Name: 量化和站点本地化两个翻译后修改的同步亲和力丰富 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 学习使用抗体同步富集多种翻译后修饰（PTM）并结合数据非依赖采集质谱技术，实现乙酰化和琥珀酰化等修饰的位点定位与定量分析。该方法省时省样，适用于癌症和糖尿病等疾病机制研究。

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我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）共享仪器资助项目对Buck研究所TripleTOF系统的支持（1S10 OD016281）。本研究还获得了美国过敏与传染病研究所（NIAID，R01 AI108255，授予B.S.）以及美国糖尿病与消化道和肾脏疾病研究所（NIDDK，R24 DK085610，授予Eric Verdin；R01 DK090242，授予Eric Goetzman）的资助。X.X. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（T32GM8806，授予Judith Campisi和Lisa Ellerby）的支持；N.B. 获得了 Glenn 医学研究基金会博士后奖学金的支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种用于同时富集多种蛋白质翻译后修饰（PTM）的新技术，以更有效地理解PTM之间的相互作用。实现该目标的其他方法通常耗时过长、成本过高，并且需要大量蛋白质才能成功11,13。本方案提出了一种多PTM富集工作流程，通过将样本同时与两种PTM特异性抗体偶联的磁珠共同孵育，从而提高实验的整体效率。该方法还包括使用数据依赖性采集（DDA）生成谱图库，以及采用数据非依赖性采集（DIA）质谱技术进行检测和定量，以减少碎片离子的干扰22,23。对于DDA采集所得数据，可使用质谱数据库搜索引擎等软件进行分析与定量；而DIA采集所产生的复杂谱图则需借助定量蛋白质组学软件24及特定的DIA定量分析软件25进行解析。
本方案中有多个关键步骤需要严格遵循。由于本方案的主要目标是同时富集多种蛋白质翻译后修饰，抗体亲和富集步骤（第2节）对实验成功至关重要。在对磁珠进行洗涤时，必须确保不会意外吸走任何磁珠。在使用胰蛋白酶消化前（步骤1.8），必须确保尿素浓度已稀释至1 M。尽管在方案前期需要8 M尿素以实现蛋白质溶解，但高于1 M的尿素浓度会抑制胰蛋白酶的酶活性。此外，在整个实验过程中持续监测样品的pH值也非常重要，尤其是在消化反应之前。如果在孵育前样品和胰蛋白酶溶液的pH未被适当中和，可能导致消化效率低下，许多切割位点无法被识别，从而减少可鉴定的肽段数量。
在准备样品时，对实验方案进行一些修改可能会有所帮助。对于从1 mg起始材料中获得的蛋白裂解液，可使用每管PTM扫描管中提供的抗体珠的四分之一，作为节省成本的替代方案。只要相应地增加抗体珠的使用量，使用更多的起始材料可以获得更好的结果。另一种可优化流程的修改是，在胰蛋白酶之外，使用另一种蛋白酶对样品进行消化。该修改将导致被切割肽段的多样性增加，从而提高蛋白质残基的覆盖度。尽管并非必需，但由于胰蛋白酶具有高度的切割特异性，建议在PTM分析中将其作为所用酶之一26。
本方案的一个局限性在于，所研究的翻译后修饰（PTMs）必须具有相似的化学性质，才能实现同时富集14。不同抗体偶联磁珠的操作步骤必须相似，需使用相似的溶剂和溶液，包括相似的洗脱条件，并且最好来自同一供应商。因此，本文所述方法始终以乙酰化和琥珀酰化为例进行说明，二者均使用抗体偶联磁珠（Cell Signaling Technology, Inc）。尽管该方法理论上可应用于任意数量的翻译后修饰，但仍需进一步研究以明确本方案在此方面的具体限制。此外，由于该方法基于抗体富集，因此只能对翻译后修饰位点进行相对定量。
