聚五氟丙烯酸酯 (五氟丙烯酸酯) 功能化 sio2 珠的蛋白质纯化

该方法可用于准备生物分子活性表面，在药物输送、生物靶点检测和生物分离等领域具有应用。该技术的主要优点是聚PFPA刷对胺具有高度反应性，通过缓冲液中的孵育几个小时实现抗体的固定化。该技术的影响通过免疫净化扩展到蛋白质纯化，因为固定抗体可以成功地与目标抗原结合。

虽然这种方法是抗体动员和蛋白质纯化的证明，它也可以应用于其他需要生物分子动员的系统。要使用 APTES 处理二氧化硅珠，首先以 5% 重量体积水悬浮物的形式获取二氧化硅颗粒。将0.8毫升二氧化硅悬浮液与40毫克APTES和8毫升甲醇混合在装有搅拌棒的20毫升闪烁小瓶中。

让反应在室温下继续五个小时，剧烈搅拌。五小时后，将溶液转移到锥形管中。为了分离APTES功能化的二氧化硅珠，在10000G下将溶液离心5分钟。

然后取出上一液。现在，用三毫升新鲜的甲醇重新洗珠子。用手摇动管子进行混合，但如有必要，通过水浴中的声波改善分散几秒钟。

一如和以前一样离心，再重复一次洗涤步骤。将甲醇洗涤二氧化硅珠与三毫升二甲基硫化物或 DMSO 混合。用手摇动混合物，或必要时，声波几秒钟，直到珠子完全分散在 DMSO 中。

在之前离心后，拆下上经剂。最后一次重复离心步骤，以确保从甲醇到 DMSO 的完全溶剂交换。要准备聚PFPA溶液，将20毫克聚PFPA溶解在20毫升闪烁小瓶中，在两毫升DMSO中溶解。

要准备PEG溶液，将胺功能化PEG溶解在一毫升DMSO中。现在将 PEG 解决方案转移到聚 PFPA 解决方案。在室温下反应一小时，剧烈搅拌。

将悬浮在 DMSO 中的 APTES 功能化二氧化硅珠的一毫升转移到 PEG 替代聚 PFPA 溶液中。允许聚PFPA和APTES功能化二氧化硅珠之间的嫁接在室温下进行一小时，剧烈搅拌。然后通过离心在10，000G下分离珠子5分钟，然后去除上经。

通过添加三毫升 DMSO 洗涤珠子，用手或几秒钟的声波混合。一如与以前一样将珠子离心机。在重复 DMSO 洗涤两次之前，先取出上一除水。

用三毫升三升蒸馏水多洗两次珠子。然后用手或几秒钟的声波混合。将珠子像以前一样离心并取出上一代。

最后在真空烤箱中将珠子在40摄氏度下干燥过夜。将五毫克聚PFPA嫁接的二氧化硅珠添加到1.5毫升微离心管中。通过添加 800 微升 PBS 来清洗珠子，通过涡旋混合。

在室温下将珠子在10，000G下离心一分钟。取出上一液，重复洗涤步骤三次。现在添加350微升新鲜PBS，50微升0.1%PBST，和6.67微克的抗体。

在4摄氏度的旋转器上孵育约20小时。第二天，在400G和4摄氏度的温度下清洗珠子和离心机一分钟。然后去除上流液，小心地添加400微升的解液缓冲液。

轻轻重新暂停珠子，上下移液五次。重复此洗涤步骤三次。最后洗涤后，尽可能多地取出上经液。

准备细胞和解解缓冲器，如文本协议中所述。然后用400微升的解解缓冲液重新填充细胞颗粒。使用超音速器对细胞进行声波化。

声波化后，短暂涡流。然后在4摄氏度下将20，000G的酸盐离心10分钟。将上一液转移到新的 1.5 毫升离心管中。

为了进行免疫沉淀，将300微升细胞酸化转移到先前准备的抗体固定聚PFPA嫁接的二氧化硅珠。将30微升细胞酸化作为新的微离心管中的输入样品。在4摄氏度的旋转器上孵育赖盐珠混合物三小时。

孵育后，在4摄氏度的400G下将混合物离心一分钟。取出上一杯，小心地添加400微升洗涤缓冲液。轻轻重新暂停珠子，通过上下移液约五次。

洗涤三次后，尽可能多地取出上经剂。将 30 微升 2 倍 SDS 加载染料添加到珠子和输入样品中。然后在95摄氏度下加热10分钟。

加热后，使用西印迹分析样品，或将样品储存在零下20摄氏度。通过X射线光电子光谱（XPS）对功能化二氧化硅珠进行检查，以确定表面成分。此处显示了代表性 XPS 数据。

APTES处理后，检测到与胺群区APTES相关的氮1s峰值。经过聚PFPA处理后，检测到与聚合物上的PFP单元相关的氟1s峰值。蛋白质激酶RNA被激活，或PKR通过免疫沉淀富集，并使用西印迹分析所暗示的蛋白质样本。

正如预期的那样，珠子固定在没有抗体，或非特异性抗体混合显示没有PKR恢复。使用反PKR孵育的珠子可以成功地丰富PKR，如存在PKR带和没有GAPDH波段所示。在尝试此过程时，必须记住，在比较系统时，IP 实验以及随后的西方印迹分析应同时完成。

开发后，该技术可用于固定不同的生物分子或材料基板。此外，此方法还具有调整仅曲面属性的额外好处，可根据每个应用程序的需求进行定制。