将化学遗传工程皮质内神经内生前生移植到早期产后小鼠大脑
2019年8月26日
在这里，我们提出一个协议，旨在使用化学遗传学工具操纵移植到早期产后小鼠皮层的皮质内祖细胞的活动。
通过这种方法，我们可以研究内在活性对皮质内特龙前体的成熟的影响。该技术为大多数科学界都能接触到的皮质内特龙祖细胞的定位和操作提供了一种有效的方法。该协议涉及样品和设备的细致处理，最好通过视觉演示来欣赏。
使用防水笔，在六个 35 毫米培养皿底部底部的中间画一条直线。在PBS中加入10毫升液体4%低凝胶加糖，放入两个35毫米培养皿中，并在红糖中嵌入3至4个解剖的大脑，嗅球朝下，每个培养皿穿过直线，在每个样品之间留下3至5毫米的空间。当所有的大脑都嵌入后，将盘子放在四摄氏度，让红糖凝固，将三个大脑雕刻成一块红糖，在样品的边缘留下大约三毫米的凝胶。
将块粘在显微原子基座表面，并使用手术刀片切割每个组织样本之间的块的底部，以获得三个独立的块。接下来，使用振动刀片微切器将冰冷 Krebs 溶液中的块切成 250 微米厚的切片，使用弯曲的扁平微片只收集含有中层或骨质的微片。然后，将每个部分放在单个直径为 13 微米、8 微米孔径的过滤膜上，这些滤膜漂浮在单个聚苯乙烯中心井器官培养皿中最小的必需介质上。
获得所有部分后，将菜肴放在37摄氏度的二氧化碳组织培养箱中一小时。在焦点DNA注射之前，将直径1毫米、长10毫米的阿加罗斯柱与一个225毫米长、两毫米容量的玻璃移液器打孔，放入冰冷的克雷布斯溶液中。使用手术刀片，切割一小块阿加罗斯，以适合电穿孔电极的表面和一个更大的一块用作焦点DNA注射的基础。
然后，将阿加罗斯块放入冰冷的克雷布斯溶液中。对于注射，混合表达和控制载体DNA，每个微升浓度为1微克，并在1至10次稀释时添加快速的绿色库存溶液。用 10 微升 DNA 混合物填充拉式 0.5 毫米内径、1 毫升外径玻璃微管，将微吹管装入气动 PicoPump 喷油器中。
将较大的阿加糖块放在立体显微镜下，将要注射的切片放在阿加糖片上。然后，将 25 至 50 纳米光体积注入切片的选定中层帮派或考达尔刚石微亮区域。注射后，立即将小黄玫瑰块放在培养皿电极上，并使用平端微板将阿加罗斯柱连接到移动盖电极上。
将注入的片及其支撑膜转移到加糖块上，并在切片选定区域的顶部放置带 agarose 柱的顶部电极。然后，用两个 5 毫秒脉冲（125 伏特，500 毫秒）对该区域进行电分。电穿孔后，将带支撑膜的切片放回其固定盘中，将菜回组织培养箱。
一小时后，用适合原发神经元培养的基本介质替换最小基本介质，并在夜间将切片返回到孵化器。在这些电穿孔实验中，大约50%的GFP阳性神经元共同表达RFP阳性注射蛋白，因此，GFP阳性RFP负量作为注射DNA配体效果的内部控制。氯扎平和氧化物的去皮有选择性地增加转染的RFP阳性细胞的活性，这些新生日冕组织部分中活性依赖蛋白c-Fos的表达就证明了这一点。
氯扎平和氧化物治疗还导致GFP阳性RFP阳性细胞的比例相对于GFP阳性的RFP阴性细胞的数量相比，车辆施用的垃圾。本程序可用于研究活动调节嫁接内子对宿主循环可塑性和大脑功能的影响。
概述
本研究提出了一种使用化学遗传学工具操控早期出生后小鼠皮层间质神经元前体细胞活性的协议。该方法允许研究人员探索内在活性对这些间质神经元前体细胞成熟的影响，从而对皮层功能的深入理解做出贡献。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 皮层发育
- 化学遗传学
背景
- 皮层间质神经元在大脑功能中扮演关键角色。
- 了解它们的成熟可以为神经学研究提供信息。
- 化学遗传学提供了对神经元活性的精确控制。
- 出生后的小鼠作为研究皮层发育的相关模型。
研究目的
- 操控移植的皮层间质神经元前体细胞的活性。
- 检查内在活性对间质神经元成熟的影响。
- 为研究人员提供一个广泛可用的协议。
使用的方法
- 从早期出生后的小鼠中制备离体脑切片以进行操控。
- 生物模型涉及移植的皮层间质神经元前体细胞。
- 关键步骤包括将组织嵌入琼脂糖，并进行靶向DNA注射和随后的电穿孔。
- 操控后，切片被培养并分析神经元活性反应。
主要结果
- 大约50%的神经元显示GFP和RFP的共同表达，表明操控成功。
- 氯硝西泮和氧化物处理增强了RFP阳性细胞的活性，并增加了c-Fos表达。
- 这种方法提供了移植的间质神经元如何影响宿主大脑功能的见解。
结论
- 本研究展示了一种操控间质神经元前体细胞的有效协议，使得进一步调查它们在皮层可塑性中的作用成为可能。
- 了解活性调节间质神经元的机制可以推进神经科学的知识。
常见问题
Executive Industry Relevance
Genetic and chemogenetic manipulation of cortical interneuron progenitors enables precise interrogation of neuronal maturation mechanisms, supporting early-stage target validation in neurodevelopmental research. This approach provides predictive confidence for understanding how intrinsic activity and environmental factors influence integration and function of inhibitory circuits. The protocol's ability to dissect gene-environment interactions in a controlled, transplantable system positions it as a valuable tool for de-risking neurobiological targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of interneuron maturation and integration in disease-relevant neural circuits.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic and environmental contributions to neuronal development.
- Facilitates predictive assessment of target modulation effects on inhibitory network assembly.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative measurement of neuronal activity and gene expression in engineered progenitors.
- Enables reproducible manipulation and tracking of transplanted cell populations using fluorescent reporters.
- Supports assay standardization for evaluating chemogenetic tool efficacy and specificity in neural tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ analysis of activity-dependent protein expression (e.g., c-Fos).
- Offers continuity from discovery to preclinical validation by modeling integration of engineered cells in host brain circuits.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative readouts of graft function and host response.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling genetic manipulation, transplantation, and functional analysis of interneuron progenitors in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-environment interactions in interneuron maturation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for evaluating chemogenetic modulation in neural tissue.
- Analytics: Provides molecular and cellular readouts (e.g., co-expression of fluorescent proteins, c-Fos induction) for comparative analysis.
- Translational Research: Models integration and function of engineered cells in vivo, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse genetic constructs and activity modulators in neural progenitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neuronal development.
- Operational Value: Standardizes manipulation and analysis of neural progenitors for scalable, reproducible studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative data on engineered cell integration and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo electroporation, transplantation, and chemogenetic manipulation of neural tissue.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue sectioning, microinjection, and fluorescence imaging.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different interneuron subtypes or host models.
- Potential limitations include variability in graft integration and chemogenetic tool specificity.
