小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

本实验的总体目标是利用改良的拟胚体转单层培养法，从小鼠胚胎干细胞中生成皮层中间神经元前体细胞，进而获得有丝分裂后的中间神经元前体细胞。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如皮层中间神经元的不同亚型在发育过程中如何决定其特定命运。该技术的主要优势在于能够高效生成表达 Nkx2.1 的中间神经元前体细胞，并可进一步通过特定方法富集表达小清蛋白（parvalbumin）或生长抑素（somatostatin）的中间神经元亚群。

开始此操作时，将有丝分裂失活的MEF饲养细胞接种于MEF培养基中，并铺在经组织培养处理的培养板上。接种mESC前，需在37摄氏度的细胞培养箱中孵育至少12小时，使细胞充分贴壁。若不能立即使用，应每隔三天更换一次MEF培养基。

接下来，将含有小鼠白血病抑制因子的mESCs加入MEF培养板中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。当培养皿细胞融合度达到70%至80%时，使用胰蛋白酶-EDTA传代mESCs，并将mESCs维持在MEF饲养层上的mESC培养基中，以保持其多能性。

开始诱导分化前，需将细胞在无饲养层（MEFs）的明胶包被培养板上至少传代一次，以稀释去除饲养层细胞。具体操作为：通过向经组织培养处理的培养皿中加入含钙镁离子的0.1%明胶PBS溶液，37°C孵育至少1小时，制备明胶包被培养板。每块10厘米培养板接种1.5至2×10⁶个细胞，于开始分化前培养2天使其充分扩增。

在DD0天，当mESCs在明胶包被的培养板上生长两天后，吸除培养基，并用不含钙和镁的PBS洗涤细胞一次。然后加入足量的胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖培养板表面，将细胞放回37摄氏度的培养箱中孵育四分钟。

孵育四分钟后，加入两倍体积的mESC培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。将细胞转移至适当大小的离心管中，在200 × g下离心五分钟。随后取出离心管，小心吸除上清液，避免扰动沉淀的细胞团。

将沉淀重悬于1毫升KSR-N2培养基中。随后使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。在非黏附性组织培养皿中，将每毫升KSR-N2培养基接种75,000个细胞，开始以拟胚体形式培养细胞。

在37摄氏度下孵育。在DD1天，通过在组织培养处理过的培养皿中加入多聚-L-赖氨酸，于37摄氏度孵育至少1小时或过夜，以准备细胞接种。在DD2天，吸除多聚-L-赖氨酸，并在37摄氏度下用层粘连蛋白包被培养板过夜。

在第3天（DD3），开始EB解离前，吸除层粘连蛋白，并将培养板置于组织培养罩内使其完全干燥。随后，将EB连同培养基转移至15毫升离心管中，在15 × g条件下离心3至4分钟，或直至EB形成沉淀。吸除培养基，加入3毫升含有DNase的细胞解离溶液。

然后，将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。每 3 分钟轻轻弹击离心管一次，以促进拟胚体解离。当拟胚体不再可见或孵育时间达到 15 分钟后，加入 6 毫升含有 DNase 的 KSR-N2 培养基，并在 200 × g 条件下离心 5 分钟。

随后，将细胞以每平方厘米4.5至5×10⁴个细胞的密度接种于含有LDN193189、XAV939和ROCK抑制剂Y27632的KSR-N2培养基中。在DD5时，更换为含有FGF2、IGF1和SSH的KSR-N2培养基。接着，按照DD1和DD2操作步骤中所述说明，准备组织培养板，用于第8天的传代培养。

在第7天（DD7），更换含有FGF2、IGF1和SHH的KSR-N2培养基。在第8天（DD8），用胰蛋白酶-EDTA在37摄氏度下消化5分钟，使细胞从培养板上脱离，随后用两倍体积的KSR-N2培养基终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。

以200 × g离心5分钟。通过40 µm滤管过滤细胞，以去除任何团块。然后，在含有FGF2、IGF1和Y27632以及SHH的N2-KSR培养基中，以每平方厘米250,000个细胞的密度重新接种细胞。

在第10天，使用含有SHH的KSR-N2培养基更换培养液。用不含钙和镁的PBS洗涤细胞一次，向细胞中加入预热的、不含胰酶的细胞解离试剂（含DNase）。将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育10至30分钟，或直至细胞脱落。

然后，每五分钟轻轻敲击培养板，以促进解离。在第5天（DD5），更换为含有FGF2和IGF1的KSR-N2培养基。接着，在第8天（DD8）之前准备好组织培养板用于传代培养。

在第7天，更换含有FGF2和IGF1的KSR-N2培养基。在第8天，用平滑受体激动剂重铺细胞，并加入非典型PKC抑制剂。在第10天，更换含有aPKCi的KSR-N2培养基。

在第11天（DD11），将细胞从培养板上解离用于FACS分析。如果在第11天（DD11）未进行细胞解离用于FACS，则在第12天（DD12）更换含aPKCi的KSR-N2培养基。在第14天（DD14），更换为含aPKCi的KSR-N2培养基。

在第16天（DD16），更换含有aPKCi的KSR-N2培养基。然后在第17天（DD17），收集Nkx-2.1:mCherry阳性细胞。此处展示的是分化第12天（DD12）培养物中Nkx2.1、Nkx2.1:mCherry和Lhx6:GFP免疫染色的代表性图像。

请注意，这些图像是同一视野下重叠的通道。该图表展示了在培养至 DD12 时，表达 Nkx2.1 的 DAPI 阳性细胞核的平均百分比的定量结果。这是一张具有代表性的流式细胞术分析图，展示了利用我们的双报告基因 mESC 细胞系可分离出的四种不同细胞群体。

注意，mCherry 位于 x 轴，GFP 位于 y 轴。因此，右上象限表示 mCherry 和 GFP 双阳性细胞。此处显示了从 DD6 到 DD16 期间 Nkx2.1:mCherry 和 Lhx6:GFP 的诱导时间过程，以培养物中仅表达 mCherry、仅表达 GFP 或共表达 mCherry-GFP 的细胞百分比表示。

一旦掌握，该实验方案若操作得当，可在17天内完成全部流程。在实施该操作过程中，务必始终记住：应从多能性、未分化且形态健康的干细胞开始。在完成本方案后，还可进一步采用其他方法，例如将细胞移植至新生或成年小鼠的新皮层，以探究关于中间神经元命运决定，或中间神经元移植对神经环路功能及动物行为影响的更多科学问题。

该技术建立后，为发育神经科学领域的研究人员探索驱动小鼠中间神经元命运决定的因素铺平了道路，并进一步有助于研究受中间神经元相关疾病影响的患者。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从小鼠胚胎干细胞中获得表达 Nkx2.1 的前体细胞及其有丝分裂后的子代细胞。感谢观看，祝您的实验顺利成功。