与现有的多PTM富集方法相比，该实验流程是一种更可行且成本效益更高的替代方案。本实验观察到，该方法的效果与单独富集或串联富集等替代方法相比表现极为优异。图2B 显示，与单PTM富集和串联PTM富集相比，一锅法中修饰肽段峰面积的中位变异系数（CV）实际上有所降低13。我们进一步分析了乙酰化或琥珀酰化位点水平的定量结果。此外，Spearman相关性分析（图2C,D）表明，一锅法PTM富集与单PTM富集流程的表现相似，这一结果在肽段水平和碎片离子水平的相关性中也一致成立。在将一锅法与串联PTM富集进行比较时，三种相关性分析均得到相同结论。
本方案使研究人员能够以快速且经济高效的方式，对翻译后修饰（PTM）之间的相互作用获得引人入胜的生物学见解。该工作流程中的DIA组分可帮助研究人员更深入地理解PTM，因为它提供了位点定位信息，并克服了诸如PTM位点占有率低等挑战。在DDA模式下，前体离子往往被排除，这在研究PTM时尤为关键，因为位点占有率通常极低，导致这些肽段无法被选中进行MS/MS分析，但仍可能包含重要信息。后续实验可进一步评估该方法在同时富集PTM种类数量上的上限。未来对该工作流程的改进可能包括开发更先进的软件平台，以进一步实现位点定位和PTM位点占有率分析的自动化。

大量翻译后修饰通过影响蛋白质的活性1、信号传导2以及周转过程3,4，动态调控蛋白质和信号通路。例如，蛋白激酶可通过添加磷酸基团被激活或失活5，组蛋白乙酰化及其他修饰则提供了改变染色质结构并作为转录调控机制的途径6,7。近年来，越来越多的证据表明，多种翻译后修饰协同作用或相互竞争，共同调控蛋白质功能或活性8,9,10,11。因此，理解翻译后修饰之间的串扰已成为翻译后修饰研究中的新兴需求。然而，目前大多数可用于鉴定和定量翻译后修饰位点的蛋白质组学工作流程主要集中于单一修饰，而非多种修饰之间的相互作用。本文所述的工作流程旨在关联特定蛋白质修饰&#34;热点区域&#34;以及被多种不同翻译后修饰所修饰的赖氨酸残基。
科学界日益需要可行的方法来同时研究多种蛋白质翻译后修饰（PTM）12。目前大多数用于全局鉴定和定量多种类型PTM位点的方法均面临挑战，主要由于成本高昂且所需组织量较大12,13。多PTM富集实验不仅在样品制备、数据采集和数据分析方面耗时较长，而且这类研究通常需要大量蛋白质，其用量往往难以满足11。本文描述了一种可同时富集和分析多种PTM的实验方案，该方案克服了上述多项障碍，能够实现大规模PTM谱型分析，并评估不同PTM之间的相互作用14。这一“单管”工作流程为生物医学研究人员提供了一种实用方法，可在全球范围内对多种PTM进行谱型分析，识别共修饰肽段，并以高效且经济的方式研究PTM间的相互调控14,15。
本文通过研究线粒体蛋白质酰化修饰来展示该方法，此类修饰的探索最早可追溯到50多年前16。本研究特别聚焦于赖氨酸乙酰化17和琥珀酰化18，包括这些修饰在蛋白质上的共存现象，甚至在肽段水平上的共修饰。由于本研究采用了Sirtuin 5（SIRT5）基因敲除小鼠模型，因此选择重点富集乙酰化和琥珀酰化位点。这一决策的依据在于，琥珀酰化位点是SIRT5去琥珀酰化酶的作用靶点，预期在基因敲除小鼠中会显著上调，因而成为本研究中最相关的翻译后修饰（PTM）。这两种PTM均具有重要的生物学意义，Carrico等人最近对此进行了综述19。总体而言，乙酰化在基因表达和代谢调控中发挥重要作用，而琥珀酰化已被报道可调节心脏的代谢与功能20。
所述方案可在蛋白起始材料用量较低的情况下进行（例如，1 mg 蛋白裂解液），并通过缩短样品处理、质谱采集和数据分析所需时间，显著减少实验总时长。实验流程示意图见图1。我们还尝试使用更少的起始材料（低至100 µg蛋白裂解液，并相应减少磁珠用量），虽然如预期般会降低鉴定出的酰化肽段的总体得率，但仍可获得高度有价值的结果以及可定量的酰化肽段。
尽管所谓的自上而下（top-down）或中间向下（middle-down）工作流程通常不采用蛋白酶解消化方法（从而保持单个蛋白质内多个翻译后修饰之间的连接性），本方案则聚焦于一种基于肽段的亲和富集方法，以提高翻译后修饰鉴定与定量的深度和灵敏度（图1）。此外，这种以肽段为中心的工作流程采用了现代质谱技术，包括：1）结合数据依赖性采集（DDA）生成谱图库；以及 2）采用数据非依赖性采集（DIA）在无标记工作流程中实现翻译后修饰的精确定量。
