器官Ⅰ型胶原的含量可延展的平台，以评估细胞行为的一个3维的情况下

该程序的总体目标是建立类似 3 维胶原蛋白基质的组织来研究细胞功能。这是通过首先从大鼠尾部肌腱中提取胶原蛋白来实现的。接下来，胶原纤维在成纤维细胞存在下重构，以使成纤维细胞收缩胶原凝胶。

在第三步中，肿瘤细胞在最后一步中位于基质的顶部。将基质在金属网格顶部孵育，以形成气液界面，以允许肿瘤细胞侵入基质。最终，可以进行免疫组织化学染色和荧光显微镜检查来分析基质合成细胞迁移，包括肿瘤细胞侵袭和不同细胞类型之间的相互作用。

因此，这种方法非常适合观察侵袭和转移，以及观察肿瘤发展。在复杂的三维 S 上，我们可以查看分化、细胞存活和细胞生长等内容。但特别是，我们可以观察肿瘤细胞在侵袭的关键事件期间如何与基质相互作用。

癌症转移本身的最早部分之一 从皮肤植入物建立成纤维细胞培养物。首先，在培养皿底部放置几滴补充有青霉素、链霉素和真菌区的 MEM。然后将从人类前臂获得的四毫米穿刺活检放入培养皿中。

接下来，最后，通过在培养皿底部摇动 24 号手术刀刀片，将活检切成小块。将组织浆液放入 25 厘米见方的组织培养瓶中。然后将原代成纤维细胞生长培养基倒在组织上。

这足以覆盖培养瓶的表面，但不足以使组织漂浮。将培养瓶在 37 摄氏度下在 5% CO2 的潮湿气氛中孵育 3 天，然后在再过 3 天后加入 3 毫升初级成纤维细胞生长培养基。孵化。用新鲜的初级 Fiberblast 生长培养基更换培养基。

如果细胞几乎汇合，则可以将它们一到四个分装到装有新鲜培养基的新培养瓶中。首先用 70% 乙醇清洗大鼠尾巴，将一瓶 0.5 摩尔乙酸在 4 摄氏度下冷却，以去除大鼠尾巴上的肌腱。首先，去除每只老鼠尾巴的皮肤。

接下来，将肌腱从尾部近端区域的核心分离。最后，使用齿镊将肌腱朝向尾巴远端区域去除。去除肌腱后，将 250 毫升 0.5 摩尔乙酸加入玻璃锥形瓶中。

提取肌腱后，在 4 摄氏度下搅拌 48 小时，每 250 毫升酸提取 1 克肌腱。将酸和肌腱溶液在 4 摄氏度下以 7、500 倍 G 离心 30 分钟，然后弃去沉淀。然后向上清液中加入等体积的 10% 重量的 NACL，并在第二个搅拌步骤后再搅拌 30 至 60 分钟。

沉淀溶液。此时在 10， 000 倍 G 时，弃去上清液，红 将沉淀溶解在 0.25 摩尔乙酸中，在 4 摄氏度下多搅拌 24 小时。接下来，透析胶原蛋白溶液，防止 6 升约 17.5 毫摩尔乙酸的 6 到 8 次变化。

透析沉淀后，以 30， 000 倍 G 的浓度沉淀胶原蛋白 1.5 小时。最后，将 supra natin 转移到无菌瓶中，用先前冷却的 0.5 毫摩尔乙酸将胶原蛋白浓度调节至每毫升约 2 毫克，然后将胶原蛋白保存在冰上。首先，选择三个汇合原代成纤维细胞的 T 75 培养瓶。

将 FCS 容器置于 4 摄氏度冷却。接下来，将 75 毫升先前制备的大鼠尾胶原蛋白加入 100 毫升玻璃预冷无菌瓶中。然后加入 9 毫升 10 XMEM，同时搅拌混合物。

加入 6 毫升 0.22 正常氢氧化钠，当接近最后一毫升时减慢速度。确保最终颜色介于橙色和粉红色之间。胰蛋白酶观察成纤维细胞，然后在室温下以 400 倍 G 的浓度沉淀细胞 5 分钟。

在旋转过程中，组装 36 个 35 毫米的塑料盘。将沉淀重悬于 10 毫升预冷的 FCS 中，并立即将成纤维细胞添加到胶原蛋白中。尽快混合并搅拌每 35 毫米培养皿中约 2.5 毫升胶原成纤维细胞混合物。

避免气泡和胶原蛋白凝固。将培养皿放入培养箱中 10 分钟，让胶原蛋白形成松散的凝胶，然后向每个培养皿中加入 1 毫升 fiberblast 生长培养基。然后用移液管从培养皿的侧面分离胶原纤维母细胞基质，将培养皿放回培养箱中。

第二天，在培养皿中再添加一毫升 Fiberblast 生长培养基。然后在接下来的 8 天内每隔一天更换一次媒体。在此期间，每个胶原成纤维细胞基质的直径应从约 3.5 厘米收缩到约 1.5 厘米，然后再开始下一步，用乙醇对所有镊子和设备进行消毒。

然后使用钝器消毒的镊子，轻轻地将收缩的基质移动到 24 孔板的孔中，确保基质不会折叠。接下来，像以前一样选择要研究的细胞瓶和沉淀细胞，然后将细胞重悬于培养基板中，将一毫升细胞悬液置于基质顶部，并将收缩的基质放入培养箱中，直到细胞生长到几乎汇合，直到基质顶部。在使用前将预切割的不锈钢网格用于制作三脚架的高压灭菌后大约 3 到 5 天，在 6 厘米塑料皿中的无菌网格添加足够的生长介质以覆盖网格。

创建气液界面是此过程中最微妙的部分。必须将基质放在网格上，然后轻轻地将培养基吸出，使基质仍部分从底部浸没并从底部进料。这会产生趋化梯度，并允许顶部的细胞开始侵入基质。

然后可以在 21 天或以上评估此设置中的细胞行为。将矩阵放在网格上。接下来，轻轻吸出培养基，直到基质底部与培养基接触，但未被培养基覆盖。

然后，air liquid 界面应与此处的场景类似。接下来，将浸润的基质转移到平坦的表面上。用新鲜的手术刀将基质切成两半，然后用手术刀提起基质并将其转移到 4% PFA 中。

室温下将基质固定过夜，在以下两张图中，胰腺导管腺癌细胞或 P DAC 细胞分层在器官型基质上。在第一张图中，可以在基质顶部的一层中看到非侵袭性 P dac 细胞，而在第二张图中，这里观察到已经浸润基质的侵袭性 P dac 细胞，在这里可以看到一个活的皮肤等效物，显示成纤维细胞收缩的胶原真皮成分上的分层表皮。可以看到绿色的侵袭性 PD 细胞与红色的成纤维细胞相互作用，这促进了 PDX 细胞侵袭器官型基质。

此处再次以绿色显示的侵袭性 PD 细胞在胶原基质中可视化，该基质使用二次谐波生成进行成像，并以紫色显示基质降解位点，在紫色基质内显示为黑孔。在该图 C 8 1 61 中，显示了侵入成纤维细胞收缩的胶原蛋白真皮等效物的黑色素瘤细胞，以及观察该测定过程中荧光蛋白基本过程的行为。您也可以将此 asay 与免疫组织化学染色一起使用，以查看细胞增殖标志物和细胞存活的差异等。