Name: 小鼠胚胎干细胞向皮质 Interneuron 前体细胞的分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习利用改良的胚状体-单层培养法将小鼠胚胎干细胞分化为皮层中间神经元前体细胞。该方法可高效生成表达Nkx2.1的祖细胞，用于研究神经元命运决定及神经系统疾病治疗应用。

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我们感谢许青开发了Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP双报告mESC细胞系，同时感谢Jennifer Tyson、Asif Maroof和Tim Petros在本实验方案早期开发过程中提供的帮助。我们还感谢CHOP流式细胞术核心设施提供的技术协助。本研究得到了NIH R01 MH066912（SA）和F30 MH105045-02（DT）项目的资助。

注意：本实验方案中描述的双报告基因小鼠胚胎干细胞系可应要求提供（sande@mail.med.upenn.edu）。
1. 培养基制备
注意：在细胞培养中使用前，将所有培养基预热至 37 °C。
<ol>
	<li>小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基（配制500 mL）
	<ol>
		<li>将50 mL胎牛血清（FBS）加入449 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。</li>
		<li>过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）。培养基可于4 °C保存至多1个月，或分装后于≤ -20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N2培养基（配制500 mL）
	<ol>
		<li>将5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（100倍浓度）和500 µL 2-巯基乙醇（55 mM）加入489.5 mL DMEM/F-12培养基（DMEM:营养混合物F-12），使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。</li>
		<li>过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）和5 mL N2补充剂-B。培养基避光于4 °C保存，至多可保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无血清生长培养基（KSR）（配制500 mL）
	<ol>
		<li>将75 mL无血清培养基补充剂、5 mL L-谷氨酰胺（100倍浓度）、5 mL MEM非必需氨基酸（MEM-NEAA）（100倍浓度）和500 µL 2-巯基乙醇（55 mM）加入413.5 mL不含谷氨酰胺的DMEM中，使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。</li>
		<li>过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）。培养基于4 °C保存，至多可保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠胚胎干细胞培养基（配制500 mL）
	<ol>
		<li>将75 mL干细胞级胎牛血清（FBS）、5 mL MEM-NEAA（100倍浓度）、5 mL L-谷氨酰胺（100倍浓度）和500 µL 2-巯基乙醇（55 mM）加入413.5 mL不含谷氨酰胺的DMEM中，使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。</li>
		<li>过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）。培养基避光于4 °C保存至多1个月，或分装后于≤ -20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养小鼠胚胎干细胞（mESCs）
<ol>
	<li>将有丝分裂失活的MEF饲养细胞以3-4 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于组织培养处理过的培养皿中，使用MEF培养基。在接种mESCs前，于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2 的细胞培养箱中孵育至少12小时，使其充分贴壁。若未立即使用，每3天更换一次MEF培养基。若接种后7天内未使用，应丢弃MEF细胞。</li>
	<li>将mESCs（接种密度为1-4 × 104 个细胞/cm2）加入含小鼠白血病抑制因子（mLIF）（1,000 U/mL）的mESC培养基中，接种至MEF培养皿。于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2 条件下孵育细胞。</li>
	<li>当培养皿中细胞融合度达到约70-80%，或克隆开始相互接触时，使用胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶）按1:5至1:10比例传代mESCs。通常每2天传代一次，但具体时间可能因初始接种密度不同而延长至4至5天。</li>
	<li>将mESCs维持在MEF饲养层及mESC培养基中，以保持其多能性。</li>
	<li>开始分化前，至少将细胞传代一次至明胶包被的培养板上（无MEF），以稀释去除残留的MEF细胞。
	<ol>