数据非依赖采集（DIA）工作流程通过全面碎裂所采样 m/z 范围内所有肽段信号，克服了典型数据依赖采集（DDA）扫描方案中存在的采样随机性21。这一特性在修饰位点定位方面也具有显著优势，因为它更易于获取有关肽段中具体哪些碎片离子发生修饰的信息。此外，DIA 工作流程能够对具有相同前体离子的低丰度翻译后修饰（PTM）肽段异构体进行鉴定和定量。DIA 方法还可以基于始终被全面检测的特异性对应碎片离子，确定肽段中特定的 PTM 修饰位点。然而，DDA 方法通常采用&#34;动态排除&#34;策略，避免对同一前体离子重复采集 MS/MS 谱图，从而可能遗漏低丰度的 PTM 异构体。
本文所述的同时富集策略非常适用于需要对多种翻译后修饰进行全局分析和定量、研究翻译后修饰间的相互作用以及理解翻译后修饰动态交互关系的研究。已有研究通过以下方法在单一整合工作流程中实现多种富集翻译后修饰的鉴定：对含有翻译后修饰的蛋白水解肽段进行全局性、串联式或并行式富集，或者通过对完整蛋白质进行分析。与乙酰化和琥珀酰化的串联富集方法直接比较，一锅法的富集效率已被证实非常相近14。这些替代性方案通常需要大量起始材料，耗时较长，且成本可能极为高昂。相比之下，一锅法提供了一种经济高效的方法，可用于同时富集多种翻译后修饰，并进行后续分析与鉴定。
小鼠肝脏组织取自SIRT5基因敲除小鼠，并在此作为起始材料。本实验方案也可用于来自不同组织或细胞培养实验的蛋白裂解液。该方案适用于从组织或细胞培养沉淀中获得的蛋白裂解液。

<table><tbody><tr><td>1 M 三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，Burdick and Jackson LC-MS 级</td><td>Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国</td><td>36XL66</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor 超声波破碎仪</td><td>Diagenode，德文斯维尔，新泽西州，美国</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>C18 预柱芯片（200 &amp;micro;m × 6 mm ChromXP C18-CL 芯片，3 μm，120 Å</td><td>SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉</td><td>5015841</td><td></td></tr><tr><td>C18-CL芯片（75 &amp;micro;m × 15 cm ChromXP, 3 &amp;micro;米，300 &amp;Aring;)</td><td>SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉</td><td>804-00001</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D9779-5G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Eppendorf AG，德国汉堡</td><td>T1317-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管（2.0 mL Safelock）</td><td>Eppendorf AG，德国汉堡</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>F0507-500ML</td><td></td></tr><tr><td>保留时间（iRT）归一化肽段标准品</td><td>Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦</td><td>Ki-3002-2</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>I1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>mapDIA</td><td></td><td>网页链接</td><td>用于去除DIA数据集干扰的软件</td></tr><tr><td>甲醇，Burdick