Name: 工程三维上皮组织细胞外基质中嵌入 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习利用软光刻技术构建嵌入胶原蛋白凝胶中的三维上皮组织阵列，实现高通量筛选和精确调控物理生化因素，为研究机械应力对分支形态发生的影响提供可控可重复的平台。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助（HL118532、HL120142、CA187692）以及David &amp;#38; 露西尔·帕卡德基金会，卡米尔 &amp;#38;亨利·德雷福斯基金会以及伯勒斯威康基金。A.S.P. 部分受普罗克特荣誉奖学金（Charlotte Elizabeth Procter Honorific Fellowship）资助。

1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制5 mg/ml的胰岛素溶液：将胰岛素粉末溶于含5 mM盐酸（HCl）的dH2O中（即500 mg胰岛素溶于100 ml溶剂）。通过向100 ml蒸馏水（dH2O）中加入50 μl浓盐酸配制100 ml溶剂。</li>
	<li>配制1x磷酸盐缓冲液（PBS）：在无菌条件下，用dH2O将10x PBS储备液稀释至1x。</li>
	<li>配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体溶液：按10:1（w:w）的质量比将PDMS预聚物与固化剂混合。</li>
	<li>配制细胞培养基：向500 ml的Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F-12）储备液中加入10 ml无菌胎牛血清（FBS）、500 μl庆大霉素试剂和500 μl 5 mg/ml胰岛素溶液。</li>
	<li>配制1%牛血清白蛋白（BSA）的1x PBS溶液：将BSA粉末以1%（w:v）的比例加入1x PBS中，充分混匀。</li>
	<li>配制4 mg/ml中和的牛I型胶原蛋白溶液：在预冷的1.5 ml微量离心管中加入50 µl 10x Hank's平衡盐溶液（HBSS）缓冲液、30 µl 0.1 N氢氧化钠（NaOH）、30 µl细胞培养基和400 µl胶原蛋白储备液。通过移液器缓慢吹打混匀，避免产生气泡。如有气泡，可在4 °C短暂离心以去除。</li>
	<li>配制固定液：将16%多聚甲醛按1:4（v:v）体积比用1x PBS稀释。</li>
	<li>配制细胞核标记溶液：将储备的细胞核标记溶液按1:1,000（v:v）体积比用1x PBS稀释。</li>
	<li>配制0.3%磷酸盐缓冲液与去垢剂（PBST）溶液：将1x PBS与0.3%（v:v）去垢剂混合。</li>
	<li>配制封闭缓冲液：将山羊血清按1:10（v:v）体积比用0.3% PBST稀释。</li>
	<li>配制目的蛋白的一抗溶液：将一抗（例如兔抗黏着斑激酶（FAK）抗体）按1:200（v:v）体积比用封闭缓冲液稀释。</li>
	<li>配制二抗溶液：将荧光探针偶联的二抗（例如山羊抗兔抗体）按1:1,000（v:v）体积比用封闭缓冲液稀释。</li>
</ol>
3D 微图案化用弹性印章的制备
注意：弹性印章使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。
<ol>
	<li>按照步骤1.3中所述相同比例制备PDMS溶液，并充分混合。将混合液置于真空腔中15–30分钟，以去除混合过程中引入的气泡。</li>
	<li>将脱气后的溶液倒入含有硅模板的塑料称量舟或培养皿中，该硅模板通过光刻技术制备出所需几何形状的微结构。为获得最佳效果，将PDMS溶液在60 °C下固化约12小时。 
	注意：硅模板具有高度可定制性；本方案使用尺寸为50 μm × 200 μm × 50 μm、间距为200 μm的矩形结构。硅模板可通过标准光刻技术制备。简而言之，将基于环氧树脂的光刻胶旋涂于硅片表面，然后将描绘所需印章结构的掩模置于光刻胶涂层上，并用紫外光照射。未被掩模遮挡的区域接受光照，光刻胶发生交联，而其余部分可溶，可通过冲洗去除。</li>
	<li>当PDMS在硅模板的所需结构周围完全固化后，将PDMS与模板从塑料容器中取出。小心地将PDMS从硅片上剥离，并使用洁净的刀片去除印模结构周围的多余PDMS。</li>
	<li>接着用刀片将带有印模结构的PDMS切割成单个矩形印章（约8 mm × 5 mm）。将这些印章正面朝上存放于洁净的直径100 mm的培养皿中。</li>
	<li>此外，使用步骤1.3中所述的PDMS溶液制备矩形印章的支撑结构。</li>
