Name: 器官Ⅰ型胶原的含量可延展的平台，以评估细胞行为的一个3维的情况下 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解利用大鼠尾腱提取的I型胶原与成纤维细胞构建三维基质的方法，用于研究肿瘤细胞侵袭和迁移行为。该技术结合免疫组化染色与荧光显微镜，为癌症转移研究提供可靠的体外模型。

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1. 从皮肤外植体建立成纤维细胞培养
<ol>
	<li>从人体前臂获取的4 mm穿刺活检组织置于MEM培养基中，该培养基添加100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和0.25 μg/ml两性霉素B（Fungizone）。</li>
	<li>去除任何皮下脂肪，并通过在培养皿底部来回 rocking 24号手术刀片将活检组织切成细小碎片。</li>
	<li>将组织匀浆放入25 cm2组织培养瓶中，加入原代成纤维细胞生长培养基（MEM培养基补充10%胎牛血清、100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和25 μg/ml两性霉素B），加至培养瓶表面被覆盖但液体深度不足以使组织漂浮为止。</li>
	<li>在37°C、含5% CO2的湿润环境中孵育3天后，加入3 ml原代成纤维细胞生长培养基。</li>
	<li>再孵育3天后，更换为新鲜的原代成纤维细胞生长培养基；若细胞接近融合，可按1:4比例传代至新鲜培养基中。（从此步骤开始可省略两性霉素B）。</li>
</ol>
2. 第一阶段——从大鼠尾部制备I型胶原蛋白
注意：适用于约12-14条青春期大鼠尾巴（新鲜或冷冻）的实验方案
<ol>
	<li>用70%乙醇清洗大鼠尾巴，并按以下步骤去除肌腱：</li>
	<li>用解剖刀从尾部顶端至底部沿中线切开皮肤，然后沿尾部长度方向剥离，去除皮肤。</li>
	<li>从尾部近端核心区域分离肌腱。</li>
	<li>使用有齿镊子将肌腱向尾部远端剥离，注意避免损伤鞘膜。</li>
	<li>将1 g肌腱加入250 ml 0.5 M乙酸中，在4°C下搅拌提取48小时。</li>
	<li>将提取液在7,500 × g条件下离心30分钟，弃去沉淀。</li>
	<li>向 supernatant 中加入等体积的10% (w/v) NaCl溶液，搅拌30–60分钟。</li>
	<li>在10,000 × g条件下离心30分钟，弃去上清液，将沉淀物重新溶解于0.25 M乙酸中（体积比约为1:1），在4°C下搅拌24小时。</li>
	<li>将胶原溶液置于6–8次更换的6 L约17.5 mM乙酸溶液中透析（每升冷水中加入1 ml冰乙酸，每日更换2次）。</li>
	<li>将透析后的胶原溶液在30,000 × g条件下离心1.5小时。</li>
	<li>移除上清液，将沉淀物转移至无菌烧瓶中。</li>
	<li>在4°C条件下，用0.5 mM乙酸将I型胶原浓度调节至约2 mg/ml。</li>
</ol>
3. 第二阶段——构建含有包埋成纤维细胞的三维基质（允许收缩8天）。
<ol>
	<li>在预冷的容器中，于 4°C 下使用冷的试剂配制混合液。胶原蛋白 I 需保持在冰上。</li>
	<li>对于一个 T75培养瓶的汇合原代成纤维细胞（约细胞数量 1 × 106），使用以下组分：
	<ul>
		<li>25 ml 大鼠尾部胶原蛋白（浓度约 2 mg/ml）</li>
		<li>3 ml 10×MEM</li>
		<li>0.22 M NaOH：先加入 2 ml，然后在搅拌下逐滴加入，直至胶原液变为橙色，</li>
		<li>但不可变为粉红色（通常总量不超过 3 ml）。pH 约为 7.2。</li>
		<li>注意：必须确保培养基/凝胶保持中性或微酸性，因为成纤维细胞在暴露于轻微碱性条件时将无法收缩凝胶。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>用胰蛋白酶消化成纤维细胞，400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在上述 5 分钟离心期间：准备 12 个 35 mm 塑料培养皿——通常一个培养瓶的成纤维细胞/胶原混合液可制备 12 个培养皿。</li>
	<li>将成纤维细胞重悬于 3 ml 胎牛血清（FCS）中，并立即加入胶原混合液中，充分搅拌。</li>
	<li>尽快将约 2.5 ml 胶原/成纤维细胞混合液接种至每个培养皿中。尽量避免产生气泡及胶原提前凝固。</li>
