三维流状入侵检测中的全人肿瘤基基质
2019年5月7日
肿瘤微环境是癌症生长和侵袭的重要组成部分。为了模仿癌症的进展, 需要一个与生物学相关的人类基质。该方案介绍了应用人平滑肌瘤基基质进行体外三维球体入侵检测的改进。该协议还介绍了基于计算机的细胞入侵分析。
正如我们已经知道的，肿瘤微环境是癌症生长和入侵的重要组成部分。为了模仿癌进展，我们需要一个与生物学相关的人类肿瘤基质。这是唯一基于体外入侵检测的人类肿瘤基质。
与传统的球类测定相比，该方法温度不敏感，不需要球类转移。该技术适用于患者衍生的固体癌症样本，如头部和颈部癌，可以扩展到个性化医学，包括化疗疗法。这种基于肿瘤的基质已经用于多种应用，包括高通量药物测试、活细胞分析、伤口愈合和转移检测。
技术上最敏感的步骤是添加方法对纤维蛋白原的处理，因此您可能需要首先使用空井练习此步骤。显示矩阵的正确处理很重要，并且通过直观地显示方法很容易进行分析。对于多细胞肿瘤球体生成，将1倍10至第三细胞从感兴趣的细胞系中放入50微升的完整介质，进入96井超低附着圆底板的每个井中。
然后将板放入37摄氏度和5%的二氧化碳细胞培养箱中四天，然后用倒置显微镜直观地确认肿瘤球状物的形成。为了建立一个三维球体入侵测定，在37摄氏度的水浴中，在冰上解冻人类肌瘤衍生基质和解冻纤维蛋白原存量溶液。当试剂加热后，将适当体积的完整介质、人类肌瘤衍生基质、血栓、阿普罗汀和纤维蛋白原混合在一起，在将基质混合物分配到细胞中之前加入纤维蛋白原。
立即将所得凝胶的 50 微升添加到球体培养板的每个井中，将尖端指向每一个井的内壁，并且移液速度变慢，而无需将球体从井的中心移动。由于纤维蛋白原在几分钟后开始凝胶，它需要一个坚固但精确的反向移液和一次只有几口井的治疗。将板返回细胞培养箱 30 分钟，让人类肌瘤衍生基质纤维蛋白凝胶凝固，然后轻轻地将 100 微升的完整介质添加到每个凝胶的顶部。
然后每天对球体入侵进行成像。对于使用 ilastik 进行图像分割，请打开开源图像分类和分段软件，然后选择像素分类工作流。将 ilastik 项目保存到计算机。
像素将基于用户进行注释进行分类。单击"输入数据"并"添加新"以选择用于分析的图像。对于要素选择，请单击"要素选择"和"选择要素"。
单击相应的框以选择感兴趣的要素。所选框将变绿。有关培训，请单击"培训"。
在"培训"部分中，应有两个标签，标签 1 和标签 2。使用其中一个标签标记背景，用另一个标签标记单元格。标记第一个图像中的所有单元格和背景后，从当前视图中选择下一个图像以继续标记单元格和背景，直到标记了 10% 的图像。
然后选择"实时更新"以分析所有图像。培训完成后，ilastik 已分析所有图像，单击预测导出并选择"源简单细分"。然后从"选择导出图像设置"中选择所需的输出文件格式，然后单击"全部导出"以导出标签结果。
这些文件将导出到与原始图像相同的文件夹中。对于区域分析，首先在斐济 ImageJ 中使用比例栏打开原始图像，注意图像的大小和尺寸与分析的图像相同。使用线条选择工具绘制已知长度的线条，然后单击"分析并设置比例"。
然后在"已知距离"字段中设置已知距离。设置正确的单位，然后单击"全局"。要安装 ilastik 插件，请单击"帮助和更新"，然后单击 ImageJ 更新器窗口中的"管理更新网站"。
单击"ilastik"、"关闭"和"应用更改"旁边的操作。几分钟后，将显示一个信息窗口，表示已成功更新。单击"确定"并重新启动 ImageJ。
接下来，单击"插件"、"宏"并安装并选择计数器。ijm 文件。然后单击"打开"。
要完成区域分析，请单击插件并滚动以选择 ilastik。选择"导入 HDF5"并选择 h5 格式的文件。单击"打开"并"加载"并应用查找表。
然后单击键盘上的 A 按钮，该区域将显示在摘要窗口中作为总面积。在这个具有代表性的实验中，在转移性喉膜鳞状细胞系播种四天后，如所证明，将基质添加到形成球体上，每天在倒置显微镜上监测入侵情况。一旦嵌入，人类肌瘤衍生纤维蛋白基质中的细胞在一天后开始快速入侵，并在接下来的两天内扩展到基质中。
小鼠肉瘤衍生矩阵中的细胞没有侵入周围的基质，而是形成不对称结构。胶原蛋白中的细胞轻微侵入，但由于基质收缩，分析变得困难。在一些油井中，球体甚至在三天后就消失了。
在这里，显示了人类肌瘤衍生纤维蛋白基质中原发性喉膜细胞的入侵和转移性喉膜鳞状细胞的定量。人类肌瘤衍生纤维素基体球体入侵的活细胞分析揭示了整个基质链中的细胞运动，随着时间的推移，其他细胞随后被其他细胞跟踪。当将矩阵添加到孔中时，请注意不要将球体从中心位置移动。
该程序可用于研究辐照和特定分子（如抗癌药物）如何影响入侵。细胞可以固定和染色，以便随后的研究。在经典的小鼠肉瘤模型中，细胞主要增殖，入侵方面极小。
这种基于肿瘤的基质能诱发入侵，使抑制研究更加有效。
概述
本研究介绍了一种利用人子宫肌瘤来源基质的新型体外三维球体侵袭检测方法，可更好地模拟癌变进展过程。该方法能够更有效地分析肿瘤细胞的侵袭行为，并适用于患者来源的实体癌样本。
研究关键要素
科学领域