	<li>使用旋涂仪将约2–3 g PDMS溶液均匀涂布于直径100 mm的培养皿上，并在60 °C下固化约12小时（同步骤2.1）。随后用刀片将固化的薄层PDMS切割成矩形（约5 mm × 2 mm）。 
	注意：每个在步骤2.3中制备的PDMS印章需要两个支撑结构。支撑结构可与PDMS印章一同存放于直径100 mm的培养皿中。</li>
	<li>在将PDMS印章和支撑结构用于细胞培养前，需将其浸入70%乙醇中进行灭菌，并在生物安全柜（细胞培养操作台）中使用抽吸装置干燥。</li>
</ol>
3. 三维上皮组织的制备
<ol>
	<li>在生物安全柜中，向每个印章顶部加入约 50 µl 的 1% BSA PBS 溶液。将带有液滴的印章置于 4 °C 下至少 4 小时，以确保 BSA 吸附到印章表面。</li>
	<li>吸除 PDMS 印章上的 BSA 溶液。</li>
	<li>用细胞培养基洗涤印章表面两次（每次每枚印章使用 50 µl 即可），每次洗涤后吸除液体。</li>
	<li>使用弯头不锈钢镊子操作灭菌的 PDMS 印章及其支撑物。在生物安全柜中，为每枚 PDMS 印章准备一个 35 mm 直径的组织培养皿。在每个培养皿中放置两个 PDMS 支撑物，其间距略小于 PDMS 印章的长度。</li>
	<li>使用镊子，用 70% 乙醇对与 PDMS 印章数量相同的圆形玻璃盖玻片（直径 15 mm，#1 型）进行灭菌。用镊子夹住盖玻片，吸除多余液体。将洗涤后的盖玻片储存在另一个 100 mm 直径的培养皿中。</li>
	<li>向每枚 PDMS 印章表面均匀分配约 50 µl 胶原蛋白混合液，使其完全覆盖表面。</li>
	<li>用镊子夹起每枚涂有胶原蛋白的 PDMS 印章并轻轻翻转。将翻转后的印章放置在 35 mm 组织培养皿中的 PDMS 支撑物上，使胶原蛋白位于印章与培养皿底部之间。将培养皿在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>向每个圆形盖玻片上分配约 50 µl 剩余的胶原蛋白混合液（后续将这些盖玻片置于工程化组织上方，以完全包埋于胶原蛋白中），并在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>取一个 100 mm 直径的组织培养皿，其中含有约 40% 汇合度的上皮细胞（例如 EpH4 小鼠乳腺上皮细胞）。吸除培养基，用 10 ml 1× PBS 洗涤一次。向细胞中加入 2 ml 胰蛋白酶，并在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>向含胰酶消化细胞的组织培养皿中加入 8 ml 新鲜培养基，通过吹打使残留贴壁细胞脱落。轻轻吹打混匀后，将细胞悬液转移至 15 ml 锥形管中，在 100 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除锥形管中的上清液，将细胞沉淀重悬于细胞培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，确定悬液浓度。调整悬液体积，使最终浓度达到约 106–107 个细胞/ml。</li>
	<li>从孵箱中取出已凝胶化的胶原样品。用镊子轻轻垂直提起 PDMS 印章，使其与成型的胶原分离，并丢弃印章。</li>
	<li>向每个含有预定几何形状空腔的胶原凝胶表面分配约 30 µl 浓缩的细胞悬液。在倒置显微镜下使用 10X/0.25 NA 物镜观察细胞，同时轻轻左右摇动培养皿，促进细胞沉降到空腔内。空腔应在约 5 分钟内被填满。</li>
	<li>为去除空腔周围的多余细胞，将每个组织培养皿侧倾，轻轻在其胶原凝胶表面加入约 400 μl 细胞培养基。吸除液体，并重复洗涤 1–2 次，每次洗涤之间在显微镜下检查胶原凝胶。</li>
	<li>当胶原模具中细胞填充空腔周围的多余细胞被清除后，将组织培养皿放入 37 °C 细胞培养孵箱中孵育 15 分钟。然后，用镊子轻轻翻转涂有胶原的玻璃盖玻片，并将其放置在细胞填充的胶原模具上方，使盖玻片上的胶原在细胞填充空腔上形成覆盖层。将样品在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>一旦胶原盖层与细胞填充的胶原模具粘附牢固，缓慢在凝胶上方的玻璃盖玻片上加入约 2–2.5 ml 细胞培养基。将样品在 37 °C 下培养 1–3 天。 
	注意：初次接种 24 小时后，可使用表皮生长因子（EGF）或肝细胞生长因子（HGF）等生长因子处理上皮组织，以诱导分支形成。</li>
</ol>
4. 免疫荧光与图像分析&#160;
<ol>
	<li>从组织培养皿中吸除细胞培养基，加入足量固定液以覆盖含细胞的凝胶。将培养皿置于摇床中，200 rpm，室温孵育15分钟。</li>