	<li>将胶原置于 37°C、含 5% CO2 的湿润空气中孵育 10 分钟，使其凝固。</li>
	<li>每皿加入 1 ml 成纤维细胞生长培养基（DMEM + 10% FCS）。</li>
	<li>用移液器将胶原/成纤维细胞基质从培养皿边缘剥离。</li>
	<li>次日：每皿加入 1 ml 成纤维细胞生长培养基（DMEM + 10% FCS）。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基。让胶原/成纤维细胞基质收缩约 8 天，直至其可放入 24 孔板中（直径由约 3.5 cm 收缩至 1.5 cm，见图 1）。</li>
</ol>
注意：胶原蛋白浓度应根据具体应用进行调整。胶原溶液越稀，成纤维细胞对其收缩的速度越快。即使浓度相同，不同批次的胶原蛋白也会导致收缩速率存在轻微差异。同样，不同培养的成纤维细胞对胶原凝胶的收缩速率也各不相同，成纤维细胞数量越多，收缩速率越快。因此，可通过调整胶原蛋白浓度和成纤维细胞密度来调控收缩速率以及胶原凝胶的最终密度。
4. 第二阶段 - 将目标细胞接种至基质上
注意：使用前需用乙醇对所有镊子和设备进行灭菌。
<ol>
	<li>使用钝头镊子将收缩的基质轻轻转移至24孔板中，注意避免折叠。</li>
	<li>将目标细胞重悬于约 4 × 104 /ml 的浓度，取1 ml（胰酶消化后，离心去除胰酶）接种于基质表面。实际所需细胞数量因细胞类型而异。细胞培养基应为目标细胞的常规生长培养基。</li>
	<li>让细胞在基质表面生长至完全融合，大约需要3–5天。</li>
</ol>
5. 第三阶段——将基质转移至网格以进行侵袭（约0-21天）
<ol>
	<li>将不锈钢网格切割成三脚架形状，并在使用前进行高压灭菌（见图2）。</li>
	<li>将无菌网格置于6 cm培养皿中，加入培养基至高于网格水平（约10.5 ml）。将基质置于网格上，轻轻吸除培养基，使基质底部与培养基接触但不完全浸没。此状态称为空气/液体界面，可形成促进细胞侵袭的梯度。每两天更换一次培养基（见图2）。</li>
	<li>在此阶段或更早阶段，可对表达荧光蛋白的活细胞进行具有组织环境背景的成像。收缩态或纤维状的I型胶原可通过二次谐波生成（SHG，见图3）进行成像。结合多光子激发与宽场探测技术，我们发现SHG信号可至少深入基质100 μm，而表达胞质GFP的细胞可被成像至至少200 μm深度。</li>
</ol>
注意：关于侵袭的定量分析，将基质放置于网格上的当天定义为第0天。将基质置于网格上可形成细胞培养基的浓度梯度，从而促进细胞向基质内侵袭。可在接下来的1至21天（或更长时间）内对样本进行成像，以评估侵袭、增殖、存活或分化等生物学过程（参见参考文献列表）。
6. 第四阶段——固定
<ol>
	<li>在 Falcon 管中加入 5 ml 的 4% 多聚甲醛（PFA）。</li>
	<li>将基质转移至平坦表面，用一把新的洁净解剖刀将基质切成两半（因需对横切面进行染色），用解剖刀挑起基质并转移至 4% PFA 中，过夜固定。</li>
	<li>此时类器官型基质已准备好，可使用选定的抗体或染料进行染色（见图 3）。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
<img alt="胶原蛋白-成纤维细胞收缩过程；成纤维细胞凝胶在6-8天内的收缩情况，实验设置。" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1 成纤维细胞收缩的I型胶原蛋白示例。 成纤维细胞与大鼠尾部胶原蛋白混合物从培养皿上脱离后，在6-8天内发生收缩。
<img alt="类器官培养实验示意图及用于研究肿瘤细胞侵袭与成纤维细胞相互作用的培养皿设置。" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2 类器官培养实验的进程。A，类器官培养系统的示意图及其实验流程。B，不锈钢无菌网格上形成胶原/成纤维细胞基质的示例，用于建立气液界面。
<img alt="胰腺导管腺癌组织学：P53突变与非侵袭性；胶原分析示意图。" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3 类器官培养实验的应用。A, B 胰腺导管腺癌（PDAC）非侵袭性和侵袭性细胞随时间在类器官基质中侵袭的情况。C，活体皮肤等效物，显示成纤维细胞收缩的胶原性真皮组分上形成分层的表皮。D，C8161黑色素瘤细胞侵入成纤维细胞收缩的胶原性真皮等效物中。E，侵袭性PDAC细胞（绿色）在类器官基质中与成纤维细胞（红色）相互作用并发生侵袭。F，侵袭性PDAC细胞（绿色）与周围正在降解的细胞外基质（紫色）相互作用，通过基于多光子的二次谐波成像技术进行可视化观察。

