用于向癌细胞输送 sirna 的外质体的制备

从生物反应器烧瓶培养的细胞中采集外生富集的调节介质，通过蔗糖垫超离心分离，可以最少的污染蛋白或非外显性囊泡进行外生体制备。使用用氧化铝制备的单蔗糖垫来规避不连续蔗糖梯度的费力制备，并减少达到所需密度所需的蔗糖量。在该协议中编写的外向中，siRNA的体外有效传递突出了该系统作为胰腺癌新一代RNA干扰疗法的潜力。

首先，培养在正常介质中的 HEK-293 细胞，如手稿中所述。将细胞展开至四个T75烧瓶中，并生长至90%的汇合。要准备生物反应器烧瓶，请将50至100毫升的正常介质加入生物反应器烧瓶的介质储液罐中，以湿润膜。

从四个T75烧瓶中收集所有 HEK-293 细胞，并在离心管中将它们重新用 15 毫升的外体耗竭介质中重新暂停。然后，使用连接到钝填充针的 20 毫升注射器，小心地将此细胞悬浮液添加到生物反应器烧瓶的细胞隔间中。然后，用正常介质填充生物反应器烧瓶的介质储液罐，高达500毫升，并在37摄氏度、5%CO2下孵育一周。

经过一周的孵育，通过浇注从生物反应器烧瓶的介质中去除所有介质。使用连接到钝填充针的 20 毫升注射器，从细胞隔间中取出所有介质。然后，使用连接到钝填充针的 20 毫升注射器向介质中加入 50 至 100 毫升正常介质，向细胞室添加 15 毫升新鲜外体耗竭介质。

然后，用正常介质填充生物反应器烧瓶的介质储液罐，其介质高达 500 毫升。在37摄氏度，5%CO2下再孵育一周。要预先清除收集的条件介质，请以 500 倍 g 离心，在 4 摄氏度下 5 分钟。

将上一液转移到新管中，然后丢弃颗粒。与回收的上经剂重复此离心步骤后，再次回收上一液并丢弃颗粒。然后，将回收的上一代在2000倍g下离心15分钟和4摄氏度。

保持上一液，并丢弃颗粒。通过连接到 20 毫升注射器的 22 微米过滤器将上清液过滤一次，放入新鲜的离心管中。同时，在氧化铝中准备25%蔗糖溶液，在万能管中精确称出1.9克蔗糖。

然后，加入氧化铝，直到重量达到7.6克。然后，用22.5毫升预清除的调节介质填充超离心管。将玻璃移液器放在管子中。

通过移液器添加三毫升蔗糖溶液，使溶液在条件介质下形成单独的层。小心地将含有分层条件介质/蔗糖溶液的管放入回转转子的铲斗中。将铲斗固定到转子中。

将转子放入超离心中，在4摄氏度下以10万次g旋转1.5小时。从管子中收集两毫升蔗糖层，一次使用 P1000 移液器一毫升，其尖端附在 10 微升尖端上，并将其添加到含有 20 毫升过滤 PBS 的超离心瓶中进行清洗。将管子放入固定角度转子中，在4摄氏度下以10万倍g离心1.5小时。

使用 10 毫升血清移液器小心地取出上流液。用 400 微升过滤 PBS 重新暂停颗粒。在开始电穿孔之前，在冰上预冷却电穿孔盒30分钟。

在微离心管中，将7微克的外显体与33微克的siRNA混合。加入柠檬酸缓冲液，达到150微升的体积。使用塑料移液器将外体-siRNA混合物加入电穿孔盒中，并盖上蛋黄酱。

将电孔放在电穿孔器的 Cvette 支架的右侧方向，顺时针旋转电穿孔器的转动轮 180 度。选择所需的程序，然后按"开始"按钮开始电穿孔。显示屏将指示脉冲成功。

然后，逆时针回转车轮 180 度，然后拆下蛋盒。使用塑料移液器将样品从玻璃盒中移入新的微离心管中。在进一步加工之前，请将管子放在冰上或冰箱中，如果不立即使用。

要开始自由去除siRNA，通过大小排除色谱柱两次通过3.5毫升过滤PBS，以平衡它。然后，将 150 微升电分样品溶解在 350 微升过滤的 PBS 中，然后传输到 SEC 列。将从柱中分出的第一个 500 微升分数收集到微模糊管中，并标记为 F0。然后，向列中添加 500 微升的过滤 PBS。

收集下一个分数，并标记为 F1。重复添加 PBS 并收集洗脱分数，直到总共收集 10 个 500 微升分数，或最多收集 F9。最后，要去除任何样品残留物，请至少用过滤的 PBS 清洗柱子两次，然后继续进行实验，如手稿中所述。利用透射电子显微镜进行形态学分析表明，HEK-293外体是球形结构略大于100纳米。

这一结果与纳米粒子跟踪分析测量的结果一样，也显示了外显体的大小分布。此外，它们对异常标记 CD81、CD9 和 CD63 呈阳性。使用大小排除色谱纯化的外体回收百分比和 siRNA 的百分比回收率计算在手稿中所述。

利用siRNA标准曲线，外显体纯化后恢复率为75%，计算出外体中siRNA的封装效率约为10-20%流细胞学定性分析，对装有荧光的阿托655-siRNA外体外体吸收情况表明，使用siRNA封装外体治疗的PANC-1细胞在荧光信号上变化最大。这一发现证实了这一点，即使用siRNA封装外体治疗的PANC-1细胞对 Atto655信号的阳性率比使用卸载外体和siRNA混合物治疗的群体阳性率更高。与用外显体-siRNA混合物治疗的泛如细胞外体相比，使用siRNA封装的外体治疗的PANC-1细胞的细胞吸收率也显著提高，这证实了SIRNA封装的外体由PANC-1细胞内化，并且它们有效地在细胞内传递siRNA。

在制备蔗糖溶液时，必须非常准确地称量蔗糖和氧化铝，并且始终使用新鲜制备的蔗糖溶液，以避免在储存过程中发生密度变化。可进行共和显微镜，以进一步验证封装在外显子中到细胞中的siRNA的内化，并研究细胞吸收后细胞内贩运。该协议使我们能够评估外显体所传递的siRNA的基因特异性敲击，并作为基于RNA干扰的癌症治疗中新靶验证的工具。