	<li>吸除固定液，用1x PBS填充组织培养皿，置于摇床中，200 rpm，室温孵育15分钟。重复此步骤两次，共完成三次洗涤。</li>
	<li>标记细胞核：从组织培养皿中吸除PBS，替换为Hoechst染色液。室温孵育15–20分钟。若需对FAK或其他可通过抗体检测的标志物进行染色，请跳至步骤4.5。</li>
	<li>吸除核染色液，按照步骤4.2的方法，用1x PBS对含细胞的凝胶洗涤三次。染色后的样品可保存在1x PBS中，4 °C避光保存，直至后续使用。</li>
	<li>对目标蛋白进行染色：从组织培养皿中吸除PBS，加入300 μl 0.3% PBST，室温孵育15分钟。</li>
	<li>吸除PBS，用封闭缓冲液覆盖凝胶，置于摇床（200 rpm）上，室温孵育约4小时。</li>
	<li>吸除封闭缓冲液，用一抗溶液覆盖凝胶，置于摇床（200 rpm）上，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>吸除一抗溶液，加入0.3% PBST溶液，置于摇床（200 rpm）上，室温孵育30分钟。吸除PBST后，每30分钟更换一次，持续3–4小时。</li>
	<li>重复步骤4.7和4.8，此次使用二抗溶液孵育。用铝箔包裹组织培养皿以避免二抗发生光漂白。最后一次洗涤后，染色样品可保存在1x PBS中，4 °C避光保存，直至后续使用。</li>
	<li>观察样品时，使用10X/0.30 NA 物镜，聚焦于上皮组织的中平面。</li>
	<li>观察细胞核时，使用10X/0.30 NA 物镜，在紫外光照射下对经核标志物标记的固定样品进行成像。</li>
	<li>观察目标蛋白染色的样品时，使用10X/0.30 NA 物镜，在倒置荧光显微镜下进行成像。</li>
	<li>为构建多个具有相同初始几何形状的组织（通常为50个或更多）中目标蛋白染色的频率图，首先使用标准图像分析软件（见材料部分）导入所有图像，并将其转换为8位灰度图像。</li>
	<li>对这些图像进行阈值处理：通过设定灰度截断值，将其转换为二值图像（即 半色调/黑白图像）；低于阈值的灰度值变为黑色，高于阈值的变为白色。然后将每张独立的二值图像合并为一个单一的图像堆栈。</li>
	<li>接下来，在分析软件中对图像堆栈进行配准（即 对齐或匹配）。许多图像分析软件均提供可免费使用的配准插件。
	<ol>
		<li>将堆栈中的每张图像作为下一张图像对齐的模板，使整个堆栈中的图像通过传播方式完成对齐。最后，基于平均强度叠加（投影）已对齐的图像堆栈，生成一张包含像素频率图的单一图像。随后可使用任意图像编辑软件对该图像进行伪彩编码10,11。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
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<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li>
<li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li>
<li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li>
<li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述方案描述了一种制备具有预定义形状的相同上皮组织的方法，从而实现对组织中细胞所受机械应力的空间控制。该方法利用弹性体模具在I型胶原中创建空腔，随后将上皮细胞接种于空腔内，并覆盖额外的胶原层，使细胞完全包埋于三维胶原基质环境中。通过进一步培养这些组织并施加生长因子以诱导其从初始结构发生分支，该系统适用于研究上皮细胞的分支形态发生过程。本方案中有若干关键步骤：首先，在接种细胞前，需将聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具垂直向上提起，避免任何水平移动，否则会导致空腔变形，无法保持预期的几何形状。其次，在向空腔接种细胞后，必须小心洗去表面残留的多余细胞，因为这些细胞可能干扰图案化组织的行为，特别是当其紧邻组织时。然而，若清洗过于剧烈，则可能导致空腔内的细胞被冲出。最后，在最终的微图案化步骤中，当含有细胞的胶原凝胶被浸入培养基时，应缓慢地将培养基直接加在盖玻片上方。若将培养基加在培养皿远离盖玻片的一侧，可能导致盖玻片及其上方的胶原盖层脱落。为获得最佳结果，上述每一步均需谨慎操作。
近几十年来，出现了多种用于研究上皮形态发生的培养模型，其中许多涉及完整器官或器官外植体的ex vivo</e...

