Name: 基于细胞的 sineup 非编码 rna 检测, 可专门增强 mrna 的翻译能力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习在活细胞中检测SINEUP非编码RNA的方法，利用Western blot和高通量成像技术分析其增强mRNA翻译的效果。该技术可用于基因治疗研究。

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本研究部分得到了日本医学研究开发署（AMED）创新生物医学基础科学与平台技术计划（项目编号：17am0301014）、日本文部科学省（MEXT）对理化学研究所生命科学技术研究中心的研究资助，以及日本文部科学省对理化学研究所IMS的研究资助。我们感谢PC实验室及SINEUP研究网络（SISSA、皮埃蒙特东部大学和理化学研究所）成员富有启发性的讨论。感谢Matthew Valentine博士在稿件校对方面提供的帮助。

1. 针对目标 mRNA 的 SINEUP 结构的 BD 区域设计
<ol>
	<li>在目标细胞中确认目的 mRNA 的转录起始位点（TSS）和翻译起始位点。从 ENCODE 和 FANTOM 项目（基因表达的帽子分析，CAGE）获取 TSS 数据（ZENBU：http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/）。</li>
	<li>打开浏览器，搜索感兴趣的基因，并通过 CAGE 峰检查 TSS。</li>
	<li>参考 图2 中展示的帕金森病蛋白7（PARK7）mRNA 在不同细胞和组织中 TSS 的示例分析。</li>
	<li>设计多个不同长度的 BD 序列，对应起始甲硫氨酸（AUG）上游 40 个碱基和下游 32 个碱基，共 72 个核苷酸。</li>
	<li>定制合成设计好的 BD 序列并克隆至 SINEUP 表达载体中（见 材料表）。 
	注意：使用基本局部比对搜索工具（BLAST）检查序列特异性，以避免脱靶效应26。</li>
</ol>
2. 细胞培养与SINEUP转染
<ol>
	<li>在转染SINEUP之前，将目的种子细胞接种于6孔板或24孔板中培养24小时。以人胚胎肾细胞系（HEK293T/17）为例（参见 材料表），接种 0.5 × 106 每孔6孔板的细胞数为1.5 × 10⁶5 每孔接种细胞数至多聚-D-赖氨酸包被的24孔板中（参见 材料表24小时后达到70%融合度。</li>
	<li>24 小时后，更换培养基，6 孔板每孔加入 1.5 mL 新鲜培养基，24 孔板每孔加入 0.4 mL 新鲜培养基。若为 SINEUP-GFP 实验，转染 0.6 µg pEGFP-C2（参见 材料表）以及在6孔板的一个孔中加入3.4 µg SINEUP-GFP，或在24孔板的一个孔中加入130 ng pEGFP-C2和670 ng SINEUP-GFP，并加入转染试剂（6孔板每孔10 µL，24孔板每孔3 µL），具体操作按照试剂生产商的说明书进行（参见 材料表，并在37 °C、5% CO2培养箱中孵育24 h。</li>
	<li>用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）（37 mM NaCl，8 mM Na2HPO4，2.6 mM KCl 和 1.5 mM KH）洗涤细胞2PO4) 加入6孔板的每个孔中，或0.5 mL PBS加入24孔板的每个孔中。仅对于聚-D-赖氨酸包被的24孔板，加入25 µL 0.05%（质量/体积）胰蛋白酶，于5% CO₂培养箱中孵育2 孵育5分钟，每孔加入275 µL细胞培养基。若使用6孔板，则每孔加入2 mL PBS。反复吹打以收集1孔中3/4的细胞（6孔板为1.5 mL，24孔板为225 µL）用于蛋白质提取（转至方案3进行蛋白质提取），以及1/4的细胞（6孔板为0.5 mL，24孔板为75 µL）用于RNA提取&#160; 在 4 °C 条件下以 6,000 × g 离心 5 分钟（进行步骤 5 提取 RNA）。 
	注意：&#160;在经多聚-D-赖氨酸包被的24孔板中，通过成像分析SINEUP-GFP的作用。进入第7步（成像分析）。</li>
</ol>
3. 蛋白质提取
<ol>