		<li>通过在组织培养处理的培养皿中加入含Ca2+/Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）配制的0.1%明胶溶液，并于37 °C孵育至少1小时，制备明胶包被的培养板。每10 cm培养皿接种1.5-2 × 106 个细胞（2.7-3.6 × 104 个细胞/cm2），并在开始分化前让细胞扩增2天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将小鼠胚胎干细胞分化为类似MGE的端脑前体细胞
<ol>
	<li>分化第0天（DD 0）= &#34;悬浮细胞&#34;
	<ol>
		<li>小鼠胚胎干细胞（mESCs）在明胶包被的培养板上生长2天后，吸除培养基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤细胞一次。加入足量胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶）覆盖培养皿表面（通常一个10 cm组织培养皿加入4 mL胰蛋白酶-EDTA），将细胞放回37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2的培养箱中孵育4分钟。</li>
		<li>4分钟后，用两倍体积的mESC培养基中和胰蛋白酶-EDTA。将细胞转移至适当大小的离心管中，在200 x g条件下离心5分钟。离心结束后取出离心管，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用1 mL含BMP抑制剂LDN-193189（250 nM）和Wnt抑制剂XAV-939（10 µM）的KSR:N2培养基（1:1）重悬细胞沉淀。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。将细胞以75,000个细胞/mL的密度接种于含LDN-193189（250 nM）和XAV-939（10 µM）的KSR:N2培养基（1:1）中，置于非黏附性组织培养皿中，开始以拟胚体（EBs）形式培养。将细胞置于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2条件下培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在DD1，为细胞&#34;贴壁&#34;做准备：用多聚-L-赖氨酸（10 µg/mL溶于含Ca2+/Mg2+的PBS中）包被组织培养处理过的培养皿，37 °C、相对湿度≥95%条件下过夜（O/N）或至少1小时。</li>
	<li>在DD2，吸除多聚-L-赖氨酸溶液，用层粘连蛋白（10 µg/mL溶于含Ca2+/Mg2+的PBS中）包被培养板，37 °C、相对湿度≥95%条件下过夜（O/N）。 
	注意：虽然过夜包被效果最佳，但至少2小时也可能足够。若培养板次日不用，应吸除层粘连蛋白，替换为不含Ca2+/Mg2+的PBS，并于4 °C保存，最长可保存2周。</li>
	<li>DD3（&#34;贴壁细胞&#34;）
	<ol>
		<li>开始拟胚体（EB）解离前，吸除层粘连蛋白溶液，将培养板置于组织培养超净台中使其完全干燥。避免使用表面发亮或明显湿润的培养板。将含培养基的拟胚体转移至15 mL离心管中，在15 x g条件下离心3–4分钟，或直至拟胚体完全沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除上清液，加入含DNase（2 U/mL）的细胞解离溶液3 mL，在37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2条件下孵育15分钟。每3分钟轻轻敲击离心管一次，以促进拟胚体解离。</li>
	<li>当拟胚体不可见或孵育时间已达15分钟时，加入6 mL含DNase（1 U/mL）的KSR:N2（1:1）培养基，在200 x g条件下离心5分钟。</li>
	<li>将细胞以4.5–5 × 104个细胞/cm2的密度接种于含LDN-193189（250 nM）、XAV-939（10 µM）和ROCK抑制剂Y-27632（10 µM）的KSR:N2（1:1）培养基中。</li>
</ol>
4. SST 富集方案：&#34;DD12 GFP 高表达 Sonic Hedgehog (SHH)&#34;（接步骤 3.7）
<ol>
	<li>在DD5时，更换含有FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）和SSH（50 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。</li>
	<li>按照步骤3.2–3.3中的说明，在第8天准备用于传代培养的组织培养板（步骤4.4）。</li>
	<li>在DD7时，更换含有FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）和SHH（50 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。</li>
	<li>在DD8时，对细胞进行传代培养。 
	注意：虽然此步骤并非必需，但传代培养可减少早期分化产生的非目标细胞类型。此外，传代还能打散细胞团块，避免对后续免疫组织化学分析造成困难，并提高后期FACS分选的效率。
	<ol>
		<li>进行细胞传代时，使用胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶）在37 °C、相对湿度≥95%及5% CO2条件下消化5分钟，使细胞从培养板上脱落。用两倍体积的KSR:N2终止胰蛋白酶反应，随后以200 × g离心5分钟。通过40 µm滤膜管过滤细胞，以去除任何细胞团块。将细胞以250,000个细胞/cm2的密度重新接种至含有FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）、Y-27632（10 µM）和SHH（50 ng/mL）的N2/KSR（1:1）培养基中。 