分支上皮组织的发育，即分支形态发生，受到细胞来源、物理及环境因素的调控。在乳腺中，分支形态发生是一个反复迭代的过程，通过导向性的集体细胞迁移形成树状结构。该过程的第一步是来自乳腺导管的初级芽体形成，随后是分支的起始与延伸1,2青春期时，类固醇激素的系统性释放会诱导导管分支向周围间质侵袭。随后，新的初级芽体从已有分支的末端开始形成，此过程持续进行，最终构建出树状上皮结构。3尽管许多重要的生化信号已被鉴定，但目前对于指导这一复杂发育过程的细胞生物学机制仍缺乏全面的理解。此外，从实验中解析特定信号影响的机制性研究也难以开展。 体内因为通常无法实现精确的时空扰动和测量。
三维（3D）培养技术，例如全器官培养、原代类器官和细胞培养模型，是系统研究组织形态发生机制的有用工具4-6。这些技术尤其适用于分别确定特定因素（如机械力和生化信号）对多种细胞行为（包括迁移、增殖和分化）的影响6。特别是工程化的细胞培养模型，能够便捷地对单个细胞及其微环境进行干预。
一种此类培养模型采用基于微加工的技术，构建具有可控三维结构的模拟乳腺上皮组织，该组织在适当生长因子诱导下能够稳定且可重复地形成集体迁移的分支结构。该模型的主要优势在于能够精确操控并量化物理和生化因素（如机械应力分布模式）的影响，并具有高度的统计可信度。该技术结合计算建模，已被用于确定物理信号与生化信号在正常乳腺上皮组织及其他分支上皮发育导向过程中的相对贡献7-11。本文展示了一种构建此类模型组织的详细实验方案，该方法可轻松拓展至其他类型的细胞和细胞外基质（ECM）凝胶，有望成为药物疗效测试的有力工具。