	<li>小心吸除 1.5 mL PBS，然后向细胞沉淀中加入裂解液：6 孔板每孔加 140 µL，24 孔板每孔加 60 µL（裂解液配方为 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1% (w/v) Triton、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸钠、1 mM Na3VO4、1 μg/mL 亮抑蛋白酶肽和 0.005% (w/v) 苯甲基磺酰氟 (PMSF)）（参见材料表）。</li>
	<li>用移液器吹打混匀，然后在 4 °C 下以低速旋转孵育 1 小时，充分混匀。在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液。</li>
	<li>通过比色法测定蛋白浓度（参见材料表）。所有反应均在室温下进行。
	<ol>
		<li>用超纯水将牛血清白蛋白 (BSA) 蛋白标准品稀释 5–6 倍，配制浓度范围为 0.2–1.5 mg/mL 的标准品溶液。每次实验均需新鲜配制标准品。</li>
		<li>将 1 mL 试剂 A（碱性铜酒石酸盐溶液）与 20 µL 试剂 S（表面活性剂溶液）混合，配制工作液 Aʹ。</li>
		<li>在 96 孔板的每个孔中分别加入 5 µL 水（阴性对照）、BSA 标准品（蛋白标准品及阳性对照）或蛋白样品。</li>
		<li>每孔加入 25 µL 试剂 Aʹ。每孔小心加入 200 µL 试剂 B（福林试剂），避免产生气泡。用铝箔纸覆盖板子，静置 5–10 分钟。</li>
		<li>使用分光光度计在 750 nm 处测定蛋白吸光度。吸光度在至少 1 小时内保持稳定。</li>
		<li>以 BSA 标准品的蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，对应吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线方程计算样品的蛋白浓度。 
		注意：如需暂停，可在本步骤停止实验流程，或继续进行第 4 步。如需长期保存，请将蛋白样品在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过 SDS-PAGE 进行蛋白质分离及使用抗体检测目标蛋白质（蛋白质印迹分析）
<ol>
	<li>向第3.3步得到的每一体积蛋白样品中加入等体积的2×上样缓冲液（0.1 M Tris-HCl（pH 6.8）、4% SDS、20%甘油、1.42% 2-巯基乙醇和0.2%溴酚蓝）。在90 °C加热5分钟，然后立即置于冰上冷却1分钟。</li>
	<li>将10–20 µg蛋白样品加入10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，在100–150 V电压下进行电泳分离（参见材料表）。</li>
	<li>使用半干转印仪，以转膜缓冲液（25 mM Tris、192 mM 甘氨酸和20%甲醇）将蛋白从凝胶转移至0.45 µm硝酸纤维素膜（参见材料表），25 V条件下转印30分钟。</li>
	<li>向容器中加入封闭液（含5%脱脂奶粉的1×TBST缓冲液（137 mM NaCl、20 mM Tris-HCl（pH 7.6）、0.1% Tween-20））（参见材料表），直至完全浸没膜，室温孵育30分钟。</li>
	<li>对于SINEUP-GFP样品，将膜与抗GFP一抗（以封闭液按1:2000稀释）（参见材料表）在室温下振荡孵育30分钟进行杂交。以β-actin作为内参蛋白，使用抗-β-actin抗体（以封闭液按1:2000稀释）（参见材料表）在室温下振荡孵育30分钟进行检测。</li>
	<li>向容器中加入1×TBST缓冲液，直至完全浸没膜，在室温下洗涤5分钟。重复该洗涤步骤两次（共洗涤三次）。</li>
	<li>将GFP蛋白与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔二抗（以封闭液按1:1000稀释）杂交，将β-actin蛋白与HRP标记的抗鼠二抗（以封闭液按1:1000稀释）杂交，室温振荡孵育30分钟。</li>
	<li>用1×TBST缓冲液在室温下洗涤膜5分钟。重复该洗涤步骤两次（共洗涤三次）。</li>
	<li>等体积混合HRP增强型化学发光（ECL）检测试剂1和试剂2（参见材料表）。将膜转移至2 mL ECL试剂混合液中，用铝箔包裹容器，室温孵育1–2分钟。小心将膜从ECL试剂混合液中取出，使用化学发光成像仪进行曝光检测。</li>
</ol>
5. RNA 提取与DNase处理
<ol>