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

在此，我们介绍一种用于侵袭性细胞迁移研究的三维基质制备方法 6-8基质由I型胶原纤维构成，这些纤维在数天内被原代人表皮成纤维细胞收缩。胶原通过酸提取法而非酶消化法制备，从而保留了多肽末端的反应活性，并在缓冲体系中和后促进胶原纤维交联形成更大的聚集体。 9这会形成一种重组凝胶，其特性更接近于胶原蛋白的特征 体内 并且对在凝胶中培养的细胞的侵袭特性具有重要意义。起始材料是新鲜的还是冷冻的并无影响，但使用青春期大鼠尾巴至关重要，因为年轻动物的胶原交联更为不稳定。因此，来自较年轻动物的I型胶原更容易提取，并且能够以更高的保真度重新构建。
可对胶原蛋白基质进行固定，并使用特异性针对侵袭性肿瘤细胞或基质成纤维细胞的抗体进行染色2,10，该方法在检测可能抑制侵袭的药物疗效方面具有重要应用价值5,6。
尽管本方案建议使用原代人皮肤成纤维细胞，但根据所研究的组织类型，也可使用来自其他组织类型的原代成纤维细胞。此外，还可以使用永生化成纤维细胞建立培养体系，包括稳定转染了荧光蛋白偶联物的细胞。通过这种方法，可对基质细胞和肿瘤细胞进行标记，以观察侵袭过程中细胞间的相互作用11。

<table><tbody><tr><td>10x MEM</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>21430</td><td>-</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-500G</td><td>用蒸馏水配制 0.22 M 储存液</td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-101</td><td>-</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td>用于步骤 3.4</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Falcon BD</td><td>353004</td><td>用于步骤 5.2</td></tr><tr><td>钝头弹簧镊</td><td>Samco Scientific，Thermo Fisher Scientific</td><td>E003/02</td><td>带齿，非光滑</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>使用前用 PBS 稀释至 4%</td></tr><tr><td>cd-1 筛网，40 目</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S07707-5EA</td><td>不锈钢筛网，每包 5 个</td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Medicell International</td><td>7607 2295</td><td>12 - 14 kD</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxford Labware</td><td>BR0014G</td><td>-</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>-</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td>用于步骤 4.1</td></tr><tr><td>两性霉素 B（Fungizone）</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td>-</td></tr></tbody></table>

三维环境中的细胞行为评估：可调节的i型胶原类器官培养检测平台

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

细胞迁移在生物学的许多方面具有基础性作用，包括发育、伤口愈合、免疫系统的细胞反应以及肿瘤细胞的转移。为了便于通过光学显微镜研究细胞动态，细胞迁移通常在玻璃盖玻片上进行研究。然而，越来越多的研究表明，细胞迁移的许多特征依赖于局部微环境的特性，例如其弹性、蛋白质组成和孔径大小，而这些特性无法通过玻璃或塑料等刚性二维基质得到真实再现1。此外，与其他细胞类型（包括基质成纤维细胞2和免疫细胞3）的相互作用已被证明在促进癌细胞侵袭过程中发挥关键作用。在分子水平上的研究 increasingly 表明，相同细胞在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下对药物处理等分子动态的响应存在显著差异4。
理想情况下，最好在活体生物的自然环境中研究细胞迁移，但这并不总是可行的。因此，中间组织培养系统（如细胞来源基质、Matrigel、类器官培养（本文所述）、组织外植体、类器官和异种移植）是重要的实验中间模型。这些系统能够模拟某些体内环境的特征，同时更便于进行实验操作，例如使用稳定转染的细胞系、药物处理方案、长期和高分辨率成像。这类中间系统特别适用于验证探针的有效性，并在开展体内5成像之前确定细胞动态响应及荧光报告分子成像所需的参数。因此，它们在减少对活体动物实验的需求方面具有重要作用。

本文描述了一种制备由I型胶原和原代人成纤维细胞组成的三维基质的方法。这种类器官凝胶能够模拟组织间质的基本特征，适用于多种显微镜观察，因此是评估细胞侵袭性迁移的有用基质。

