胶质细胞和神经细胞的三维重建与虚拟现实分析方法
2019年9月28日
所述管道设计用于分割大于千兆字节的电子显微镜数据集，以提取全细胞形态。一旦单元以 3D 重建，根据个人需求设计的定制软件可以直接在 3D 中执行定性和定量分析，也使用虚拟现实克服视图遮挡。
自动化串行截面电子显微镜技术。速率限制步骤在管道中导致生成生物三维模型图像处理。我们的协议提供了一个分步指南，只需几天就生成更密集的图像量结构。
结合使用三维模型进行定量测量的方法。通过这项技术，可以分析除大脑以外的组织3D结构，以识别某些疾病的典型结构损伤，并改进诊断策略。分割是一个乏味的步骤。
花时间使其尽可能准确，以避免校对错误细分和必须重新启动整个过程。软件的设计有时不是很用户友好。因此，查看分段的开始工作非常重要。
打开图像堆栈时，请从包含堆栈的显微镜中拖放本机文件，或者购买将包含整个图像堆栈的文件夹拖到软件窗口中，然后转到图像属性，以确保从元数据中读取体素大小。通过单击图像、键入并选择 8 位，将图像转换为 8 位。如果原始堆栈作为不同的切片获取，则在 TrakEM2 中应用拼接。
如果需要，使用新的 TrakEM2 嵌入式函数细分感兴趣的结构创建新的 TrakEM2 项目。在 TrakEM2 的 gooey 中，右键单击模板窗口下的"任何内容"，然后选择添加新的子区域列表"拖动并放置任何内容"到文件夹中，在项目对象下"和一个任何东西"将出现。拖放，区域列表'从模板到位于项目对象下的任何东西'在图像堆栈视口上，用光标选择 Z 空间。
区域列表'将显示唯一的 ID 号。选择顶部的画笔工具，并使用鼠标将结构填充到整个 Z 堆栈上的细胞索，以分割结构。导出分段质量，用于 Ilastik 作为雕刻的种子。
为此，右键单击 Z 空间列表上的区域列表对象或视图端口中的蒙版，然后选择导出"区域列表"作为标签 T-I-F。根据进一步重建所需的分辨率，通过向下采样来减小图像堆栈的像素大小。考虑将用于分段和重建的软件的内存要求。
Ilastik 在 X-Y 上处理高达 500 像素的堆栈。考虑到对象仍然显示为可识别的最小大小，因此可以进行分段。使用图像"调整大小"增强对比度并帮助分割，可应用非阴影滤镜使膜更清晰。
使用过程'过滤器'不沙化质量'导出图像堆栈作为单个图像'在分段软件中进一步处理，使用文件'保存为'图像序列'，并选择TIFF格式。在主伊拉斯蒂克古伊，选择雕刻模块。加载图像堆栈，使用"添加新'，从序列中添加单个 3D/4D 卷"选择整个目录"，然后选择包含保存为单个文件的图像堆栈的文件夹'在底部的新窗口，其中加载图像的选项存在，请确保保持 Z"选择。
对于以下步骤，所有操作和按钮都可以在主软件 gooey 的左侧找到。在预处理选项卡下，使用已检查的标准选项。使用亮线"富过滤器"，将滤波器刻度保持为 1.600。
此外围环境可以随后修改。预处理完成后，在标签模块的下拉菜单中选择下一页。默认情况下，存在一个对象和一个背景。
通过单击对象种子并选择对象种子，并在感兴趣的结构顶部绘制一条线。然后，选择背景种子，并在要重建的对象外部绘制一行或多条线。现在，点击段'并等待。
根据计算机的功率和堆栈的大小，分段可能需要几秒钟到数小时。完成后，半透明蒙版应显示在分段结构的顶部。滚动堆栈以检查分段。
如果分割不遵循兴趣结构或从它溢出，则可能不准确。通过在溢出的分割上放置背景种子来纠正任何溢出。并在感兴趣的对象的非重建段上添加对象种子。
使用 Ilastik 对分段进行准确的视觉校对可能很乏味，但必须确保导出的对象不包含工件。如果分割仍然不正确，请尝试使用偏置参数进行修改，这将增加或减少接受的不确定分类像素的数量。默认情况下，其值为 0.95。
如果分割过于保守，减小以限制任何溢出或增加。另一种可能性是单击预处理'并修改过滤器的大小。增加该值将最大限度地减少盐和胡椒噪声效应，但也会使膜更加模糊和更小的细节更难检测。
这可能会限制溢出。只要所有所需对象都已分段，就根据需要重申。一旦对象完成，导航到段'并单击保存当前对象'两个新种子将显示开始新对象的分割。
通过单击导出所有网格，立即将曲面度量值抽象为 O-B-J 文件，在 TrakEM2 中以 3D 方式可视化手动分割模型，右键单击区域列表，然后选择在 3D'A 中显示，较高的值将生成较低的分辨率网格。最后，通过从菜单文件"导出表面"WaveFront'中选择将 3D 网格导出为 WaveFront O-B-J"，在安装文本协议中描述的神经变形工具包后，打开搅拌机。使用神经变形批处理导入对象，通过单击场景菜单下的导入对象来一次导入多个对象。
确保激活、使用重新网格和平滑着色。从外行中选择感兴趣的对象，并在修改器菜单下修改重新网格函数的 Octree 深度。迭代工作，以尽量减少顶点的数量，避免丢失分辨率和正确的形态细节。
更改 Octree 深度时，主滑的网格将相应地更改。完成后，单击"应用"以完成该过程。导航到左侧面板上的神经变形菜单，并使用图像叠加工具图像堆栈交互加载图像堆栈。
确保输入 X、Y 和 Z 的图像堆栈的物理大小，然后通过单击源 Z.X 和 Y 是正交平面来选择堆栈的路径。它们是可选的，仅在用户插入有效路径时才加载。然后，右键单击视图端口上的网格。
通过按选项卡进入编辑模式，使用鼠标右键单击选择一个或多个顶点，最后单击顶点上的显示图像。一个或多个带显微图的切割平面将显示在网格顶部。通过右键单击来选择切割平面。
然后按控件 Y 并使用鼠标滚动滚动 3D 模型。这也可用于校对方法。此处显示的是使用 TrakEM2 和 Ilastik 的分割和重建。
TrakEM2 gooey 以红色手动分段的对象显示。然后，导出的掩码可用作半自动分段的输入。从伊拉斯蒂克，面具可以进一步导出到TrakEM2进行手动校对。
蒙版可以导出为 3D 三角形网格，以显示重建的结构。在此示例中，使用此过程重建了四个神经元、星形细胞、微胶质和百分质。显示了使用自定义工具重建的形态的 3D 分析。
这里是一个对焦点离子束扫描电子显微镜数据集的等向图像卷。这些数据的密集重建揭示了轴突，天体过程和树突。此显微图显示了定量目标的示例，如突触和星形糖原颗粒。
该显微图的掩码显示突触周围糖原颗粒的分布。此处显示的是糖原衍生乳酸吸收模型或 GLAM'Here 图形可视化的图形可视化的图形图图，显示用户佩戴虚拟现实或 V-R 耳机，同时从聚焦离子束扫描电子显微镜数据集进行密集重建。从中性子集，可以观察到身临其境的 V-R 场景。
绿色激光指向 GLAM 的峰。最重要的，因为它确定导出的 3D 对象的正确大小，并确定其测量值反映其实际大小。串行截面成像、成像分割和三D构造的概念相当老。
发现技术加速是导致在解剖学教科书的审查中促进切除术的进展。虽然电子显微镜中的大脑研究方法已经开发出来，但它可以推广到任何产生数据的显微镜技术中。包括 C-T 扫描和 M-R-I。
概述
本研究提出了一种旨在对大型电子显微镜数据集进行分割以重建细胞全貌三维模型的管道。定制软件利用虚拟现实来增强可视化并解决遮挡问题，从而实现定性和定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电子显微镜
- 三维重建
背景
- 使用自动化串行切片电子显微镜技术。
- 该管道旨在缩短生物三维模型生成所需时间。
- 分割至关重要，因为不准确可能导致大量返工。
- 使用定制软件可以增强分析能力。
研究目的
- 开发一个密集图像体积重建的简化协议。
- 允许在三维中进行定性和定量评估。
- 分析各种组织的三维结构以检测与疾病相关的损害。
使用的方法
- 该研究采用电子显微镜创建体积数据集。
- 方法集中于使用不同软件工具对大型图像堆栈中的细胞结构进行准确分割。
- 图像处理步骤包括准备图像堆栈、分割和导出对象以进行三维可视化。
- 关键步骤包括确保体素大小准确、应用滤镜和手动校对分割结果。
主要结果