	<li>按照标准方案提取总RNA，具体步骤为从单层培养的细胞中提取RNA27，或 alternatively 使用市售的RNA提取试剂盒（参见材料表）。简要说明如下：在步骤2.3中，向收获的细胞加入异硫氰酸胍和苯酚组成的单相裂解试剂（MLR）（每约500万个细胞加入1 mL MLR）27。 
	注意：频繁更换手套。使用无RNase的试剂以及经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的塑料器皿和玻璃器皿，以防止RNA降解。如需暂停，可在本步骤暂停实验流程。将提取的RNA储存于-80 °C。</li>
	<li>向步骤5.1中纯化的RNA中加入0.1体积的10× DNase缓冲液和2 U DNase（参见材料表）。</li>
	<li>用无核酸酶的水将反应体系调至50 µL，并轻轻混匀。在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>加入0.1体积的重悬DNase失活试剂，并充分混匀（参见材料表）。室温下轻轻振荡孵育5分钟。</li>
	<li>在10,000 x g 离心90秒。将上清液（无DNA的RNA）转移至新的无RNase的1.5 mL离心管中。注意不要触碰沉淀，以免带入DNase，从而影响后续实验步骤。</li>
	<li>使用紫外分光光度计测定A260及A260/A280比值（对于纯RNA，该比值范围为1.8–2.0）以定量RNA。</li>
</ol>
6. 第一链 cDNA 合成与 qRT-PCR 分析
<ol>
	<li>按照以下标准cDNA合成方案进行第一链cDNA的合成（参见材料表）。
	<ol>
		<li>在10 µL总体积的反应体系中，混合0.75 µM oligo dT引物、4.3 µM随机引物、dNTPs（各10 mM）以及200–500 ng总RNA（来自步骤5–8）。于65 °C孵育5分钟，随后立即置于冰上。</li>
		<li>加入1×逆转录酶缓冲液、1 U RNase抑制剂和10 U逆转录酶，混匀后加入步骤6.1.1中得到的10 µL RNA-引物混合物中。</li>
		<li>如需要，用无核酸酶水将总体积调至20 µL。轻轻混匀后，将反应体系在30 °C孵育10分钟，随后在42 °C孵育60分钟，最后在95 °C孵育5分钟以灭活酶活性。将反应管置于冰上冷却。 
		注意：所有RNA样本及试剂均需在冰上解冻，并在冰上配制反应体系。若目标RNA仅为polyA RNA，则仅使用oligo dT引物（2.5 µM）。如需可在此暂停实验流程。合成的cDNA可保存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用1 µL含10 ng cDNA的模板、0.4 µL反向引物（10 µM）、0.4 µL正向引物（10 µM）、10 µL DNA聚合酶混合液、0.4 µL双链DNA染料及10 µL无核酸酶水（总体积为20 µL），在技术重复三次（n=3，Cт标准差&#62; 0.2）和生物学重复（n ≥ 3）条件下进行qRT-PCR，扩增程序如下：95 °C预变性1个循环（30秒），循环扩增阶段40个循环（95 °C变性5秒，60 °C退火延伸30秒），随后进行熔解曲线分析。引物示例如下：人Gapdh_Fw: TCTCTGCTCCTCCTGTTC，人Gapdh_Rv: GCCCAATACGACCAAATCC，EGFP_Fw: GCCCGACAACCACTACCTGAG，EGFP_Rv: CGGCGGTCACGAACTCCAG，SINEUP-GFP_Fw: CTGGTGTGTATTATCTCTTATG，SINEUP-GFP_Rv: CTCCCGAGTCTCTGTAGC。参见材料表。采用2-∆∆Ct ± SD方法分析定量RNA表达水平28。</li>
</ol>
7. 通过半自动检测方法对SINEUP进行成像分析
<ol>
	<li>用 0.5 mL PBS 清洗 24 孔板中一个孔的细胞。</li>
	<li>向 24 孔板的每个孔中加入 2.0 μg Hoechst 33342（见材料表）（溶于 500 μL PBS 中），在 37 °C 孵育 20 分钟以染色细胞核。</li>
	<li>使用高通量微孔成像细胞仪（见材料表）在蓝色发射波长最大值 461 nm 处检测 Hoechst 染色的细胞，以计数总细胞数；在绿色发射波长最大值 510 nm 处检测绿色荧光强度，以计数 GFP 阳性细胞数量。通过成像软件29计算 GFP 整合荧光强度（即针对每个通道，对分割对象中显示信号的所有像素强度求和），分析 SINEUPs 对蛋白表达的上调作用。</li>
	<li>收集细胞以检测 RNA 表达（返回步骤 5 和 6）。</li>
</ol>

