工程三维上皮组织细胞外基质中嵌入

该程序的目标是设计一种相同的三维组织，这些组织嵌入胶原凝胶中，用于许多实验环境，例如确定机械应力对分支形态发生的影响。这种方法可以帮助回答组织形态发生中的关键问题，例如确定集体细胞行为的潜在机制。该技术的主要优点是工程组织的几何形状是受控且可重复的，从而能够精确作和测量物理和生化因素。

因此，样本量足够大，可以得出具有高度统计置信度的结论。首先使用标准光刻技术准备用所需阵列进行光图案化的硅母版。本视频中使用的图案由相距 200 微米的矩形结构组成。

接下来，将预聚物和固化剂以 10：1 的比例混合到一次性培养皿中，混合 50 克 PDMS。然后，将混合物在真空下真空 15 到 30 分钟，以去除混合过程中引入的任何气泡。将硅母版纹理面朝上放入塑料称重船中，然后将脱气的 PDMS 溶液倒在模具顶部。

然后，将培养皿放入烤箱中，在 60 摄氏度下固化 PDMS 12 小时。固化后，从塑料容器中取出 PDMS 和母版。小心地将 PDMS 与硅晶片分开。

然后，使用干净的剃须刀片去除压印特征周围多余的 PDMS。现在，使用剃须刀片将图案化的 PDMS 切割成单独的矩形印章。将这些邮票特征面朝上存放在干净的 100 毫米直径培养皿中。

接下来，使用相同的 10：1 预聚物与固化剂比例制备一批新的脱气 PDMS 溶液。将 2 到 3 克这种溶液旋涂到直径为 100 毫米的培养皿上，然后在 60 摄氏度下固化 PDMS 12 小时。然后，用剃须刀片将 PDMS 的薄层切成矩形，用作邮票的支撑。

每个邮票需要两个支撑。切割完所有支撑物后，将 PDMS 印章和支持物浸入 70% 乙醇中，并在生物安全柜中使用抽吸器干燥，对它们进行消毒。在生物安全柜中，在每个邮票的顶部加入 50 微升 1% BSA 的 PBS 溶液。

将液滴覆盖的邮票放在 4 摄氏度下至少 4 小时，以确保 BSA 吸收到邮票表面。然后，将邮票放回生物安全柜中，并从 PDMS 邮票中吸出 BSA 溶液。接下来，用 50 微升细胞培养基清洗邮票表面两次。

每次洗涤后吸出培养基。为每个 PDMS 邮票布置一个直径为 35 毫米的组织培养皿。在每个培养皿中，放置两个 PDMS 支架，间隔距离略小于 PDMS 邮票的长度。

然后，用一把镊子夹起直径为 15 毫米的玻璃盖玻片，并使用 70% 乙醇对其进行消毒。用镊子夹住盖玻片，从盖玻片中吸出多余的液体，然后将它们存放在单独的培养皿中。接下来，将 50 微升每毫升 4 毫克的胶原蛋白混合物直接分配到每个邮票上，以均匀地涂覆 PDMS 邮票的表面。

使用镊子拿起每个胶原蛋白涂层的 PDMS 邮票并轻轻倒置它们。将倒置的邮票胶原蛋白面朝下降低到组织培养皿中 PDMS 支架的顶部。然后，将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

接下来，将 50 微升剩余的胶原蛋白混合物分配到每个圆形盖玻片上，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。此时，收获您感兴趣的细胞类型。在这里，我们有 EpH4 小鼠乳腺上皮细胞，我们以每毫升 1 到 1000 万个细胞的浓度悬浮。

现在，从培养箱中取出凝胶化的胶原蛋白样品。使用镊子轻轻向上提起 PDMS 印章，将其从模制的胶原蛋白中分离并丢弃。将印章笔直向上提起很重要，以免扭曲胶原蛋白凝胶中的特征。

将 30 微升浓缩细胞悬液分配到每个胶原凝胶的表面，该胶原凝胶含有所需几何形状的模制腔。在明场显微镜下观察细胞，同时轻轻左右摇动培养皿，以促进细胞在腔内沉淀。空腔应在 5 分钟内填充。

为了从腔周围去除多余的细胞，将每个组织培养皿侧向倾斜，并在胶原凝胶表面轻轻分配 400 μL 细胞培养基。重要的是，在倾斜培养皿的同时，将培养基缓慢分配到凝胶上，以去除凝胶表面的任何多余细胞，并且不会移位凝胶腔中的细胞。吸出液体并再重复洗涤两次。

在每次洗涤之间在显微镜下检查胶原凝胶，以观察何时冲洗掉多余的细胞。从充满细胞的腔周围清除多余的细胞后，将组织培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中 15 分钟。然后，使用镊子轻轻倒置涂有胶原蛋白的玻璃盖玻片，并将它们放在充满细胞的胶原蛋白模具的顶部，以便盖玻片中的胶原蛋白在充满细胞的空腔上形成一个盖子。

将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。一旦胶原蛋白帽粘附到充满细胞的胶原蛋白模具上，将 2 至 2 1/2 毫升细胞培养基缓慢分配到凝胶顶部的玻璃盖玻片上，并在 37 摄氏度下培养样品 1 至 3 天。这些图像来自细胞接种前模塑成 I 型胶原凝胶的阵列的低倍率和高倍率视图。

孔的形状由硅母版上的特征形状决定。在这里，矩形孔中充满了巨大的上皮细胞。在本例中，每个 200 x 50 微米的矩形孔包含大约 80 到 100 个细胞。

细胞接种后 24 小时，观察到细胞在孔内相互粘附以形成组织。向培养基中加入生长因子 HGF 24 小时后，观察到组织发生分支形态。与细胞迁移有关的蛋白质之一是黏着斑激酶，从这张合成图像中可以看出，它在通常发生分支的孔末端增加。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两小时内完成。在此程序之后，可以执行其他方法，如牵引力显微镜、实时 RT-PCR 和 Western Blotting，以确定细胞在迁移时施加的力以及目标基因的转录本和蛋白质水平的变化。观看此视频后，您应该对如何设置此 3D 细胞培养模型有很好的了解，在该模型中，具有确定初始几何形状的组织嵌入胶原凝胶中。

感谢您的观看，祝您的实验好运。