and Jackson LC-MS 级</td><td>Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国</td><td>BJLC230-4</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 1 超纯水 dispenser</td><td>VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>89204-088</td><td></td></tr><tr><td>Skyline 中的 mProphet</td><td></td><td>整合至 Skyline</td><td>用于FDR评估的集成统计算法</td></tr><tr><td>Oasis HLB SPE 小柱</td><td>Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德</td><td>WAT094225</td><td>用于脱盐蛋白质裂解液的层析柱，最多可处理50 mg样品</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 法测定</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot 5.0 - 质谱数据库搜索引擎</td><td>SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉</td><td>软件下载 SCIEX</td><td>质谱数据库搜索引擎</td></tr><tr><td>PTMScan 琥珀酰赖氨酸基序 [Succ-K] 试剂盒 #13764</td><td>细胞信号技术公司</td><td>13764</td><td>用于亲和富集的抗体磁珠</td></tr><tr><td>PTMScan 乙酰化赖氨酸基序 [Ac-K] 试剂盒 #13416</td><td>细胞信号技术公司</td><td>13416</td><td>用于亲和富集的抗体磁珠</td></tr><tr><td>测序级冻干胰蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Skyline - “定量蛋白质组学软件”</td><td>MacCoss 实验室（学术机构）</td><td>开源软件</td><td>定量蛋白质组学软件（学术版）</td></tr><tr><td>Spectronaut - “DIA 定量分析软件”</td><td>Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦</td><td>Sw-3001</td><td>DIA 定量分析软件 / 翻译后修饰位点定位</td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Savant SPD131DDA Speedvac 浓缩仪</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>SPD131DDA-115</td><td>用于浓缩样品液体体积的仪器</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>85300</td><td>用于组织高效裂解的仪器</td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>T6508-1L</td><td></td></tr><tr><td>TripleTOF 6600：正交四极杆飞行时间（QqTOF）质谱仪</td><td>SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉</td><td>按报价</td><td>高分辨率质谱仪</td></tr><tr><td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC 系统</td><td>美国马萨诸塞州弗雷明汉，SCIEX 公司 Eksigent 分部</td><td>型号 #845</td><td>色谱分离系统</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>PI29700</td><td></td></tr><tr><td>水，Burdick and Jackson LC-MS</td><td>Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国</td><td>600-30-76</td><td></td></tr><tr><td>C18 ZipTip 吸头，P10</td><td>默克密理博有限公司，塔拉格林，卡里戈威，科克郡，爱尔兰</td><td>ZTC18S096</td><td>用于肽混合物脱盐的C-18树脂预装小柱</td></tr></tbody></table>

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

研究蛋白质的多种翻译后修饰（PTM）是理解PTM之间串扰并更全面揭示蛋白质功能的关键步骤。尽管多PTM富集研究具有重要意义，但目前仅有少数研究能够同时分析一种以上的PTM，部分原因在于开展多次全局蛋白质组学分析所需的高昂成本、耗时以及大量蛋白质样本需求。本方案中详述的“&#34;一步法&#34;亲和富集策略克服了这些障碍，能够在样本投入量极低的情况下，同时实现对含有乙酰化和琥珀酰化PTM的赖氨酸残基肽段的鉴定与定量。该方案包括从小鼠肝脏（SIRT5基因敲除小鼠）制备蛋白裂解液、进行胰蛋白酶消化、PTM富集，以及采用数据非依赖性采集（DIA）工作流程进行质谱分析。由于该工作流程允许从同一样本中同时富集两种PTM，因此为研究PTM之间的串扰提供了实用工具，无需大量样本，并显著缩短了样本制备、数据采集和分析所需的时间。该工作流程中的DIA组分可提供全面的PTM特异性信息，这在研究PTM位点定位时尤为重要，因为DIA能够提供完整的碎片离子谱图，可通过计算方法解析以区分不同PTM定位的异构体形式。

图1 展示了实验流程的总体示意图，包括从小鼠肝脏中收获组织，取1 mg蛋白质用于胰蛋白酶消化蛋白质裂解液，将肽段与抗体偶联的磁珠孵育，上机进行质谱检测，最后利用多种定量蛋白质组学软件包（学术及商业软件）对数据进行DIA/SWATH分析。
图2A展示了与当前用于多PTM富集研究的其他方法相比，该工作流程的时间线以及所需样品和蛋白质的用量。与替代方法相比，一锅法所需时间缩短一半，样品数量也减少一半。与两种单PTM富集方法相比，一锅法所需的蛋白质用量也减少一半。
该方案已被证明是一种可行且经济有效的替代方法。 图2B 表明一锅法中修饰肽段面积的中位变异系数（CV）低于单一PTM富集和连续PTM富集方法。 图2C，D 表明，在比较单锅法PTM与单一PTM富集方法时，两种修饰在位点水平定量的相关性之间未显示出显著差异。在肽段水平和片段水平的相关性中也观察到相同结果。在比较单锅法与串联PTM富集方法时，上述三种相关性均呈现一致的观察结果。所有原始质谱数据及与Basisty等近期研究报告相关的处理后Excel结果表格14 可从 MassIVE (MSV00081906) 和 ProteomeXchange (PXD008640) 获取并下载。
总体而言，尽管抗体富集策略可能存在某些局限性，例如潜在的表位遮蔽或特异性有限，但本研究中使用的抗体是由独立制备的克隆混合而成，因此具有更广泛的特异性。
实验结果证明了检测和评估翻译后修饰串扰的可能性。图3展示了成功富集的数据，并提供了一个包含多种不同酰基化修饰的肽段示例，用以可视化翻译后修饰的串扰现象。图3A显示一条肽段在一个赖氨酸残基上发生乙酰化修饰，而在另一个赖氨酸残基上发生琥珀酰化修饰；图3B则显示同一条肽段的两个赖氨酸残基均发生了琥珀酰化修饰。这表明同一赖氨酸残基可被两种不同的酰基化基团修饰，提示在该位点可能存在修饰间的串扰。图4展示了如7.1–7.3节所述被鉴定为同时携带两种修饰的赖氨酸残基数量，进一步提示可能存在翻译后修饰串扰。