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</ol>

通讯作者Piero Carninci是TransSINE Technologies Co. Ltd.的创始人之一，该公司拥有SINEUP技术相关专利的知识产权，包括已提交的专利（EP2691522A4和JP2017169573A）以及已授权的专利（US9353370B2）。

本文介绍了一种通过含有SINE元件的非编码RNA（称为SINEUP）特异性增强靶标mRNA蛋白质表达的实验方案。以代表性实例为例，通过Western印迹分析测定，优化后的合成型SINEUP-GFP可使GFP mRNA的翻译效率提高2.6倍。
设计最优的结合域（BD）对于确保SINEUP的特异性和活性（蛋白质上调程度）至关重要。此前，我们通过蛋白质印迹分析对17种SINEUP-GFP的BD进行了筛选15，发现最优BD与GFP mRNA的AUG-KOZAK序列重叠，但该规律可能不适用于其他mRNA，需针对每种情况单独验证。另一个独立研究团队也采用不同方法对BD进行了筛选31。由于筛选大量BD可能非常耗时且繁琐，本文中我们引入了一种高通量SINEUP检测方法。该方法通过测量转染SINEUP的细胞与转染对照载体的细胞中GFP整合密度的相对变化来评估效果。为确保培养板中某一孔内的细胞转染均匀，且GFP信号不会集中在孔的特定区域，在步骤2.1中必须将细胞均匀分布于各孔内。为此，在生物安全柜中接种细胞后，应轻轻前后摇动培养板10次（↑↓），并在放入5% CO2培养箱开始培养前重复该操作。
另一个关键步骤是第3.3步中的蛋白质浓度计算。此处的计算错误可能导致在Western印迹分析中上样蛋白量不准确，从而无法检测到某些较弱SINEUP引起的蛋白质表达微小变化，或因上样过量而产生假阳性结果。建议每次实验都需重新配制蛋白质标准曲线，并确保在第3.3.3步中对标准品和蛋白样品使用相同的测定量。本文所述方案以SINEUP-GFP为重点，但Western印迹分析也可用于任何目标mRNA。针对不同目标，应优化抗体的孵育时间和浓度，以获得最佳结果。
SINEUP 的一个独特特征是靶标 mRNA 的表达水平不受影响。为避免通过 qRT-PCR 检测到转染的 SINEUP 和基因组 DNA，必须使用 DNase 处理 RNA。应通过 qRT-PCR 检测 SINEUP RNA 和靶标 mRNA 的表达，以确认转染成功以及 SINEUP 具有活性。SINEUP 含有 SINE 序列，该序列在人类和小鼠基因组中广泛存在。为避免非特异性地检测到 SINE 序列，不建议针对 SINE 序列设计 qRT-PCR 引物。
本方案中我们使用了人源细胞系，但SINEUP在多种不同物种的多种细胞系中均有效12,13,14,18,19。只要细胞系能够维持SINEUP载体的转染效率，细胞培养和转染条件可根据不同细胞系进行调整。此外，只要能保证qRT-PCR和Western印迹分析所需的RNA和蛋白质质量，也可采用其他RNA提取、cDNA合成及蛋白浓度检测方法。尽管我们使用了一种特定的高通量微孔板细胞计数仪，可检测整个孔内的GFP荧光信号，但其他具有相似检测范围的细胞计数仪亦可使用31。需要注意的是，如果细胞分布和转染在孔内均匀一致，则无需扫描整个孔的GFP荧光信号：根据实验操作水平，检测孔面积的一半或四分之一可能已足以判断SINEUP效应。
建立高通量SINEUP检测方案，可实现对培养细胞中针对特定mRNA的多个BD进行同步筛选。这一点至关重要，因为目前关于BD最佳靶向作用的规律尚不明确。这种多重筛选系统可用于大规模测试多种SINEUP对不同基因的作用，例如在特定信号通路中涉及的多个基因的靶向研究。此外，该系统还可用于扩展对靶向多种mRNA的有效SINEUP的筛选，围绕AUG-Kozak区域设计不同的SINEUP BD（见图1），在培养细胞中共同转染与GFP mRNA融合的全长靶标mRNA（5ʹ非翻译区-编码区-3ʹ非翻译区），以筛选最优SINEUP，随后在培养细胞及从人类、小鼠到其他动物和植物物种的体内模型动物中，对候选BD进行针对内源性mRNA的功能验证。
该筛选方案非常快速。我们无需固定和收集细胞，只需将活细胞培养板放入成像仪器中即可。我们建议采用此高通量筛选方案来选择最优的SINEUP结合结构域（BD），并通过Western印迹分析评估潜在候选分子。因此，可将具有最优BD的候选分子应用于提高抗体产量18,19,21。目前，RNA治疗领域正在迅速发展。例如，siRNA、ASO、mRNA和CRISPR RNA疗法已被广泛用于调控各自靶标mRNA的表达9,32。在这一背景下，SINEUP仍处于发展初期，迄今为止，所有已研究的SINEUP均未改变靶标mRNA的表达水平。此外，SINEUP并不编辑靶标mRNA，而是仅上调mRNA的翻译。进一步而言，由单倍剂量不足引起的失功能性疾病可通过SINEUP疗法进行靶向干预，实现缺陷蛋白表达量两倍的提升17,33。尽管脱靶效应仍需进一步研究，但SINEUP具有潜力并可特异性地靶向一种具有与BD互补序列的已表达mRNA。
该高通量实验方案的一个局限性在于，其仅能检测GFP的整合强度，因此不适用于在活体小鼠模型中筛选SINEUP的BD功能。由于SINEUP是一类天然的反义长链非编码RNA，其作用机制为转录后调控，因此当细胞或组织样本中缺乏靶标mRNA时，SINEUP无法发挥作用。
然而，SINEUP 可应用于功能获得性研究，以增强抗体产生，或作为RNA疗法，在1.5-3.0倍范围内上调表达不足的蛋白质。本文所述方法为靶向和检测SINEUP诱导的特定mRNA翻译增强提供了实用指南，并为转录后基因调控提供了一种新工具。

