化学遗传学改造的皮层中间神经元前体细胞移植至新生小鼠脑内

通过该方法，我们可以研究内在活动对皮层中间神经元前体细胞成熟过程的影响。该技术为靶向和调控皮层中间神经元前体细胞的细胞特性提供了一种高效手段，且易于被大多数科研人员所采用。本方案涉及对样品和仪器的精细操作，通过视频演示可更充分地展现其操作要点。

使用防水笔，在六个 35 毫米培养皿底部底面的中央画一条直线。向其中两个 35 毫米培养皿中各加入 10 毫升 PBS 配制的 4% 低凝胶点琼脂糖溶液，将 3 至 4 个解剖得到的脑组织样本嗅球朝下埋入琼脂糖中，沿直线排列，每个样本之间间隔 3 至 5 毫米。待所有脑组织均埋入后，将培养皿置于 4°C 条件下，使琼脂糖凝固，随后将三个脑组织连同周围约 3 毫米厚的凝胶边缘切割成一块完整的琼脂糖组织块。

将组织块粘附在切片机底座表面，使用手术刀在每份组织样本之间的块底部完全切割，以获得三个独立的组织块。接着，使用振动刀切片机在冰冻的克雷布斯溶液中将组织块切成250微米厚的切片，并用弯曲的扁平微量铲仅收集含有内侧或尾侧神经节隆起的切片。然后，将每张切片放置于各自独立的聚苯乙烯中心井器官培养皿中，使其漂浮在最低必需培养基上，切片置于直径13微米、孔径8微米的滤膜上。

当所有切片均制备完成后，将培养皿放入二氧化碳细胞培养箱中，在 37 摄氏度下孵育一小时。在进行局灶性 DNA 注射前，用一支长 225 毫米、容量为 2 毫升的玻璃移液器戳取直径 1 毫米、长 10 毫米的琼脂糖柱，并将其置于冰冻的克雷布斯（Krebs）溶液中。使用手术刀片切割一小块琼脂糖以适配电穿孔电极表面，另切割一大块作为局灶性 DNA 注射的基底。

然后，将琼脂糖块放入冰冻的克雷布斯溶液中。进行注射时，将表达载体和对照载体的DNA混合，每种载体的浓度为每微升1微克，并加入终浓度为十分之一的快绿储备液。用拉制的玻璃微量移液管（内径0.5毫米，外径1毫米）吸取10微升DNA混合液，并将该移液管装入气动PicoPump注射仪中。

将较大的琼脂糖块置于体视显微镜下，并将待注射的脑片放置在琼脂糖块上。随后，向脑片中选定的内侧神经节隆起或尾侧神经节隆起区域注射25至50纳升体积的溶液。注射后立即把小块琼脂糖放置在培养皿电极上，并使用平头显微铲将琼脂糖柱体连接至可移动的覆盖电极。

将带有支撑膜的注射后脑片转移至琼脂糖块上，并将带有琼脂糖柱的顶部电极置于脑片的选定区域上方。随后，以125伏特、持续5毫秒的电脉冲进行两次电穿孔，两次脉冲间隔500毫秒。电穿孔完成后，将带有支撑膜的脑片放回其培养皿中，并将培养皿放回组织培养孵箱。

一小时后，将最低必需培养基更换为适用于原代神经元培养的基础培养基，并将脑片放回培养箱中过夜。在这些电穿孔实验中，约50%的GFP阳性神经元共同表达了RFP阳性的注射蛋白，因此，GFP阳性而RFP阴性的细胞群体可作为注射DNA配体效应的内部对照。氯氮平及其氧化物的给药选择性地增强了转染的RFP阳性细胞的活性，这一点通过这些新生冠状组织切片中活动依赖性蛋白c-Fos的表达得以证实。

与给予载体的同窝小鼠相比，氯氮平和氧化物处理也会导致GFP阳性RFP阳性细胞占GFP阳性RFP阴性细胞的比例增加。该方法可用于研究活动调节的移植中间神经元对宿主循环可塑性及脑功能的影响。