如图5所示，使用定量蛋白质组学软件处理DIA PTM数据集，可精确定位发生修饰的特定赖氨酸残基。这一概念称为位点定位，是分析潜在PTM串扰的必要步骤。图5展示了两种可能的异构体，以及每种异构体对应的确认离子和排除离子，这些离子可按照第8.1–8.3节（特别是步骤8.3.2和8.3.3）所述进行可视化和评估。基于这些信息，我们能够明确鉴定出原始样品中存在的两种异构体中的具体一种。经确认的异构体KQYGEAFEKacR的MS/MS谱图清晰显示，包含乙酰化赖氨酸残基的y离子（y2–y5）发生了42 m/z的质量偏移（乙酰基团的增量质量），从而确认了该肽段中发生修饰的特定赖氨酸残基。
<img alt="显示 SIRT5 敲除和野生型肝脏、酰基化赖氨酸肽段及 DDA-MS 的蛋白质分析工作流程图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：PTM 一步富集的典型工作流程。 从小鼠（此处为肝脏）中采集 SIRT5 敲除（KO）和野生型（WT）组织，裂解蛋白质后用胰蛋白酶消化成肽段，并进行脱盐处理。随后使用琥珀酰化和乙酰化抗体磁珠组合通过免疫亲和法富集肽段。平行的质谱工作流程同时检测：1）全裂解液中少量蛋白表达变化（用于蛋白标准化）；以及 2）富集的含酰基肽段，用于酰化位点鉴定（DDA-MS）和定位，随后进行定量分析（DIA-MS）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质修饰分析；图表；乙酰化；琥珀酰化；数据比较；变异系数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：一锅法工作流程与替代方法的比较。（A）一锅法工作流程、串联PTM富集以及两次单独PTM富集在所需时间、成本和材料方面的比较。（B）一锅法工作流程、单独的乙酰赖氨酸PTM富集和单独的琥珀酰赖氨酸PTM富集之间的变异系数（CVs）比较。斯皮尔曼相关性分析比较了一锅法工作流程与单独PTM富集所获得的酰化肽峰面积：对应于（C）乙酰化位点和（D）琥珀酰化位点的log2峰面积结果的散点图。各子图中显示了回归斜率和相关系数14。每种条件下均处理了两个独立的生物学重复。本图经Basisty等14修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3-酮酰辅酶A硫解酶的质谱结果，显示肽段序列及强度与m/z的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：赖氨酸残基乙酰化与琥珀酰化修饰之间的相互作用。 线粒体3-酮酰辅酶A硫解酶的胰蛋白酶肽段的MS/MS谱图，显示相同的氨基酸序列，但在两个赖氨酸残基上具有不同的翻译后修饰。(A) 肽段AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK的MS/MS谱图；(B) 肽段AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK的MS/MS谱图。本图改编自Basisty等14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质修饰维恩图、富集条形图、ATP合酶结构域示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：乙酰化与琥珀酰化赖氨酸残基之间的重叠与相互作用——蛋白质复合物中的具体示例。（A）显示2,235个乙酰化位点与2,173个琥珀酰化位点之间重叠的维恩图。其中，943个位点同时存在乙酰化和琥珀酰化修饰。分析了SIRT5（去琥珀酰化酶）基因敲除小鼠的肝脏，鉴定出大量琥珀酰化位点，其丰度甚至高于正常小鼠肝脏中观察到的水平（修饰肽段的筛选条件为Q值&lt;0.05）。（B）显示其亚基中同时含有乙酰化和琥珀酰化位点的蛋白质复合物所占百分比（红色粗线表示经Fisher精确检验确定的显著性）。（C）ATP合酶复合物示意图：红色标注的蛋白亚基表示含有乙酰化和琥珀酰化位点的亚基。该图改编自Basisty等14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肽乙酰化的质谱分析；包括翻译后修饰位点定位和质谱数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：定量蛋白质组学软件解析翻译后修饰（PTM）的肽段位点定位。 