		注意：如果决定不在DD8进行细胞传代，则从DD7至DD12每隔两天更换一次含SHH（50 ng/mL）的KSR:N2培养基，并持续添加IGF-1（20 ng/mL）和FGF-2（10 ng/mL）直至DD9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在DD10时，更换含有SHH（50 ng/mL）的KSR:N2培养基。</li>
	<li>在DD12时，为获得富集的SST亚型细胞，使用FACS分离仅表达Lhx6::GFP的细胞。
	<ol>
		<li>消化细胞时，应使用不含胰蛋白酶的细胞解离试剂，而非胰蛋白酶-EDTA。用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入预热的、含有DNase（2 U/mL）的不含胰蛋白酶的细胞解离试剂。将培养板置于37 °C、相对湿度≥95%及5% CO2的培养箱中孵育10–30分钟，或直至细胞完全脱落。每隔5分钟轻轻敲击培养板以促进解离。 
		注意：对于DD11–12的培养物，可能仅需10–15分钟；而对于DD15–16的培养物，可能需要30分钟或更长时间才能完成完全解离。</li>
		<li>待细胞完全从培养板上脱落之后，按照标准操作流程进行FACS分选，或将其用于其他后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 富集PV的方案：&#34;DD11/DD17 mCherry + aPKCi&#34;（接步骤3.7）
<ol>
	<li>在第5天（DD5），更换含FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。</li>
	<li>按照步骤3.2–3.3所述说明，准备用于第8天（DD8）传代的组织培养板（见步骤4.4）。</li>
	<li>在第7天（DD7），更换含FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。</li>
	<li>在第8天（DD8），按照步骤4.4所述方法进行细胞传代，但作如下调整：传代时，将SHH替换为smoothened激动剂（SAG；30 nM），并添加非典型PKC抑制剂（aPKCi；2 µM）。综上，传代所用培养基为含FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）、Y-27632（10 µM）、SAG（30 nM）和aPKCi（2 µM）的N2/KSR（1:1）培养基。</li>
	<li>在第10天（DD10），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。</li>
	<li>第11天（DD11） 
	注意：此时Nkx2.1::mCherry+细胞已富集为PV CIns。
	<ol>
		<li>采用步骤4.6所述相同方案，将细胞从培养板上解离用于FACS。若决定在后续分化天数收集Nkx2.1::mCherry+细胞，则忽略此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第12天（DD12），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。在第14天（DD14），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。在第16天（DD16），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。在第17天（DD17），采用步骤4.6所述相同方案收集Nkx2.1::mCherry+细胞。</li>
</ol>
6. 富集PV的方案：&#34;DD17 mCherry Low SHH&#34;（接步骤3.7）
<ol>
	<li>在第5天，更换为含有FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。在第7天，更换为含有FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。</li>
	<li>在第9天，更换为KSR:N2（1:1）培养基。从此开始，无需添加额外的生长因子。
	<ol>
		<li>此后每2天更换一次培养基，直至第17天收获细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管该方法在模式化 J1 来源的小鼠胚胎干细胞（mESC，SCRC-1010）方面效果显著，但我们在其他 mESC 系及克隆分离株中获得的成功程度不一。例如，Foxg1::venus mESC（EB3 来源；Danjo 等13）对该方案反应较差，使用 DD12 诱导 Foxg1 的效率通常仅为 1–2%。出于尚不完全清楚的原因，另一个同时分离获得的 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 双报告克隆（称为 JQ59），在与本方案所述细胞系（称为 JQ27）完全相同的培养条件下，其表达 Nkx2.1 的细胞比例不足 1%。然而，亲本细胞系（J1；ATCC SCRC-1010）对该方案响应良好，在 DD12 阶段产生的 Nkx2.1 阳性细胞比例与图 1B所示结果相似。如有必要，可调整 XAV-939 和 SHH/SAG 的浓度，以针对不同细胞系优化分化条件。但我们在使用该方案将其他 mESC 系分化为类似内侧神经节隆起（MGE）前体细胞方面的经验仍然有限。
<p class="jove_cont...