- 癌症生物学
- 肿瘤微环境
- 体外实验
背景
- 肿瘤微环境在癌症的生长和侵袭中起着关键作用。
- 一种具有生物学相关性的人源肿瘤基质对于准确模拟癌变进展至关重要。
- 与传统的类球体检测方法相比，该方法对温度变化的敏感性较低。
- 它适用于个体化医疗应用，包括化学放疗。
研究目的
- 开发一种基于人类肿瘤基质的检测方法，用于研究癌细胞的侵袭行为。
- 提供一种可最大限度减少传统方法相关技术难题的实验方案。
- 实现高通量药物筛选和活细胞分析。
使用的方法
- 在超低吸附培养板中生成多细胞肿瘤球体。
- 制备人子宫肌瘤来源的基质和纤维蛋白原用于侵袭实验。
- 使用倒置显微镜每日对肿瘤球体侵袭进行成像。
- 利用 ilastik 进行图像分析，实现分割及面积定量。
主要结果
- 在人源子宫肌瘤基质中，细胞迅速侵袭，有效模拟了肿瘤行为。
- 与其他基质的比较显示了不同的侵袭模式，凸显了人源基质的优势。
- 活细胞分析揭示了细胞运动和侵袭的动态过程随时间变化。
- 该方法可被调整用于研究各种治疗对肿瘤侵袭的影响。
结论
- 来源于人类肌瘤的基质为研究癌细胞侵袭提供了可靠的平台。
- 该检测方法可促进癌症治疗干预措施的研究。
- 正确的操作和方法对于成功实施该检测至关重要。
常见问题
行业重要性概述
该检测方法通过提供一种源自人类肿瘤的基质，弥补了临床前癌症研究中的关键空白，相较于动物来源的替代基质，更能真实模拟体内的微环境。该方法能够更准确地建模癌的侵袭过程，支持早期发现阶段的靶点验证和机制性风险排除。该平台适用于筛选应用及转化研究的连续性研究，尤其适用于头颈部癌及患者来源样本的研究。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在与人类相关的细胞外基质环境中实现对靶点的功能验证，检验治疗假设。
- 操作价值：通过在具有生物学相关性的系统中直接观察侵袭表型，减少机制上的模糊性。
- 预测价值：通过鉴定能够在可预测人类肿瘤行为的模型中调节侵袭的化合物，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供一种标准化、可重复的三维体系，用于定量评估化合物对细胞侵袭的影响。
- 操作价值：由于对温度变化的敏感性较低，且无需类球体转移，可实现高通量药物筛选，并显著减少技术性变异。
- 可扩展性：适用于96孔超低吸附板，支持检测方法的微型化及多条件筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：利用人源子宫肌瘤衍生基质，在与疾病相关的系统中将发现结果与临床前验证相衔接。
- 生物标志物一致性：支持对侵袭动态进行活细胞分析，从而实现与分子特征或治疗反应的相关性研究。
- 风险调整型推进：通过量化侵袭抑制效应——转移预防中的关键表型终点——支持决策推进或终止研究。
流程与工作流整合
该检测方法适用于从靶点验证到先导化合物发现，再到临床前疗效测试的整个发现流程，尤其适用于以转移为重点的研究项目。
- Discovery Biology：在人类肿瘤微环境背景下，支持对侵袭驱动因素和通路调节因子的假设验证。
- Screening：提供基于成像的定量检测结果，适用于自动化分析和化合物特征分析。
- Analytics：通过 ilastik 和 ImageJ 生成侵袭面积测量数据，实现不同实验条件间的统计学比较。
- Translational Research：利用人源性基质模拟转移过程中的关键步骤，与临床前研究相衔接。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的实验平台，适用于多种实体瘤类型及包括放化疗在内的多种治疗模式。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少对难以模拟人类肿瘤间质的非人源基质的依赖，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的基质制备方案和成像工作流程，提升实验的可重复性和标准化水平。
- 战略价值：通过提高对临床可转化性的早期预测能力，降低因转移模型不佳导致的后期研发失败，从而提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于在贴近人类生理环境的系统中对侵袭抑制效力的评估，实现对候选药物的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备三维细胞培养、基质操作以及纤维蛋白凝胶制备的无菌操作技术方面的专业知识。
- 依赖于倒置显微镜、ilastik 及 Fiji ImageJ 的使用，用于成像与分析。
- 需要跨团队对类球体形成和基质分配进行标准化，以避免位置性伪影。
- 应用于其他模型系统时，需验证基质相容性及侵袭动力学。
- 实际限制：纤维蛋白原会引发快速凝胶化，要求精确且及时的移液操作，以维持类球体的完整性。