<table><tbody><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>埃尔斯沃思粘合剂</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 固化剂</td><td>埃尔斯沃思粘合剂</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>光刻图案化硅模板</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>塑料称量船</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>直径100毫米的培养皿</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 200 证明</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>通过将乙醇与dH₂O按体积比混合，配制70%的乙醇（v:v）溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>American Safety Razor</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 达尔伯克&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基：Ham&amp;rsquo;DMEM/F12（1:1）营养混合物</td><td>Hyclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank&amp;rsquo;Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10×磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>牛I型胶原蛋白（非胃蛋白酶处理）</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>弯曲不锈钢镊子</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 直径组织培养皿</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Safe-Lock 管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>直径15毫米的圆形1号玻璃盖玻片</td><td>Bellco Glass 公司</td><td>特殊订单</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 1x 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>重悬于 dH₂O 中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，50 mg/ml</td></tr><tr><td>兔抗小鼠FAK抗体</td><td>Life Technologies</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa 488 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>用于对像素频率图进行颜色编码。</td></tr><tr><td>FIJI（ImageJ）</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N/A</td><td>用于阈值处理、图像配准和叠加以生成像素频率图的免费图像分析软件。StackReg 插件用于二值图像的配准。</td></tr></tbody></table>

在细胞外基质中构建三维上皮组织

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

肺、肾和乳腺等分支器官的结构形成源于分支形态发生这一发育过程，该过程受到微环境中多种可溶性因子和物理信号的调控。本文介绍了一种用于研究分支形态发生过程的方法，通过构建形状和大小均明确的工程化三维（3D）上皮组织，并将其完全包埋于细胞外基质（ECM）中，以模拟生理环境。该方法可实现大量相同组织的阵列化生成，并可调控多种环境因素，包括组织几何形状、间距以及ECM成分。此外，该方法还可与牵引力显微镜（TFM）等广泛应用的技术相结合，以更深入地了解细胞与其周围ECM之间的相互作用。该实验方案也可用于研究除分支形态发生外的多种细胞与组织过程，如癌症侵袭。

乳腺上皮组织微加工的一般示意图
概述实验工作流程的微加工工艺通用示意图如图1所示。最终结果是在细胞外基质（ECM）凝胶内完全包埋的、具有相同几何形状和间距的上皮组织阵列。一个典型的实验使用EpH4小鼠乳腺上皮细胞，将其培养在浓度为4 mg/ml的牛I型胶原蛋白凝胶中。为了确保构建的组织具有最高质量，应严格遵循本方案中所述的技术步骤。图2A和2B展示了在接种细胞前，模制于I型胶原凝胶中的矩形微孔阵列的低倍和高倍显微图像。微孔的形状由硅模板上微结构的形状决定。将聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具从胶原凝胶上垂直提起至关重要，以避免微腔几何形状发生变形。图2C显示了已填充乳腺上皮细胞的I型胶原凝胶中的矩形微孔（胶原表面多余的细胞已被冲洗去除）。在此示例中，每个200 μm × 50 μm的矩形微孔大约含有80–100个细胞。
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本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。

肺、肾和乳腺等分支器官的结构通过分支形态发生这一发育过程形成，……

本实验的目的是构建嵌入胶原凝胶中的、相同的三维组织，可用于多种实验场景，例如确定机械应力对分支形态发生的影响。该方法有助于回答组织形态发生领域的关键科学问题，例如揭示集体细胞行为的潜在机制。该技术的主要优势在于所构建组织的几何形状可控且可重复，从而能够对物理和生化因素进行精确操控和定量测量。因此，样本量足够大，可使结论具有高度的统计学可信度。首先，使用标准的光刻技术制备带有目标阵列图案的硅模板。本视频中使用的图案由矩形结构组成，间距为200微米。接下来，在一次性培养皿中按10:1的比例混合预聚物和固化剂，制备50克PDMS。然后将混合物置于真空环境中15至30分钟，以去除混合过程中引入的气泡。将硅胶母模的纹理面朝上放入塑料称量舟中，然后将脱气后的PDMS溶液倾倒至模具表面。然后，将培养皿放入烘箱中，在60摄氏度下固化PDMS 12小时。固化完成后，从塑料容器中取出PDMS及其模具。小心地将PDMS从硅片上剥离。然后，使用干净的刀片将印模特征周围多余的PDMS切除。接着，用刀片将带有图案的PDMS切割成单独的矩形印章。将这些印章正面朝上存放于洁净的直径100毫米的培养皿中。接下来，使用预聚物与固化剂按10:1的相同比例配制新鲜的脱气PDMS溶液。将2至3克该溶液旋涂于直径为100毫米的培养皿上，然后在60摄氏度下固化PDMS 12小时。随后，使用剃刀刀片将PDMS薄层切割成矩形，作为印章的支撑基底使用。每个印章需要两个支撑物。将所有支撑物切割完成后，在生物安全柜中将其与PDMS印章一同浸入70%乙醇中消毒，并使用抽吸装置干燥。在生物安全柜中，向每个印章顶部加入50微升含1% BSA的PBS溶液。将覆盖有液滴的印模置于 4 摄氏度环境中至少四小时，以确保 BSA 吸附至印模表面。随后，将印模移回生物安全柜中，吸除 PDMS 印模上的 BSA 溶液。接着，用 50 微升细胞培养基将印模表面清洗两次。每次洗涤后吸除培养基。为每个PDMS印章准备一个直径35毫米的组织培养皿。在每个培养皿中放置两个PDMS支撑物，两者之间的距离略小于PDMS印章的长度。然后，使用镊子夹取直径为15毫米的玻璃盖玻片，并用70%乙醇进行消毒。用镊子夹住盖玻片，吸去多余的液体，随后将其存放于单独的培养皿中。接下来，将50微升浓度为4毫克/毫升的胶原蛋白混合液直接滴加到每个印章上，以均匀涂覆PDMS印章的表面。使用镊子夹起每个包被胶原的PDMS印章，并轻轻翻转。将翻转后的印章胶原面朝下放置在培养皿中的PDMS支撑物上。然后在37摄氏度下孵育30分钟。接下来，将剩余的胶原蛋白混合液各50微升分装至每个圆形盖玻片上，于37摄氏度孵育30分钟。此时，收获你所关注的细胞类型。此处，我们使用的是EpH4小鼠乳腺上皮细胞，将其悬浮于浓度为每毫升1×10⁶至1×10⁷个细胞的溶液中。现在，从培养箱中取出凝胶

