基于细胞的SINEUP非编码RNA检测方法，可特异性增强mRNA翻译

该方法有助于回答一些关键问题，例如如何通过利用细胞和组织中已存在的mRNA来正向调控基因的活性，如何补偿活性不足，以及如何在体外和体内实现mRNA的高效翻译。该技术的主要优势在于，我们可以通过成像手段在活细胞中对SINEUP的靶基因进行全基因组范围的筛选，而无需固定和收集细胞。

因此，该技术的应用意义延伸至单倍剂量不足病例的治疗，因为SINEUPs可使缺陷蛋白（如弗里德赖希共济失调病例中的frataxin蛋白）的表达量增加一倍。首先，打开Zenbu浏览器，点击感兴趣的Fantom项目数据库。搜索目标基因，并在目标细胞和组织中检查其转录起始位点（TSS）及表达水平。

为了确定转录起始位点（TSS），请参考帕金森病蛋白7（PARK7）mRNA 的示例分析。通过 CAGE 峰区域来确认 TSS。为了确定细胞和组织特异性的转录表达水平，选择 CAGE 峰区域，然后点击“放大所选基因组区域”。

通过浏览页面底部的转录表达列表，检测目标细胞和组织类型中PARK7的表达情况。然后，设计对应于起始甲硫氨酸（AUG）上游40个碱基和下游32个碱基的多个不同长度的结合域序列。在转染SINEUP之前，按照文章所述方法，将目标细胞接种于两块聚-D-赖氨酸包被的24孔板中。

在37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育24小时，使细胞融合度达到70%。接种细胞后，为确保细胞在孔板中分布均匀，需在洁净工作台内轻轻前后摇晃培养板10次，并在5% CO2培养箱中重复此操作。孵育结束后，更换为0.4 mL新鲜培养基。

为分析SINEUP-GFP，准备多个1.5 mL离心管，每管中加入0.1 mL混合溶液，包含pEGFP-C2、SINEUP-GFP、转染试剂和OptiMEM，并在室温下孵育20分钟。将每管中的0.1 mL混合溶液分别加入24孔板的独立孔中，并将这些孔标记为SINEUP-GFP一、二、三、四和五。将24孔板置于37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育24小时。

24小时后，用0.5 mL PBS洗涤细胞。每孔加入25 μL质量体积比为0.05%的胰蛋白酶，于5% CO2培养箱中孵育5分钟。每孔加入275 μL细胞培养基。

进行蛋白质提取时，取两个培养板中的一个，从一个孔中收集225 µL或四分之三的细胞用于蛋白质提取，另取75 µL或四分之一的细胞用于RNA提取，分别放入两个独立的1.5 mL离心管中。在4°C条件下以6000×g离心5分钟。离心后，小心移除标记为蛋白质分离的离心管中的上清液。

向细胞中加入60 µL裂解液，通过移液混匀，并在4°C下以低速旋转充分混匀1小时。在4°C下以14,000×g离心10分钟，收集蛋白上清液。为测定蛋白浓度，首先用超纯水将新鲜的牛血清白蛋白蛋白标准品稀释5至6倍，配制浓度范围为0.2至1.5 mg/mL的蛋白溶液。

在2 mL离心管中，向1 mL试剂A中加入20 µL试剂S，配制工作试剂A Dash混合液。每孔加入5 µL水作为阴性对照，然后每孔加入BSA标准品或蛋白样品。

每孔加入 25 µL A Dash 试剂，然后小心加入 200 µL B 试剂，避免产生气泡。用铝箔纸覆盖酶标板，在室温下孵育 5 至 8 分钟。使用分光光度计在 750 nm 处测定蛋白质吸光度。

通过将 BSA 标准蛋白浓度绘制在 x 轴上，其相应的吸光度绘制在 y 轴上，绘制标准曲线。应用标准曲线方程计算样品蛋白浓度。开始蛋白分离时，向每一体积的蛋白样品中加入一体积的 2x 上样染料。

在90摄氏度下加热五分钟，然后立即在冰上冷却一分钟。将10至20 µg蛋白质样品加入10% SDS聚丙烯酰胺凝胶中，在100至150 V条件下进行电泳分离。使用半干转印仪将蛋白质从凝胶转移至0.5 µm硝酸纤维素膜上。

用转移缓冲液在25 V条件下填充30分钟。转移完成后，将膜放入容器中，加入封闭液直至完全浸没膜，并在室温下轻轻摇动孵育30分钟。将适当的抗体加入封闭液中，然后铺加在膜上。

在室温下轻轻振荡孵育膜30分钟以进行杂交。杂交完成后，在室温下加入1×TBST缓冲液洗涤膜5分钟，并重复此步骤两次。随后，在室温下将二抗用封闭液稀释后加入膜上，轻轻振荡孵育30分钟，进行下一轮杂交。

然后在室温下用 1× TBST 缓冲液洗涤膜 5 分钟，并重复此步骤两次。将膜转移至含有 2 mL HRP 增强型 ECL 试剂混合液的盒子中。用铝箔覆盖盒子，在室温下孵育 1 至 2 分钟。

小心地将膜从ECL试剂混合物中取出，并使用化学发光成像仪进行曝光。为了通过成像分析SINEUP-GFP在细胞中的作用，用每孔0.5 mL的PBS洗涤第二个24孔板中的pEGFP-C2和转染了SINEUP-GFP的细胞。为了染色细胞核，向每孔加入2 µg Hoechst-33342，并在37°C下孵育20分钟。

使用高通量微孔成像细胞仪检测经Hoechst染色的细胞，以计数细胞总数。通过测量绿色荧光强度来计数GFP阳性细胞。为分析SINEUPs对蛋白表达的上调作用，使用成像软件确定GFP的整合荧光强度，将其计算为每个通道所获得的分割对象中所有显示信号的像素强度之和。

成功转染含有最佳结合域和效应域GFP的合成型SINEUP-GFP后，GFP mRNA的表达水平未发生改变，但其翻译水平显著上调。与传统的Western blot分析相比，半自动化的图像分析方案缩短了检测时间，并提高了同时筛查的样本数量。尽管信号强度在Western blot分析中为2.6倍，而在成像分析中为1.4倍，但与对照组相比，GFP荧光信号仍检测到显著升高。

进行该实验操作时，重要的是要记住识别目标 mRNA 的正确序列，以设计出正确的结合结构域。基因通常由启动子转录，并可能使用不同的翻译起始位点。Zenbu 浏览器是探索此类 mRNA 变异的非常有用的工具。

我们还建议设计具有不同结合位点的多种SINEUP分子。总体而言，我们认为，快速将SINEUP分子适配于多种靶标，将建立一个全新的研究领域，即对现有RNA的翻译过程进行正向调控，这与siRNA领域形成互补和对应关系。我们预期，该技术的一部分功能将在体外（如生物反应器）用于大量生产蛋白质，同时也可在体内用于自然纠正基因剂量。