三维环境中的细胞行为评估：可调节的I型胶原类器官培养检测平台

细胞迁移对于生物学的许多方面都至关重要，包括发育、伤口愈合、免疫系统的细胞反应，以及……

本实验的总体目标是建立一种类似组织的三维胶原基质，以研究细胞功能。首先从大鼠尾部肌腱中提取胶原蛋白，然后在成纤维细胞存在的情况下重新构建胶原纤维，使成纤维细胞能够收缩胶原凝胶。第三步中，将肿瘤细胞置于基质的上方作为最后一步。将基质置于金属网格上方进行孵育，以形成气液界面，从而允许肿瘤细胞向基质内侵袭。最终，可通过免疫组织化学染色和荧光显微镜分析基质合成、细胞迁移，包括肿瘤细胞的侵袭以及不同类型细胞之间的相互作用。因此，该方法非常适合用于研究肿瘤的侵袭和转移，以及肿瘤的发生发展。在复杂的三维S上，我们可以观察分化、细胞存活和细胞增殖等现象。尤其是，我们能够研究肿瘤细胞在侵袭关键事件中与间质的相互作用。癌症转移过程的最早阶段之一是通过皮肤组织植入物建立成纤维细胞培养。首先，在培养皿底部加入几滴添加了青霉素、链霉素和两性霉素的 MEM 培养基。然后将从人前臂获取的 4 毫米直径的活检组织放入培养皿中。接下来，最后一步是将活检组织切成小块，通过在培养皿底部来回晃动24号手术刀片完成。将组织匀浆放入一个25平方厘米的组织培养瓶中。然后向组织上倒入原代成纤维细胞生长培养基。这足以覆盖培养瓶的表面，但不足以使组织漂浮。将培养瓶置于含5%CO2的湿润环境中，37摄氏度孵育3天，随后再孵育3天后加入3毫升原代成纤维细胞生长培养基。更换新鲜的原代成纤维细胞生长培养基。如果细胞接近完全融合，可将细胞以1:4的比例分种到含有新鲜培养基的新培养瓶中。首先，用70%乙醇清洗大鼠尾部，并将0.5摩尔乙酸溶液瓶置于4摄氏度预冷，以用于从大鼠尾部取出肌腱。第一步，剥离每根大鼠尾部的皮肤。接下来，将肌腱从尾部近端区域的中心部分剥离。最后，使用有齿镊子将肌腱向尾部远端方向移除。肌腱去除后，在玻璃锥形瓶中加入250毫升0.5摩尔的乙酸。在肌腱提取后，每250毫升酸中加入一克肌腱，在4°C下搅拌提取48小时。将酸与肌腱的混合液在4°C下以7,500 × g离心30分钟，弃去沉淀。然后向上清液中加入等体积的10%（重量/体积）NaCl溶液，在第二次搅拌步骤后继续搅拌30至60分钟。将溶液离心成沉淀。此次离心条件为10,000 × g，弃去上清液，将沉淀重新溶解于0.25摩尔的乙酸溶液中，于4摄氏度下继续搅拌24小时。接着，将胶原蛋白溶液对约17.5毫摩尔的乙酸溶液进行透析，共更换6至8次，每次使用6升透析液。将透析后的胶原在30,000 × g条件下离心1.5小时。最后，将上清液转移至无菌瓶中，用预冷的0.5毫摩尔/升乙酸将胶原浓度调节至约2毫克/毫升，然后将胶原置于冰上保存。首先，选取三瓶汇合的T75原代成纤维细胞培养瓶。将一容器FCS置于4摄氏度环境中冷却。接着，将75毫升预先配制的大鼠尾胶原加入一个已预冷的100毫升无菌玻璃瓶中。然后在搅拌混合物的同时加入9毫升10 XMEM。当接近最后一毫升时，缓慢加入6毫升0.22 N的氢氧化钠，以确保最终颜色介于橙色与粉红色之间。用胰蛋白酶处理成纤维细胞，然后在室温下以400 × g离心5分钟收集细胞沉淀。离心后，准备36个35毫米的塑料培养皿。将沉淀物重悬于10毫升预冷的胎牛血清（FCS）中，并立即将成纤维细胞加入胶原溶液中。混匀后，尽快将每35毫米培养皿中加入约2.5毫升的胶原-成纤维细胞混合物，进行搅拌和铺板。 避免产生气泡和胶原凝固。将培养皿放入培养箱中孵育10分钟，使胶原形成松散的凝胶，然后向每皿中加入1毫升成纤维细胞生长培养基。接着用移液器将胶原-成纤维细胞基质从培养皿边缘剥离，并将培养皿重新放回培养箱中。第二天，在培养皿中再加入1毫升Fiberblast生长培养基。随后每隔一天更换一次培养基，持续约八天。在此期间，每个胶原成纤维细胞基质的直径应从约3.5厘米收缩至约1.5厘米。在开始下一步操作前，需用乙醇对所有镊子和其他器械进行灭菌处理。然后使用钝头灭菌镊子，轻轻将收缩的基质转移至24孔板的一个孔中，确保基质不折叠。接下来，选取待研究的细胞培养瓶，用三把刀片刮取细胞并像之前一样离心收集细胞，再将细胞重悬于培养基中，取一毫升细胞悬液加至基质上方，并将带有细胞的基质放入培养箱中，直至细胞在基质表面生长至接近汇合。在使用前约三至五天，将预先切割好的不锈钢网格进行高压灭菌以制备三脚架结构，将无菌网格放入一个6厘米的塑料培养皿中，加入足量的生长培养基以覆盖网格。建立气液界面是该实验步骤中最精细的部分。需将基质置于网格上，然后轻柔地吸去上层培养基，使基质底部仍部分浸没在培养基中，并从底部获得营养。这样可形成化学趋化梯度，促使表面的细胞开始向基质内侵袭。在此装置中，可对细胞行为进行长达21天或更长时间的评估。将基质放置在网格上，随后轻轻吸除培养基，直至基质底部与培养基接触，但未被培养基覆盖。此时，气液界面应与此处所示场景相似。接下来，将浸润的基质转移至平坦表面，用新的手术刀将基质切成两半，然后用手术刀挑起基质并转移至4%PFA中。将基质在室温下固定过夜。在接下来的两张图中，胰腺导管腺癌细胞（P DAC细胞）被铺在器官型基质上。在第一张图中，可见非侵袭性P dac细胞以一层形式位于基质表面；而在第二张图中，可见已侵入基质的侵袭性P dac细胞。此处还可观察到一种活体皮肤等效物，其具有分层的表皮结构以及由成纤维细胞收缩形成的胶原性真皮组分。绿色的侵袭性PD细胞与红色的成纤维细胞相互作用，后者促进PDX细胞向器官型基质中的侵袭。此处再次以绿色显示的侵袭性 PD 细胞位于胶原基质内，胶原基质通过二次谐波成像，呈紫色；基质降解部位在紫色基质中表现为暗色孔洞。该图显示了 C8161 黑色素瘤细胞侵袭成纤维细胞收缩的胶原性真皮等效物的情况。此外，在本实验中，除了观察荧光蛋白在基本过程中的行为外，还可结合免疫组织化学染色，用于检测细胞增殖标志物及细胞存活差异等。