在后基因组时代，由于下一代测序技术1,2,3和基因编辑工具的发展，人们对非编码反义转录本在基因调控中的作用有了许多深入认识。这类转录本曾被认为是&#34;转录垃圾&#34;，如今已被确认为遗传调控中的关键参与者。已有报道表明，反义转录本能够调节染色质状态，并控制其对应的蛋白编码正义mRNA的稳定性与表达水平4,5。在大多数情况下，这种调控模式为负向调控，反义转录本通过RNA-RNA相互作用使其对应的正义转录本沉默6,7。天然反义转录本的这一特性已被用于开发合成的小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和反义寡核苷酸（ASO）以实现目的基因的下调8,9,10,11，但在靶向基因上调方面仍存在技术空白。
一项引人入胜的研究改变了反义RNA领域的观点，该研究证明了小鼠中基因Uchl1（泛素C末端水解酶L1）和Uxt（普遍表达转录本）的反义长链非编码RNA（AS lncRNA）可在转录后水平正向调控其对应正义mRNA的翻译12。这些AS lncRNA的5ʹ端与其相应正义转录本的5ʹ非翻译区（5ʹ UTR）有数个碱基重叠，而非重叠的3ʹ端则包含一个属于短散在核元件（SINE）家族的逆转座子的反向重复序列。有趣的是，我们发现这种翻译上调的主要驱动力是嵌入的SINE重复序列，且该作用不仅限于小鼠的SINE重复序列。含有Alu重复序列的人类AS lncRNA同样能够增强靶向正义mRNA的翻译，进一步支持了一类新型SINE驱动的调控性反义非编码RNA的存在，这类RNA被恰当地命名为SINEUPs13。最近的研究表明，天然SINEUPs的功能潜力在合成SINEUPs中得以保留，后者可被设计用于特异性靶向多种内源性和外源性基因14,15。SINEUPs具有两个重要特征：首先是&#34;结合域&#34;（BD），通常为与蛋白编码mRNA起始密码子区域序列互补的5ʹ端部分；其次是&#34;效应域&#34;（ED），因其包含SINE的反向重复序列，是SINEUP发挥功能的必要条件14（图1）。可通过定制设计BD以特异性靶向目标基因。该策略可用于解析特定生物通路中关键基因的功能，是传统mRNA过表达策略的更优替代方法。此外，这一多功能工具还可用于增强抗体生产，并作为治疗因功能性蛋白剂量不足所致单倍体不足疾病的潜在药物16,17,18,19,20,21。
SINEUP 技术具有多种优势。它不会在转录水平上改变靶基因的表达。较长的 BD 区域可为 SINEUP 提供更高的特异性，同时不会引发依赖于双链 RNA 的应激反应15。该技术诱导的蛋白表达水平维持在细胞正常的生理范围内，从而避免因异常或过量蛋白表达所导致的有害效应。SINEUP 可兼容多种小鼠、人类和仓鼠的培养细胞系，例如 HEK293T/17、HepG2、HeLa、CHO、MN9D 以及其他多种细胞系12,13,14,15,18,19。SINEUP 能有效靶向内源性基因、瞬时过表达基因以及带有 FLAG 标签或荧光素酶融合标签的基因，从而无需使用基因特异性的抗体14,18。基础的 SINEUP 分析仅需常规细胞培养、转染、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、实时定量反转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR）仪器及相应实验条件，相关技术可在短时间内掌握。
本文介绍一种利用合成型 SINEUP 分子靶向基因以增强翻译效率的方法，该效应与其他技术（如 RNA 干扰9 和 ASO gapmer11,22,23）的作用相反。目前广泛使用的 RNA 引导基因激活方法是基于成簇规律间隔短回文重复序列的激活系统（CRISPRa），该方法在转录水平上启动基因表达24。尽管该方法操作简便且快速，但为了获得更高的效率，通常需要使用多个靶向同一基因的单导向 RNA（sgRNA），从而增加了脱靶结合的风险25。此外，CRISPRa 系统中的关键酶——无催化活性的 CRISPR 相关蛋白 9（dCas9）——结合特异性较低，且靶向双向启动子区域的 sgRNA 可能非特异性地激活邻近基因的表达25。相比之下，SINEUP 分子可在单一结合区域以高特异性结合靶标 mRNA，且不会影响邻近基因的表达。本文讨论了 SINEUP 设计、转染以及蛋白和 RNA 表达分析的基本步骤。此外，我们还介绍了一种半自动化的高通量成像系统，可用于同时筛选多个 SINEUP 分子，有助于鉴定最优的 SINEUP 分子。