在小鼠和人类中，大约一半的皮层抑制性中间神经元（CIns）起源于一种称为内侧神经节隆起（MGE）的短暂性皮层下结构，其中CIns及其他神经元和胶质细胞亚群的神经上皮前体细胞表达转录因子Nkx2.11,2。CIn亚群或亚型由其形态学、神经化学、电生理学及连接特性共同定义3,4。源自MGE的CIns可根据是否表达PV或SST分为基本无重叠的亚群，而PV或SST的表达与特定的电生理特性及连接倾向相关5。中间神经元功能障碍，尤其是PV亚群的功能障碍，已被认为与多种神经精神疾病相关6,7。本方法的总体目标是生成富集PV或SST中间神经元命运的干细胞来源的有丝分裂前体细胞和迁移前体细胞，用于研究皮层中间神经元生物学及其在细胞治疗中的应用。
我们开发了一种可扩展且高效的方案，用于从小鼠胚胎干细胞（mESCs）中诱导生成表达 Nkx2.1 的中间神经元前体细胞及其子代细胞。利用一种携带 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 双报告系统的 mESC 细胞系8，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出表达 Nkx2.1 的前体细胞或其表达 Lhx6 的终末分裂后子代细胞，并进一步用于多种下游应用。通过调控多个信号通路、培养时长以及神经发生模式，我们能够获得数百万个带有荧光标记的中间神经元前体细胞，适用于多种后续实验操作。
尽管已有多种其他方法可用于从mESCs生成类似MGE的前体细胞9,10,11,12,13,14，但我们的方法利用Wnt拮抗剂XAV-939，能够高效地生成共表达Foxg1/Nkx2.1的端脑前体细胞。此外，通过双报告系统对中间神经元前体细胞或其有丝分裂后表达Lhx6的子代细胞进行筛选，显著增强了生成不同类型前体细胞及其子代的能力。

<table><tbody><tr><td>瓶顶式真空过滤系统</td><td>康宁</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>带 snap cap 细胞筛的试管</td><td>ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（CF-1 MEF IRR 7M）</td><td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>1 小瓶 7M MEFs 可用于四块 10 cm 组织培养板。参考文献： &lt;上标 class=&quot;xref&quot;&gt;29&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;35&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>又称抗菌剂。请勿与基础培养基一同过滤——应在过滤后添加。参考文献： &lt;上标 class=&quot;交叉引用&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;36&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;37&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>N2 补充剂-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>不要用基础培养基过滤——过滤后再添加</td></tr><tr><td>Glutamax（100倍浓缩液）</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>也称为 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。参考文献： &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;上标 class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;38&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;上标 class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物 (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>也称为无血清培养基添加剂。参考文献： &lt;sup class=&quot;交叉引用&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;上标 class=&quot;交叉引用&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（100倍）</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA（100倍）</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td>也称为不含谷氨酰胺的DMEM。参考文献： &lt;sup class=&quot;交叉引用&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>也称为干细胞级 FBS。参考文献： &lt;上标 class=&quot;交叉引用&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;上标 class=&quot;交叉引用&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>组织培养处理培养皿（10 cm）</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>非黏附性无菌培养皿（10 cm）</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子（mLIF）</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>不要冷冻，4°C 保存。参考文献： &lt;上标 class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;上标 class=&quot;交叉引用&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 明胶溶液</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%）</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>也称为不含胰蛋白酶的细胞解离试剂。参考文献： &lt;上标 class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;上标 class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>RQ1 无 RNase DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>用DMSO重悬，并在-80°C下分装保存，每份仅供一次性使用</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>用DMSO重悬，并在-80°C下分装保存，每次使用一份</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并分装成单次使用量，于 -80°C 保存</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并在 -80°C 下分装保存，每次使用一份</td></tr><tr><td>ROCK抑制剂（Y-27632）</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>用DMSO重悬，并分装成单次使用量，于-80°C保存</td></tr><tr><td>Smo激动剂（SAG）</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>用 H₂O 重悬，并分装成单次使用量后于 -80°C 保存</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并分装为单次使用量，于 -80°C 保存</td></tr><tr><td>PKC&amp;zeta; 伪底物抑制剂，肉豆蔻酰化</td><td>EMD Millipore</td><td>539624</td><td>用 H₂O 重悬，并以单次使用分装量在 -80°C 下保存</td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABA能皮层中间神经元是一类具有异质性的细胞群体，在调控兴奋性锥体神经元输出以及同步化锥体神经元集群活动方面发挥关键作用。中间神经元功能缺陷已被认为与多种神经精神疾病相关，包括精神分裂症、自闭症和癫痫。通过胚胎干细胞衍生皮层中间神经元，不仅有助于研究其发育过程和功能特性，还能揭示与中间神经元相关疾病发病机制有关的分子通路。此外，中间神经元在移植后表现出显著的存活、迁移及整合入宿主皮层神经环路的能力，使其成为细胞治疗的理想候选细胞。本文介绍一种可扩展、高效率的改良型拟胚体转单层培养方法，用于从小鼠胚胎干细胞（mESCs）中获得表达Nkx2.1的中间神经元前体细胞及其后代细胞。利用携带Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP双报告系统的mESC细胞系，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出Nkx2.1阳性前体细胞或其表达Lhx6的终末分化后代，并进一步应用于多种下游实验。我们还提供了富集小清蛋白（PV）或生长抑素（SST）中间神经元亚群的方法，这些方法可能有助于命运决定机制的研究，或适用于需要特定中间神经元亚群富集移植的治疗应用。

本文所述方案是我们已发表方案15,16,17的改进版本，已针对我们所用的Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP双报告基因mESC细胞系进行了优化。从DD0-5开始添加Wnt抑制剂XAV-939，并在DD8时重新铺板，可实现稳定的Nkx2.1诱导，其中培养物中超过50%的DAPI+细胞核同时表达Nkx2.1（图1A，B）。对mCherry和GFP报告基因进行免疫组织化学染色显示，在Nkx2.1免疫反应阳性区域中报告基因表达清晰（图1A）。利用内源性报告基因对活细胞进行流式细胞分选（FACS），可明确分离出四类细胞：（1）GFP/mCherry双阴性细胞，（2）仅表达mCherry的细胞，（3）仅表达GFP的细胞，以及（4）GF...