- 自动化管道成功从大型数据集中重建准确的三维模型。
- 分割方法在处理复杂结构时表现出鲁棒性。
- 视觉校对对确保重建对象的可靠性至关重要。
- 该方法在诊断各种组织的结构损害方面具有潜在应用。
结论
- 本研究为准确分割大规模电子显微镜数据提供了基础方法。
- 概述的管道改善了分析复杂生物结构的效率，可能增强诊断策略。
- 影响包括提高我们对健康和疾病背景下组织结构的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of cellular ultrastructure enables mechanistic de-risking in target validation by resolving ambiguities in morphology-function relationships. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative structural readouts that inform hypothesis testing and pathway clarification. Integration of virtual reality analysis enhances reproducibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detailed visualization of glial and neuronal ultrastructure.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by clarifying complex morphologies that may be misinterpreted in 2D.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by identifying structural impairments indicative of disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating dense, accurate 3D models of tissue architecture.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative measurements derived from reconstructed structures.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by enabling reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through analysis of structural impairments in axons, dendrites, and astrocytic processes.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking 3D morphology to functional hypotheses like the glycogen-derived lactate absorption model (GLAM).
- Strategic Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling visualization of synaptic targets and glycogen granule distribution for biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through quantitative 3D structural analysis.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing ultrastructural patterns unresolved in 2D imaging.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative outputs such as synapse and glycogen granule quantification.
- Analytics: Highlights measurements and readouts that help teams compare conditions, including structural impairments typical of certain diseases.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment via visualization of disease-related structural changes in neural and glial cells.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across microscopy techniques including CT and MRI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in glial and neuronal morphology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 3D model generation from electron microscopy datasets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative 3D morphology analysis.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy, image segmentation, and 3D visualization software such as TrakEM2, Ilastik, and Blender.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include high-resolution EM imaging systems and computational resources for processing large image stacks.
- Cross-team standardization requirements for segmentation protocols and proofreading to ensure consistency across users and sites.
- Adaptation considerations across model systems, as the method can be generalized to any microscopy technique generating 3D data.
- Practical limitations include the tedious nature of segmentation and the need for accurate voxel size calibration to avoid measurement artifacts.