<table><tbody><tr><td>合成型 SINEUP</td><td>英国 Cell Guidance Systems Ltd. 和日本 K.K.DNAFORM</td><td>https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html 和 https://www.dnaform.jp/en/information/20130320</td><td>步骤 1.5</td></tr><tr><td>HEK293T/17</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-11268</td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>用于细胞培养的 Falcon 多孔板 6 孔板</td><td>Corning</td><td>6902A01</td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>Corning BioCoat 聚-D-赖氨酸 24 孔板</td><td>Corning</td><td>08-774-124</td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>步骤 2.2</td></tr><tr><td>pEGFP-C2</td><td>Clontech</td><td>#6083-1</td><td>步骤 2.2</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液 (10x)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9803S</td><td>步骤 3.1 这是预混的细胞裂解溶液。</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8553S</td><td>步骤 3.1 为完成细胞裂解缓冲液的配制，向 1x 细胞裂解缓冲液中加入 0.005% (w/v) 的 PMSF。</td></tr><tr><td>DC 蛋白定量检测试剂盒 II</td><td>BIO RAD</td><td>#5000112JA</td><td>步骤 3.3</td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶，12 孔，20 &amp;micro;L</td><td>BIO RAD</td><td>#4561035</td><td>步骤 4.2</td></tr><tr><td>Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm&amp;times;4 m)</td><td>Amasham</td><td>10600013</td><td>步骤 4.3，这是一种孔径为 0.45 &amp;micro;m 的硝酸纤维素膜。</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9999S</td><td>步骤 4.4 封闭液的组分之一。</td></tr><tr><td>GFP 标签抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6455</td><td>步骤 4.5 批号：1495850，RRID: AB_221570</td></tr><tr><td>小鼠来源的单克隆抗-&amp;beta;-肌动蛋白抗体</td><td>SIGMA</td><td>A5441</td><td>步骤 4.5 批号：026M4780V，RRID: AB_476744</td></tr><tr><td>多克隆山羊抗兔免疫球蛋白</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>步骤 4.5 这是与 HRP 偶联的二抗，用于检测抗 GFP 抗体。批号：20017525，RRID: AB_2617138</td></tr><tr><td>多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白</td><td>Dako</td><td>P0447</td><td>步骤 4.5 这是与 HRP 偶联的二抗，用于检测抗 &amp;beta;-肌动蛋白抗体。批号：20019698，RRID: AB_2617137</td></tr><tr><td>ECL 蛋白印迹检测试剂</td><td>Amersham</td><td>RPN2109</td><td>步骤 4.9</td></tr><tr><td>Maxwell 快速样本浓缩仪 (RSC)</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>步骤 5.1 这是一种市售的 RNA 提取仪器。</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA 细胞试剂盒</td><td>Promega</td><td>AS1390</td><td>步骤 5.1 这是一种市售的 RNA 提取试剂盒。</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free 试剂盒</td><td>ambion</td><td>AM1907</td><td>步骤 5.2 和 5.4 该试剂盒包含 DNase、DNase 缓冲液和失活试剂。</td></tr><tr><td>PrimeScrip 第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>TaKaRa</td><td>6110A</td><td>步骤 6.1 该试剂盒包含第一链 cDNA 合成所需试剂。</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820A</td><td>步骤 6.2</td></tr><tr><td>Hoechst3342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>步骤 7.2</td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>200-BFFL-S</td><td>步骤 7.3 这是一种高通量微孔板成像细胞仪。</td></tr></tbody></table>

基于细胞的sineup非编码rna检测方法，可特异性增强mrna翻译

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

靶向蛋白质增强不仅对于研究生物过程具有重要意义，而且在治疗和生物技术应用中也具有重要价值。本文介绍一种利用合成的反义非编码RNA（称为SINEUP）在培养细胞中选择性上调目标基因蛋白表达的方法。这种基因表达的正向调控作用发生在转录后水平，由SINEUP 3ʹ端的反向短散在核重复元件（SINE）重复序列介导，该重复序列构成其效应结构域（ED）。SINEUP通过其结合结构域（BD）可特异性结合任意选定的蛋白编码mRNA，该结构域设计为与mRNA的5ʹ非翻译区（5ʹ UTR）及起始密码子周围序列互补。通过将如此设计的靶向特异性SINEUP转染至培养细胞，并在转染后通常24–48小时提取蛋白和RNA进行后续分析。采用Western印迹法检测SINEUP诱导的蛋白上调，同时利用实时定量反转录PCR测定RNA表达水平。我们发现，BD的设计对于实现SINEUP最佳活性至关重要，建议针对目标mRNA起始密码子的不同BD大小和位置进行测试。因此，本文还描述了一种基于荧光检测的半自动化高通量成像方法，可用于检测与绿色荧光蛋白（GFP）融合的靶mRNA。SINEUP可在细胞正常的生理范围内特异性增强翻译过程，而不改变靶转录本的表达水平。该方法已在多种人、小鼠和昆虫来源的细胞系以及体内系统中，成功应用于多种内源性和外源性靶标。此外，已有报道表明SINEUP可提高抗体产量，并可作为针对单倍剂量不足基因的RNA治疗手段。SINEUP结构的多功能性和模块化特性使其成为实现基因特异性翻译调控的适宜工具。