基于肽段的 MS/MS 碎裂，可以提供关于乙酰基所修饰的具体赖氨酸残基的信息。这展示了该软件在翻译后修饰位点定位方面提供有价值信息的能力。（A）赖氨酸残基修饰与翻译后修饰位点定位的两种可能性：KQYGEAFEKacR（左）和 KacQYGEAFEKR（右）。针对该肽段的每种可能的位点定位异构体，分别展示了“确认”和“排除”作用的碎片离子。根据这些信息，赋予确认得分和排除得分，从而确认样品中存在异构体 KQYGEAFEKacR。（B）对应于已确认异构体 KQYGEAFEKacR 的 MS/MS 谱图，显示所有包含乙酰化赖氨酸残基的 y 离子（y2 及更高）均携带 +42 m/z 的增量质量，这与乙酰化修饰相符。观测到的 b 离子则不包含该修饰。（C）提取的离子色谱图（XIC），其中 y2 和 y3 离子产生显著的峰面积，这两个离子共同构成了已确认异构体 KQYGEAFEKacR 中的乙酰化位点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。

研究蛋白质的多种翻译后修饰（PTMs）是理解PTM之间相互作用并获得更全面生物学认知的关键步骤……

本方案描述了一种新颖的技术，通过抗体同时富集多种蛋白质翻译后修饰（PTM），随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以获得关于修饰位点定位及修饰间相互作用的生物学见解。该技术具有高效的时间与成本效益，仅需少量样本输入，即可实现对含有乙酰化和琥珀酰化PTM肽段的同步鉴定与定量。追踪翻译后修饰是表征和应对不同疾病状态的重要步骤。我们已经知道，某些癌症和糖尿病通过这些蛋白质修饰受到高度调控。该方法理论上可应用于任何具有特异性抗体用于富集的蛋白质翻译后修饰，如泛素化、磷酸化等，也可应用于其他组织类型或细胞培养模型。使用该技术获得有价值数据的关键在于可重复性。为实现这一点，必须确保所有步骤都得到仔细操作，尤其是涉及抗体磁珠的步骤。首先，获取含有C18树脂的色谱柱，其结合的蛋白量最多可达10毫克。将这些柱芯装入真空装置中。向柱芯中加入 800 µL 含 19.8% 水的 80% 乙腈和 0.2% 甲酸，启动真空抽吸使液体流过柱芯。重复此步骤一次，注意避免柱芯完全干燥。通过真空抽滤向柱子中加入800微升含0.2%甲酸的水溶液进行平衡，重复两次。将约1,000微升溶液中含有的一毫克肽段通过真空抽滤上样至柱子中。用800微升含0.2%甲酸的水溶液在真空抽滤下将肽段洗涤两次。然后在每个柱子下方放置1.5毫升微量离心管以收集肽段。在真空抽滤下，先用800微升含80%乙腈、0.2%甲酸的19.8%水溶液从柱子中洗脱肽段，再用400微升相同溶液洗脱。将脱盐后的肽样品在真空浓缩仪中完全干燥，持续两到三小时。然后，将干燥的肽重新悬浮于1.4毫升冰冷的1×免疫亲和纯化缓冲液中。涡旋混匀，并确保pH值约为7。在 4 °C 条件下，以 10,000 ×g 离心样品 10 分钟。可见少量沉淀形成。在准备抗体磁珠的同时，将肽置于冰上备用。向一个含有 100 微升 K-乙酰化抗体珠悬液的离心管和另一个含有 100 微升 K-琥珀酰化抗体珠悬液的离心管中各加入 1 毫升冷的 1× PBS，通过移液混匀。将全部溶液转移至新的 1.5 毫升离心管中，在微型离心机中室温离心 30 秒。吸除 PBS，注意避免吸走任何珠粒。再重复洗涤三次。接着，将磁珠重悬于约 440 µL 的 PBS 中。用移液器反复吹打数次，以充分混匀。使用200微升预切枪头，将每种乙酰化赖氨酸抗体磁珠和琥珀酰化赖氨酸抗体磁珠各100微升转移至新离心管中。在微型离心机中离心30秒，用加样枪头吸除上清液。此时磁珠变为白色。将重悬的多肽直接移液至洗涤后的磁珠上，4摄氏度下振荡孵育过夜。次日早晨，在4摄氏度下以2,000 ×g离心30秒。弃去含有未结合多肽的上清液，如需要可保存用于后续实验。加入一毫升冰冷的1×免疫亲和纯化缓冲液至珠子中，通过倒置混匀五次进行洗涤。在4°C条件下，以2,000 × g离心30秒。吸除免疫亲和纯化溶液，再重复免疫亲和纯化洗涤步骤一次。然后向珠子中加入1毫升冷的HPLC水，通过倒置混合五次。