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中脑多巴胺系统和纹状体的外植体被用于胶原基质实验，以研究 体外...

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本文介绍了一种可对胶原蛋白进行荧光标记的方法，该方法可用于3D细胞培养物的固定后成像和活细胞成像。我们还提供了一种优化的实验方案，用于可视化在3D环境中培养的细胞内源性细胞骨架蛋白。...

揭示三维环境中侵袭性癌细胞的细胞骨架组织

细胞迁移是一种生物学现象，参与多种生理过程（如伤口愈合和免疫反应）以及病理生理过程（如癌症）。三维胶原基质迁移实验是一种多功能工具，可用于分析不同类型细胞在类似三维生理环境中的迁移特性。...

三维胶原基质中细胞迁移的分析

细胞外基质的力学性质和微观结构对细胞的三维迁移具有显著影响。 体外...

用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。...

在细胞外基质中构建三维上皮组织

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。...

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

本文介绍了一种在三维（3D）细胞外基质中培养 IDG-SW3...

在三维细胞外基质中培养 IDG-SW3 细胞

本方案概述了在细胞外基质水凝胶支架上由A549肺泡上皮细胞和MRC-5肺成纤维细胞生成类器官，随后将其包埋于三维胶原凝胶中，并利用细胞拉伸生物反应器施加机械应变，以研究肺泡机械生物学。...

利用机械细胞拉伸生物反应器生成三维胶原嵌合A549/MRC-5肺泡类器官

了解利用大鼠尾腱提取的I型胶原与成纤维细胞构建三维基质的方法，用于研究肿瘤细胞侵袭和迁移行为。该技术结合免疫组化染色与荧光显微镜，为癌症转移研究提供可靠的体外模型。

三维环境中的细胞行为评估：可调节的I型胶原类器官培养检测平台

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