SINEUP-GFP 是一种合成的 SINEUP，包含一个最优的 BD（与 GFP mRNA 的 -28/+4 区域重叠）和一个 ED（来自 AS-Uchl1) 能够上调 GFP mRNA 翻译的（图3A 以及 3B）而不改变GFP mRNA的表达水平（图3C 和 3D）。为了筛选SINEUP的最佳BD和ED，我们开发了一种半自动化的图像分析方案，与传统的Western印迹分析相比，该方法缩短了检测时间，并提高了可同时筛选的样本数量15如所示 图4该高通量成像系统耗时3天（而Western blot分析48种SINEUP耗时2周）。在证实SINEUP-GFP可增强GFP翻译后，我们利用成像流式细胞仪检测了GFP的积分荧光强度。最优BD的SINEUP-GFP可使GFP蛋白表达水平提高1.4倍。尽管我们在Western blot分析中观察到信号压缩现象（达2.6倍，见 图3A）至1.4倍（成像分析，见 图5)，这种差异可能是由于成像仪器软件的校准所致。尽管如此，我们检测到GFP荧光水平显著高于对照组（图5A 和 5B).
<img alt="SINEUP 作用机制示意图：效应结构域结合靶标 mRNA，增强 CDS 的翻译。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：合成型 SINEUP 的基本设计。 BD = 与靶标 mRNA 结合的结合结构域，ED = 包含反向 SINE 序列的效应结构域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="PARK7基因表达分析；基因组位置图中显示的DNA序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：通过CAGE分析检测到的人类帕金森病蛋白7（PARK7）mRNA在特定组织和细胞中的转录起始位点（TSSs）。（A）使用组学数据整合与交互式可视化系统30查询人类PARK7 mRNA转录起始位点的结果截图。Entrez基因hg19轨道中的水平绿色箭头表示参考人类PARK7 mRNA的基因组位置，FANTOM5 CAGE第1和第2轨道中的垂直绿色条形表示来自1,829种不同类型组织和细胞的TSS总和（以每百万转录本数（tpm）为单位测量）。（B）对A图中标记区域的TSS进行放大（1/354比例：从35.4 kb放大至100 bp）。FANTOM5 CAGE第1和第2阶段轨道中的灰色阴影区域表示在总共1,829种细胞中6种特定细胞的TSS，这些细胞列于图的底部。对应于这些列出细胞的数值（11.369、4.998、4.304、3.509、3.477和3.055）表示每种特定细胞在TSS灰色阴影位置处的每百万转录本数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用Western blot和qPCR进行蛋白质表达和mRNA分析，SINEUP诱导GFP表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：Western blot分析证实SINEUP-GFP可上调翻译水平。（A）使用抗GFP抗体通过Western blot检测SINEUP-GFP。（B）结果以β-actin蛋白条带强度归一化。（C）通过qRT-PCR检测GFP mRNA，以及（D）SINEUP RNA的表达。***p &lt; 0.0005，n = 3，双尾学生t检验，误差棒表示标准差。该图改编自Takahashi et al.15。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞转染过程；SINEUP；示意图；24孔板；DNA检测实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：SINEUP半自动图像分析示意图。 第1天：将目标细胞接种至24孔板中。第2天：转染GFP和SINEUP-GFP。第3天：通过测量GFP的整合荧光强度来分析SINEUP的作用效果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="24孔板中GFP荧光强度的荧光显微镜图像与柱状图分析，SINEUP效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：SINEUP-GFP介导的翻译上调的高通量分析。（A）对照组与转染SINEUP-GFP细胞的GFP荧光比较15。比例尺 = 2 mm。（B）GFP整合荧光强度经Hoechst 33342核染色计数的总细胞数归一化。***p &lt; 0.0005，n = 3，双尾student t检验，误差线表示标准差。FOV：视野。本图经Takahashi 等15修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

SINEUP 是一类合成的反义非编码 RNA，包含一个结合域（BD）和一个效应域（ED），可上调靶标 mRNA 的翻译。本文中，我们描述了在培养细胞系中检测 SINEUP 的方法，以及通过 Western 印迹和半自动高通量成像系统分析其促进翻译活性的技术。