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

工程三维上皮组织细胞外基质中嵌入

本文描述了一种分析组织成纤维细胞对相关上皮细胞影响的简单方法。该方法与三维组织培养相结合，可促进从三维结构中分离后细胞的分析。该技术适用于具有不同恶性潜能的细胞，有助于系统研究肿瘤相关间质对肿瘤细胞的影响。...

从三维混合细胞球体共培养物中分离乳腺上皮细胞

为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。...

组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

由成纤维细胞构建的组织工程天然基质是一种新兴工具，可用于生成支持上皮细胞增殖和分化的间质基底。本文介绍了一种应用该方法评估不同类型间质细胞对肿瘤细胞生物学特性影响的实验方案。...

肿瘤间质微环境的组织工程构建及其在癌细胞侵袭研究中的应用

本文详细介绍了利用三维（3D）实验方法定量分析乳腺癌细胞侵袭的技术。具体而言，我们讨论了建立此类实验所需的步骤、定量方法与数据分析，以及检测细胞侵袭过程中细胞膜完整性丧失的相关方法。...

三维模型定量分析乳腺癌细胞侵袭性

这是一种利用肺部细胞外基质制备三维细胞培养支架的方法。将完整的肺组织加工成水凝胶，该水凝胶可支持细胞在三维环境中生长。...

可调谐的肺部细胞外基质水凝胶用于三维细胞培养

本文介绍了一种三维培养方法，用于分析原代乳腺癌细胞的形态，以及研究它们与单核细胞的直接/间接相互作用及其结果，例如胶原降解、免疫细胞募集、细胞侵袭和促进癌症相关炎症。...

基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

我们描述了一种用于细胞和多细胞类器官三维培养及实验的装置构建方法。该装置可实现对细胞在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号响应的分析。类器官在检测微弱且含噪声的输入信号方面优于单个细胞。...

趋化因子梯度下多细胞反应的三维分析

该方法的目的是获得成纤维细胞来源的三维基质，作为后续细胞实验的天然支架。将成纤维细胞接种于预处理的培养板中，并用抗坏血酸刺激以生成基质。随后对基质进行脱细胞处理并阻断，以用于培养相关细胞（例如内皮细胞）。...

成纤维细胞来源的三维基质系统在内皮细胞成管形成实验中的应用

本方案描述了开放式顶盖器官芯片（Open-Top Organ-Chip）的功能及其建立和成熟原代组织（皮肤、肺泡、气道和肠道）全层器官芯片培养所需的关键培养模式，为研究人类上皮/间充质与血管微环境界面的多种功能特性提供了机会。 体外.

在开放式器官芯片上重建人类上皮组织的细胞结构与功能

在此，我们展示了在基于纳米纤维膜的双层系统中与成纤维细胞共培养的上皮细胞能够稳定地黏附于膜上并生长。...

利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

学习利用软光刻技术构建嵌入胶原蛋白凝胶中的三维上皮组织阵列，实现高通量筛选和精确调控物理生化因素，为研究机械应力对分支形态发生的影响提供可控可重复的平台。

在细胞外基质中构建三维上皮组织

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