在4°C条件下，以2,000 × g离心30秒。吸去水相，并重复水洗步骤额外两次。在4°C条件下，以2,000 × g再离心30秒，使管底残留的任何液体沉降至管底。使用平头凝胶加样枪头，吸去收集的多余液体。注意避免吸出珠粒。向珠中加入 55 µL 含 0.15% 三氟乙酸的水溶液。室温孵育珠子 10 分钟，期间偶尔轻敲管底以混匀。在微型离心机中室温离心珠子 30 秒。使用平头凝胶加样枪头将洗脱的肽段转移至新离心管中。向珠子中加入45 µL含0.15%三氟乙酸的水溶液。室温孵育10分钟，期间偶尔轻弹管底以混匀。在微型离心机中，室温下以12,000 ×g离心5分钟，使任何残留的微珠沉淀。使用平头凝胶加样吸头移除第二次洗脱液，并与第一次洗脱液合并。将合并后的洗脱肽溶液在室温下于微型离心机中旋转30秒。将肽段样品溶液转移至新的500微升离心管中。建立上样方法，将富集后的肽段混合物上样至C18预柱芯片，并用流动相A以每分钟2微升的流速冲洗10分钟，再次对肽段进行脱盐。建立色谱方法，使肽段转移至分析柱，并以每分钟300纳升的流速，使用流动相A和B进行2至3小时的梯度洗脱。具体而言，采用线性梯度，使流动相B的比例在80分钟内从5%升至35%。随后，五分钟内将流动相B线性梯度升至80%，保持80%B八分钟，然后返回至5%B进行25分钟的重新平衡。接下来，建立质谱仪的数据依赖性采集方法。对于实验一，设置MS1母离子扫描范围为质荷比（M/Z）400至1,500。将时长设置为120分钟。创建一个IDA实验并点击确定。在切换条件选项卡下，将电荷态为2至5的离子触发MS/MS扫描的强度阈值设为每秒200计数。将前体离子的动态排阻时间设为60秒。对于实验二，设置 MS/MS 产物离子扫描，MS2 扫描范围为 m/z 100 至 1,500。点击编辑参数，将碰撞能量展宽设为 5，并选择高灵敏度产物离子扫描模式。最后，将样品放入自动进样器中。提交样本队列并启动液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）采集方法，构建用于数据非依赖性采集的质谱仪器方法，并定义两个仪器扫描实验。执行质荷比（m/z）范围为400至1,250的MS1前体离子扫描，持续时间设置为120分钟。将碰撞能量分布设置为10，累积时间设置为45毫秒，然后选择高灵敏度的产物离子扫描模式。接下来，导入一个包含64个可变窗口DIA SWATH采集方案的文本文件，以将SWATH采集窗口填充至方法中。在此采集方案中，质量电荷比范围从5到90的可变窗口以递增方式覆盖400至1,250的质量电荷比全范围，共分为64个SWATH片段，每个片段的累积时间为45毫秒。将MS1的累积时间调整为0.25秒。MS1 扫描和 64 次 MS2 扫描的总周期时间现在应为 3.2 秒。本研究的实验结果记录了检测和评估 PTM 串扰的可能性。此表格展示了工作流程的时间线以及所需样品和蛋白质的用量。与这些替代方法相比，单管法所需时间缩短一半，且样本数量仅需一半。对于修饰肽段面积的变异系数中位数，单管法低于单一PTM富集和连续PTM富集方法。在比较单管PTM与单一PTM富集方法时，两种修饰在位点水平定量的相关性之间未见显著差异。该图展示了一次成功的富集实验数据，说明了一个含有多种不同酰基化修饰的肽段，用以可视化翻译后修饰之间的相互作用。该肽段在一个赖氨酸残基上发生乙酰化修饰，在另一个赖氨酸残基上发生琥珀酰化修饰；而在此处，同一肽段的两个赖氨酸残基均发生了琥珀酰化修饰。这表明同一个赖氨酸残基可被两种酰基化基团修饰，且该位点可能存在修饰间的相互作用。必须确保每个样品中含有相同数量的磁珠，并在洗涤肽键磁珠时避免意外吸走磁珠。基于质谱的分析及使用 Spectronaut 等软件工具进行的数据分析均按照此流程进行，以实现对翻译后修饰的鉴定、定量以及修饰位点定位。这种数据非依赖性采集工作流程结合同步的翻译后修饰富集方法，将有助于更高效地评估翻译后修饰间的相互作用，并加深对翻译后修饰信号通路相关性的理解。

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生物学

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