结果显示所有肽均能高效生成相应的环状肽。与其他环肽相比，一种具有高转化率的模型六环环肽产生了1:1的差向异构体比例，并可通过HPLC分离。然而，在某些情况下，肽的差向异构体在H...

本方案介绍了环状肽的合成方法 通过 半胱氨酸与甲硫氨酸之间的双烷基化反应，以及由丙炔基锍中心引发的高效硫醇-炔反应。

近年来，环肽因其优异的生物活性，在药物发现领域受到越来越多的关注，且由于……

在本实验方案中，构建了一种锍盐，该锍盐可作为一种新型“手”，在特定邻近位置与蛋白质中的半胱氨酸发生反应。该技术的优势在于反应快速高效，且无需甲硫氨酸催化剂，从而开发出一种稳定肽的简单高效方法。首先，在500毫升烧杯或烧瓶中配制含有20%哌啶或50%吗啉的N端9-芴甲氧羰基（Fmoc）脱保护溶液，并用DMF溶解。然后，向柱中加入10毫升去保护溶液，并通入氮气鼓泡30分钟，或分两次每次5分钟。用真空泵抽干溶液，再依次用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂五次。为检测树脂，取少量树脂加入1毫升N,N-二甲基甲酰胺，使其成为深黄色溶液，再向玻璃试管中加入200微升5%茚三酮溶液。在130摄氏度下加热三分钟，以评估树脂颜色的变化。进行肽偶联时，在聚丙烯管中按文中所述配制混合溶液，并将其溶于3毫升N,N-二甲基甲酰胺中。然后，向溶液中加入173微升N,N-二异丙基乙胺或154微升N,N'-二异丙基碳二亚胺，以使氨基酸失活。接下来，将混合物加入含有树脂的柱中，并用氮气鼓泡处理两小时。偶联反应完成后，取少量树脂加入一毫升 N, N-二甲基甲酰胺，再向玻璃试管中加入200微升5%茚三酮溶液。在130摄氏度下加热三分钟，若树脂变为无色，则表明在去保护步骤前已无游离氨基存在。排干溶液后，按先前所示方法洗涤树脂，并向柱中加入 10 毫升去保护溶液。然后用氮气鼓泡 30 分钟，或分两次每次鼓泡 5 分钟。再次加入新鲜溶液。向装有脱水树脂的柱中加入10毫升无水甲醇，并用氮气吹干，以备下次使用。称取100毫克树脂装入柱中，并在偶联步骤前用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂。在100毫升烧杯或烧瓶中加入三氟乙酸、三异丙基硅烷和二氯甲烷的混合液，配制溶液以去除三苯甲基-L-半胱氨酸保护基团。向柱中加入5至10毫升制备好的溶液，去除保护基团，反应10分钟。用氮气鼓泡重复此步骤六次，直至黄色完全消失。用真空泵抽干溶液后，按之前所示方法洗涤树脂。然后，将二卤代连接剂和N,N-二异丙基乙胺加入50毫升烧杯或烧瓶中的N,N-二甲基甲酰胺内，配制用于与脱保护半胱氨酸反应的溶液。向柱中加入5至10毫升该反应溶液，通入氮气鼓泡，与保护的半胱氨酸反应至少三小时。再次使用真空泵将溶液抽干，并按照前述方法依次洗涤树脂。在通风橱中，将三氟乙酸混合液加入一个20毫升的烧杯或烧瓶中，用于肽的环化反应。然后，取5至10毫升该混合液加入聚丙烯管中，在三氟乙酸混合液中裂解树脂，反应3小时。在偶联步骤之前，按照先前所述方法对树脂进行脱水和洗涤，随后配制1%的甲酸水溶液和1毫摩尔的丙炔基溴，并加入甲硫氨酸肽溶液中。接下来，在室温下将甲硫氨酸与丙炔溴的偶联反应振荡反应12小时。反应结束后，将产物溶解于聚丙烯管中的乙腈中，并通过0.22微米滤膜过滤。然后立即采用反相高效液相色谱法纯化该溶液，并将其冷冻干燥成粉末，以供后续使用。通过半胱氨酸与甲硫氨酸之间的双烷基化反应合成的环肽经HPLC和LCMS谱图表征，结果显示非对映异构体具有不同的保留时间但分子量相同。非对映异构体及其偶联产物的HPLC色谱图显示了环肽与其产物之间随时间依赖性的相互转化。通过LCMS测定采用硫醇-炔型反应合成的环肽的分子量，并通过HPLC对肽进行分离和纯化。通过质子核磁共振（NMR）和异核单量子相干谱进一步表征了这些多肽，揭示了其化学位移。为探究由于锍环打开导致的多肽稳定性变化，获得了环状多肽与二硫苏糖醇及重水在时间依赖性转化过程中的质子核磁共振谱。结果显示，在24小时后未形成任何加成或开环产物。该方法建立了一种合成环肽的有效策略。反应的选择性因形成稳定环化肽构象的结构而得到增强，表明环肽具有作为药物催化剂的良好前景。

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化学

使用系绳上的锍中心构建环肽

本文描述了一种利用HMBA树脂上“安全捕获”裂解方法高效固相合成功能化双肽三聚体的方案。...

采用“安全捕获”法固相合成功能化双肽

本文概述了一种利用微波辐射合成环肽的简单且通用的方法。该方法能够在保留侧链和药效团部分的同时，合成具有多种不同构象的骨架环肽，从而可用于筛选生物活性构象。...

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本文介绍了一种在同一序列中合成具有混合阳离子功能的肽模拟物（赖氨酸型和精氨酸型单体）的方案，并描述了这些化合物对引起皮肤利什曼病的原虫寄生虫Leishmania...

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通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

由于多胺类化合物含有多个氨基氮原子，因此基于多胺的肽两亲分子（PPAs）的合成具有较大挑战性，需要审慎使用保护基团来屏蔽这些活性官能团。本文中，我们描述了一种制备这类新型自组装分子的简便方法。...

基于多胺的自组装肽两亲分子（PPAs）及相关生物材料的简便合成方案

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1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

富含半胱氨酸的多肽根据其二硫键连接方式折叠成不同的三维结构。当缓冲氧化无法产生所需的二硫键连接时，需要对单个二硫键异构体进行定向合成。本实验方案涉及含三个二硫键的多肽的选择性合成，并利用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS/MS）对其进行结构分析。...

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通过简单的有机催化1,3-偶极环加成反应，可不对称合成对映体富集的双螺环[γ-丁内酯-吡咯烷-4,4'-吡唑啉酮]骨架。...

通过α-亚氨基-γ-内酯与亚烷基吡唑啉酮的有机催化环加成高效构建类药双螺环骨架

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一种用于固相多肽合成的商用微波反应器的低成本改装方案

学习利用锍中心构建环肽的合成方法，通过半胱氨酸与甲硫氨酸的双烷基化反应实现高效环化。该技术无需金属催化剂，可快速稳定多肽结构，为药物研发提供新策略。

利用连接臂上的硫鎓中心构建环状多肽

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