基于细胞的SINEUP非编码RNA检测方法，可特异性增强mRNA翻译

靶向蛋白质增强不仅对生物过程的研究具有重要意义，而且在治疗和生物技术应用中也具有重要价值。

该方法有助于回答一些关键问题，例如如何通过利用细胞和组织中已存在的mRNA来正向调控基因的活性，如何补偿活性不足，以及如何在体外和体内实现mRNA的高效翻译。该技术的主要优势在于，我们可以通过成像手段在活细胞中对SINEUP的靶基因进行全基因组范围的筛选，而无需固定和收集细胞。因此，该技术的应用意义延伸至单倍剂量不足病例的治疗，因为SINEUPs可使缺陷蛋白（如弗里德赖希共济失调病例中的frataxin蛋白）的表达量增加一倍。首先，打开Zenbu浏览器，点击感兴趣的Fantom项目数据库。搜索目标基因，并在目标细胞和组织中检查其转录起始位点（TSS）及表达水平。为了确定转录起始位点（TSS），请参考帕金森病蛋白7（PARK7）mRNA 的示例分析。通过 CAGE 峰区域来确认 TSS。为了确定细胞和组织特异性的转录表达水平，选择 CAGE 峰区域，然后点击“放大所选基因组区域”。通过浏览页面底部的转录表达列表，检测目标细胞和组织类型中PARK7的表达情况。然后，设计对应于起始甲硫氨酸（AUG）上游40个碱基和下游32个碱基的多个不同长度的结合域序列。在转染SINEUP之前，按照文章所述方法，将目标细胞接种于两块聚-D-赖氨酸包被的24孔板中。在37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育24小时，使细胞融合度达到70%。接种细胞后，为确保细胞在孔板中分布均匀，需在洁净工作台内轻轻前后摇晃培养板10次，并在5% CO2培养箱中重复此操作。孵育结束后，更换为0.4 mL新鲜培养基。为分析SINEUP-GFP，准备多个1.5 mL离心管，每管中加入0.1 mL混合溶液，包含pEGFP-C2、SINEUP-GFP、转染试剂和OptiMEM，并在室温下孵育20分钟。将每管中的0.1 mL混合溶液分别加入24孔板的独立孔中，并将这些孔标记为SINEUP-GFP一、二、三、四和五。将24孔板置于37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育24小时。24小时后，用0.5 mL PBS洗涤细胞。每孔加入25 μL质量体积比为0.05%的胰蛋白酶，于5% CO2培养箱中孵育5分钟。每孔加入275 μL细胞培养基。进行蛋白质提取时，取两个培养板中的一个，从一个孔中收集225 µL或四分之三的细胞用于蛋白质提取，另取75 µL或四分之一的细胞用于RNA提取，分别放入两个独立的1.5 mL离心管中。在4°C条件下以6000×g离心5分钟。离心后，小心移除标记为蛋白质分离的离心管中的上清液。向细胞中加入60 µL裂解液，通过移液混匀，并在4°C下以低速旋转充分混匀1小时。在4°C下以14,000×g离心10分钟，收集蛋白上清液。为测定蛋白浓度，首先用超纯水将新鲜的牛血清白蛋白蛋白标准品稀释5至6倍，配制浓度范围为0.2至1.5 mg/mL的蛋白溶液。在2 mL离心管中，向1 mL试剂A中加入20 µL试剂S，配制工作试剂A Dash混合液。每孔加入5 µL水作为阴性对照，然后每孔加入BSA标准品或蛋白样品。每孔加入 25 µL A Dash 试剂，然后小心加入 200 µL B 试剂，避免产生气泡。用铝箔纸覆盖酶标板，在室温下孵育 5 至 8 分钟。使用分光光度计在 750 nm 处测定蛋白质吸光度。通过将 BSA 标准蛋白浓度绘制在 x 轴上，其相应的吸光度绘制在 y 轴上，绘制标准曲线。应用标准曲线方程计算样品蛋白浓度。开始蛋白分离时，向每一体积的蛋白样品中加入一体积的 2x 上样染料。在90摄氏度下加热五分钟，然后立即在冰上冷却一分钟。将10至20 µg蛋白质样品加入10% SDS聚丙烯酰胺凝胶中，在100至150 V条件下进行电泳分离。使用半干转印仪将蛋白质从凝胶转移至0.5 µm硝酸纤维素膜上。用转移缓冲液在25 V条件下填充30分钟。转移完成后，将膜放入容器中，加入封闭液直至完全浸没膜，并在室温下轻轻摇动孵育30分钟。将适当的抗体加入封闭液中，然后铺加在膜上。在室温下轻轻振荡孵育膜30分钟以进行杂交。杂交完成后，在室温下加入1×TBST缓冲液洗涤膜5分钟，并重复此步骤两次。随后，在室温下将二抗用封闭液稀释后加入膜上，轻轻振荡孵育30分钟，进行下一轮杂交。然后在室温下用 1× TBST 缓冲液洗涤膜 5 分钟，并重复此步骤两次。将膜转移至含有 2 mL HRP 增强型 ECL 试剂混合液的盒子中。用铝箔覆盖盒子，在室温下孵育 1 至 2 分钟。小心地将膜从ECL试剂混合物中取出，并使用化学发光成像仪进行曝光。为了通过成像分析SINEUP-GFP在细胞中的作用，用每孔0.5 mL的PBS洗涤第二个24孔板中的pEGFP-C2和转染了SINEUP-GFP的细胞。为了染色细胞核，向每孔加入2 µg Hoechst-33342，并在37°C下孵育20分钟。使用高通量微孔成像细胞仪检测经Hoechst染色的细胞，以计数细胞总数。通过测量绿色荧光强度来计数GFP阳性细胞。为分析SINEUPs对蛋白表达的上调作用，使用成像软件确定GFP的整合荧光强度，将其计算为每个通道所获得的分割对象中所有显示信号的像素强度之和。成功转染含有最佳结合域和效应域GFP的合成型SINEUP-GFP后，GFP mRNA的表达水平未发生改变，但其翻译水平显著上调。与传统的Western blot分析相比，半自动化的图像分析方案缩短了检测时间，并提高了同时筛查的样本数量。尽管信号强度在Western blot分析中为2.6倍，而在成像分析中为1.4倍，但与对照组相比，GFP荧光信号仍检测到显著升高。进行该实验操作时，重要的是要记住识别目标 mRNA 的正确序列，以设计出正确的结合结构域。基因通常由启动子转录，并可能使用不同的翻译起始位点。Zenbu 浏览器是探索此类 mRNA 变异的非常有用的工具。我们还建议设计具有不同结合位点的多种SINEUP分子。总体而言，我们认为，快速将SINEUP分子适配于多种靶标，将建立一个全新的研究领域，即对现有RNA的翻译过程进行正向调控，这与siRNA领域形成互补和对应关系。我们预期，该技术的一部分功能将在体外（如生物反应器）用于大量生产蛋白质，同时也可在体内用于自然纠正基因剂量。

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科研

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Genetics

遗传学

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