二维和三维 i 型胶原蛋白基质角质形成细胞增殖的评价

本视频演示了如何使用 I 型胶原蛋白和二维和三维培养方法准备两种不同类型的细胞培养基质。三维培养方法考虑生物环境，演示如何轻松准备三维文化基质对研究有用。在许多细胞类型中，尽管使用相同的胶原蛋白，但二维基基和三维基质之间的细胞行为差异很大。

使用三维培养基质，可以很容易地检查与生物体更相似的细胞行为。此方法非常简单，需要最少的特殊试剂。视觉演示至关重要，因为虽然我们想证明这种方法很容易尝试，但三维凝胶是脆弱的，正确处理它是非常重要的。

首先，准备适当的文化媒介。要开始制备胶原蛋白，请将10x PBS、去维化水、胶原蛋白、96井培养板和空的两毫升管放在冰上。使用移液器，在空的两毫升管中加入1.12毫升的去压水。

将 200 微升 10 倍 PBS 添加到去化水中，轻轻摇动管数次。使用前，立即在两毫升管中加入0.66毫升胶原蛋白。轻轻快速摇动管几次。

将这种胶原蛋白溶液的100微升倒入96孔培养板的每个孔中，确保覆盖整个井面。使用从左到右的运动轻轻摇动板。在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育培养板一小时。

然后倾斜板以确认胶原蛋白的凝胶，然后将培养板移动到干净的长凳上。沿着井壁移液，轻轻将 150 微升 K110 的 K110 倒入凝胶上。在37摄氏度的二氧化碳孵化器中孵育一小时。

在此之后，将培养板移动到干净的长凳上。在细胞培养之前，使用移液器轻轻丢弃 K110。首先使用移液器将四微升胶原蛋白加入 1.2 毫升 1.5 毫升盐酸，然后轻轻混合。

将这种胶原蛋白混合物的100微升倒入新96井培养板的每个井中。以从左到右的运动轻轻摇动板，并在室温下孵育一小时。在此之后，丢弃胶原蛋白溶液。

使用移液器，用 PBS 清洗每个井。在培养板的每个井中加入150个1%BSA和PBS微升，并在室温下孵育一小时。在细胞培养之前，放弃 1%BSA 解决方案。

首先，准备FEPE1L-8细胞和K110，三辛和三辛抑制剂，如文本协议中概述。小心地从培养皿中去除培养皿的介质，并使用移液器添加三毫升 0.05% 的三丁普辛。将菜放回二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育5分钟。

然后使用相位对比度显微镜在10倍放大率检查细胞从培养皿的表面分离。加入三毫升的三辛酶抑制剂，并使用移液器收集15毫升离心管中的分离细胞。在200次g下离心5分钟。

在此之后，丢弃上经剂，并在 K110 的 10 毫升中重新暂停颗粒。使用10倍放大倍率的相位对比度显微镜来计算细胞，用K110稀释细胞，使每毫升的细胞密度为5万个细胞。沿着井壁移液，将0.1毫升的细胞悬浮液轻轻播种到培养板的每个井中。

在37摄氏度的二氧化碳孵化器中孵育，时间长短。首先将130微升四分糖盐和WST-8与1.3毫升预热K110混合在两毫升管中。将培养板移动到干净的工作台上，并使用移液器从井中轻轻丢弃 K110。

用 K110 轻轻洗去非粘合细胞。然后将 110 微升 K110 与 WST-8 混合到每个孔中。在37摄氏度的二氧化碳孵化器中孵育两小时。

在此之后，将培养板移动到干净的长凳上。从每口井收集100个微升的调节介质，并移动到一个新的96孔培养板的井中。使用微孔板读取器，测量 450 纳米的吸光度，并估计可行细胞的数量。

细胞形态在非纤维和纤维形式上观察到，如下所示。在最初两个小时的培养中，细胞在两种形式的胶原蛋白上粘附和扩散。播种后三天，非纤维状细胞继续扩散，细胞数量增加，而纤维状上的细胞表现出有限的扩散。

FEPE1L-8细胞继续在 I 型胶原蛋白的非纤维形式和未经处理的培养皿表面增殖。相比之下，细胞不会在纤维形式上增殖。尝试此过程时，重要的是要记住三维凝胶非常脆弱。

必须小心确保溶液或尖端不会直接接触凝胶。此方法可以通过多种方式进行修改。例如，要混合标本的膜成分，可以制作模仿基底膜的细胞培养基质。

在许多情况下，细胞外矩阵在活体中的功能是未知的。对于三维培养细胞，可以检查与活体更相似的细胞外基质成分的功能。通过应用三维凝胶培养技术，可以有效地测试药物在细胞中的浓度。

该协议基于一个人的目的，可用于开发复杂的三维培养基质，通过混合其他EGM成分或生长因子在凝胶过程中。