基于细胞的 sineup 非编码 rna 检测, 可专门增强 mrna 的翻译能力

此方法可以帮助回答关键问题，例如如何利用细胞和组织中的 mRNA 来积极调节基因的活性。如何弥补活动缺陷，以及如何实现体外和体内mRNA的高翻译。这项技术的主要优点是，我们可以通过成像，无需固定和收集，在全球范围内筛选SINEUP在活细胞中的目标基因。

因此，这项技术的影响延伸到我们的治疗，以癌症的实例，因为SINEUPs可以诱导双倍增加的缺乏蛋白质，如弗拉塔辛在弗里德里希的厌食症的情况下。首先，打开Zenbu浏览器，然后单击感兴趣的范托姆项目数据库。搜索目标基因，并检查转录开始位点，或 TSS，和表达水平在所需的细胞和组织。

要确定 TSS，请参阅帕金森病蛋白七或 PARK7 mRNA 的示例分析。按笼峰区域检查 TSS。要确定细胞和组织特定的转录表达水平，请选择笼峰区，然后单击放大基因组区域进行选择。

通过浏览页面底部的脚本表达列表，检查感兴趣的细胞和组织类型的 PARK7 表达。然后，设计几个不同长度的绑定域序列，对应于上游的40个碱基，以及第一个基氨酸或8月下游的32个碱基。在与SINEUPS转染之前，在两个聚d-lysine涂层的24孔板上感兴趣的种子细胞，如手稿中所述。

在37摄氏度的CO2培养箱中孵育24小时，达到70%的汇合。在井中均匀分布细胞非常重要，为此，在将细胞播种到干净的长凳内后，来回轻轻摇动盘子10次，并在5%的CO2培养箱中重复。孵育后，将介质更改为0.4mL的新鲜介质。

用于分析SINEUP-GFP，用0.1mL的混合溶液制造几个1.5mL管，每个管中用pEGFP-C2、SINEUP-GFP、转染试剂和OptiMEM，然后在室温下孵育管20分钟。将这种混合溶液的0.1mL从每个管添加到24孔板的单独油井中，并用SINEUP-GFP一、二、三、四和五标记这些油井。在5%的CO2培养箱中孵育37摄氏度的板，24小时。

24小时后，用0.5mL的PBS清洗细胞。每体积尝试性增加25uL0.05%的重量，并在5%的CO2培养箱中孵育5分钟。每井加入275uL的细胞介质。

对于蛋白质提取，取两个板块中的一个，从一个井中收获225uL或四分之三的细胞，75uL或四分之一的细胞用于RNA提取，每个细胞进入一个单独的1.5mL管中。在摄氏四度下以 6000xg 的离心机 5 分钟。离心后，小心地从标有蛋白质隔离的管子上取出上清液。

将 60uL 的解液添加到细胞中，通过移液混合，在四摄氏度下以慢速旋转一小时，彻底混合。在4摄氏度下将管在14，000xg下离心10分钟，以收集蛋白质上清液。要确定蛋白质浓度，首先在超纯水中准备5至6倍的新鲜牛血清白蛋白蛋白标准，浓度在0.2至1.5mg/mL蛋白。

为了准备工作试剂，A Dash 混合将 20uL 的试剂 S 添加到 2 mL 管中的一 mL 试剂 A 中。添加五 uL 的水作为负对。然后，BSA标准或蛋白质样品在每个井。

加入25uL的试剂 A 短划线，然后仔细添加 200uL 的试剂 B，避免任何气泡形成。用铝箔盖住板，在室温下孵育，五至八分钟。使用分光光度计测量 750nm 的蛋白质吸收度。

通过绘制 x 轴上的 BSA 标准蛋白质浓度及其在 y 轴上各自的吸收度来准备标准曲线。应用标准曲线方程计算样本蛋白浓度。要开始蛋白质分离，在蛋白质样品的每个体积中加入一卷2倍的加载染料。

在 90 摄氏度下加热 5 分钟，立即在冰上冷却一分钟。将 10 至 20ug 的蛋白质样品加载至 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶，并在 100 至 150V 下分离。通过半干转移仪器将蛋白质从凝胶转移到0.5微米硝基纤维素膜。

在 25V 下填充传输缓冲液 30 分钟。转移后，将膜放在容器中，加入阻消溶液，直到膜完全浸泡，并在室温下孵育30分钟。摇动。将适当的抗体加入阻断溶液，并倒在膜上。

通过在室温下孵育膜30分钟，同时摇动膜进行杂交。杂交后，在室温下加入1x TBST缓冲液洗涤膜5分钟，再重复两次。在室温下在室温下摇动30分钟，用稀释的二次抗体进行下一次杂交。

然后在室温下加入1x TBST缓冲液5分钟，然后重复两次，清洗膜。将膜转移到装满两 ML HRP 增强型 ECL 试剂混合物的盒子里。用铝箔盖住盒子，在室温下孵育一到两分钟。

小心地从 ECL 试剂混合物中去除膜，并使用发光成像仪器将其暴露。要通过成像分析SINEUP-GFP在细胞中的效果，请用每井0.5mL的PBS清洗pEGFP-C2和SINEUP-GFP转切细胞。要染色核，在每孔中加入2ug的 Hoechst-33342，并在37摄氏度下孵育细胞，20分钟。

使用高通量微孔图像细胞仪测量霍赫斯特染色细胞，计算细胞总数。测量绿色荧光的强度，以计算GP阳性细胞的数量。要分析SINEUP的蛋白质上调节效应，使用成像软件确定GSP集成强度 计算它作为显示每个通道获得的分段物体中信号的所有像素强度的总和。

使用SINEUP-GFP（一种既包含最佳结合域和有效域GFP的合成SINEUP）成功转染后，mRNA翻译在不改变GFP mRNA的表达的情况下得到调节。与传统的西方印迹分析相比，半自动图像分析协议提高了检测时间，增加了同时筛选的样品数量。虽然信号强度有差异，从西方印迹分析的2.6倍到成像分析的1.4倍，但与对照组相比，检测到的GGFP荧光水平要高得多。

在尝试此过程时，必须记住确定目标 mRNA 的正确序列以设计正确的绑定域。基因通常从启动者转录，并可能使用不同的翻译启动网站。Zenbu 浏览器是探索此类 mRNA 方差的非常有用的工具。

我们还建议设计不同的SINEUP与可变绑定位点。总之，我们相信，迅速使SINEUPS适应多种目标，将建立一个新的领域，包括对现有RNA进行积极调节的转换，这是一个对西RNA领域的互惠和补充。我们设想，这项技术的一部分，将有助于产生更多的蛋白质在体外，如生物反应器，以及体内自然纠正基因剂量。