三维流状入侵检测中的全人肿瘤基基质

正如我们已经知道的，肿瘤微环境是癌症生长和入侵的重要组成部分。为了模仿癌进展，我们需要一个与生物学相关的人类肿瘤基质。这是唯一基于体外入侵检测的人类肿瘤基质。

与传统的球类测定相比，该方法温度不敏感，不需要球类转移。该技术适用于患者衍生的固体癌症样本，如头部和颈部癌，可以扩展到个性化医学，包括化疗疗法。这种基于肿瘤的基质已经用于多种应用，包括高通量药物测试、活细胞分析、伤口愈合和转移检测。

技术上最敏感的步骤是添加方法对纤维蛋白原的处理，因此您可能需要首先使用空井练习此步骤。显示矩阵的正确处理很重要，并且通过直观地显示方法很容易进行分析。对于多细胞肿瘤球体生成，将1倍10至第三细胞从感兴趣的细胞系中放入50微升的完整介质，进入96井超低附着圆底板的每个井中。

然后将板放入37摄氏度和5%的二氧化碳细胞培养箱中四天，然后用倒置显微镜直观地确认肿瘤球状物的形成。为了建立一个三维球体入侵测定，在37摄氏度的水浴中，在冰上解冻人类肌瘤衍生基质和解冻纤维蛋白原存量溶液。当试剂加热后，将适当体积的完整介质、人类肌瘤衍生基质、血栓、阿普罗汀和纤维蛋白原混合在一起，在将基质混合物分配到细胞中之前加入纤维蛋白原。

立即将所得凝胶的 50 微升添加到球体培养板的每个井中，将尖端指向每一个井的内壁，并且移液速度变慢，而无需将球体从井的中心移动。由于纤维蛋白原在几分钟后开始凝胶，它需要一个坚固但精确的反向移液和一次只有几口井的治疗。将板返回细胞培养箱 30 分钟，让人类肌瘤衍生基质纤维蛋白凝胶凝固，然后轻轻地将 100 微升的完整介质添加到每个凝胶的顶部。

然后每天对球体入侵进行成像。对于使用 ilastik 进行图像分割，请打开开源图像分类和分段软件，然后选择像素分类工作流。将 ilastik 项目保存到计算机。

像素将基于用户进行注释进行分类。单击"输入数据"并"添加新"以选择用于分析的图像。对于要素选择，请单击"要素选择"和"选择要素"。

单击相应的框以选择感兴趣的要素。所选框将变绿。有关培训，请单击"培训"。

在"培训"部分中，应有两个标签，标签 1 和标签 2。使用其中一个标签标记背景，用另一个标签标记单元格。标记第一个图像中的所有单元格和背景后，从当前视图中选择下一个图像以继续标记单元格和背景，直到标记了 10% 的图像。

然后选择"实时更新"以分析所有图像。培训完成后，ilastik 已分析所有图像，单击预测导出并选择"源简单细分"。然后从"选择导出图像设置"中选择所需的输出文件格式，然后单击"全部导出"以导出标签结果。

这些文件将导出到与原始图像相同的文件夹中。对于区域分析，首先在斐济 ImageJ 中使用比例栏打开原始图像，注意图像的大小和尺寸与分析的图像相同。使用线条选择工具绘制已知长度的线条，然后单击"分析并设置比例"。

然后在"已知距离"字段中设置已知距离。设置正确的单位，然后单击"全局"。要安装 ilastik 插件，请单击"帮助和更新"，然后单击 ImageJ 更新器窗口中的"管理更新网站"。

单击"ilastik"、"关闭"和"应用更改"旁边的操作。几分钟后，将显示一个信息窗口，表示已成功更新。单击"确定"并重新启动 ImageJ。

接下来，单击"插件"、"宏"并安装并选择计数器。ijm 文件。然后单击"打开"。

要完成区域分析，请单击插件并滚动以选择 ilastik。选择"导入 HDF5"并选择 h5 格式的文件。单击"打开"并"加载"并应用查找表。

然后单击键盘上的 A 按钮，该区域将显示在摘要窗口中作为总面积。在这个具有代表性的实验中，在转移性喉膜鳞状细胞系播种四天后，如所证明，将基质添加到形成球体上，每天在倒置显微镜上监测入侵情况。一旦嵌入，人类肌瘤衍生纤维蛋白基质中的细胞在一天后开始快速入侵，并在接下来的两天内扩展到基质中。

小鼠肉瘤衍生矩阵中的细胞没有侵入周围的基质，而是形成不对称结构。胶原蛋白中的细胞轻微侵入，但由于基质收缩，分析变得困难。在一些油井中，球体甚至在三天后就消失了。

在这里，显示了人类肌瘤衍生纤维蛋白基质中原发性喉膜细胞的入侵和转移性喉膜鳞状细胞的定量。人类肌瘤衍生纤维素基体球体入侵的活细胞分析揭示了整个基质链中的细胞运动，随着时间的推移，其他细胞随后被其他细胞跟踪。当将矩阵添加到孔中时，请注意不要将球体从中心位置移动。

该程序可用于研究辐照和特定分子（如抗癌药物）如何影响入侵。细胞可以固定和染色，以便随后的研究。在经典的小鼠肉瘤模型中，细胞主要增殖，入侵方面极小。

这种基于肿瘤的基质能诱发入侵，使抑制研究更加有效。