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外 或经荧光分选后移植至新生小鼠新皮层，用于细胞命运决定的研究，或用于治疗应用。

GABA能皮层中间神经元是一类具有异质性的细胞群体，在调控兴奋性锥体神经元的输出中发挥着关键作用……

本实验的总体目标是利用改良的拟胚体转单层培养法，从小鼠胚胎干细胞中生成皮层中间神经元前体细胞，进而获得有丝分裂后的中间神经元前体细胞。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如皮层中间神经元的不同亚型在发育过程中如何决定其特定命运。该技术的主要优势在于能够高效生成表达 Nkx2.1 的中间神经元前体细胞，并可进一步通过特定方法富集表达小清蛋白（parvalbumin）或生长抑素（somatostatin）的中间神经元亚群。开始此操作时，将有丝分裂失活的MEF饲养细胞接种于MEF培养基中，并铺在经组织培养处理的培养板上。接种mESC前，需在37摄氏度的细胞培养箱中孵育至少12小时，使细胞充分贴壁。若不能立即使用，应每隔三天更换一次MEF培养基。接下来，将含有小鼠白血病抑制因子的mESCs加入MEF培养板中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。当培养皿细胞融合度达到70%至80%时，使用胰蛋白酶-EDTA传代mESCs，并将mESCs维持在MEF饲养层上的mESC培养基中，以保持其多能性。开始诱导分化前，需将细胞在无饲养层（MEFs）的明胶包被培养板上至少传代一次，以稀释去除饲养层细胞。具体操作为：通过向经组织培养处理的培养皿中加入含钙镁离子的0.1%明胶PBS溶液，37°C孵育至少1小时，制备明胶包被培养板。每块10厘米培养板接种1.5至2×10⁶个细胞，于开始分化前培养2天使其充分扩增。在DD0天，当mESCs在明胶包被的培养板上生长两天后，吸除培养基，并用不含钙和镁的PBS洗涤细胞一次。然后加入足量的胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖培养板表面，将细胞放回37摄氏度的培养箱中孵育四分钟。孵育四分钟后，加入两倍体积的mESC培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。将细胞转移至适当大小的离心管中，在200 × g下离心五分钟。随后取出离心管，小心吸除上清液，避免扰动沉淀的细胞团。将沉淀重悬于1毫升KSR-N2培养基中。随后使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。在非黏附性组织培养皿中，将每毫升KSR-N2培养基接种75,000个细胞，开始以拟胚体形式培养细胞。在37摄氏度下孵育。在DD1天，通过在组织培养处理过的培养皿中加入多聚-L-赖氨酸，于37摄氏度孵育至少1小时或过夜，以准备细胞接种。在DD2天，吸除多聚-L-赖氨酸，并在37摄氏度下用层粘连蛋白包被培养板过夜。在第3天（DD3），开始EB解离前，吸除层粘连蛋白，并将培养板置于组织培养罩内使其完全干燥。随后，将EB连同培养基转移至15毫升离心管中，在15 × g条件下离心3至4分钟，或直至EB形成沉淀。吸除培养基，加入3毫升含有DNase的细胞解离溶液。然后，将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。每 3 分钟轻轻弹击离心管一次，以促进拟胚体解离。当拟胚体不再可见或孵育时间达到 15 分钟后，加入 6 毫升含有 DNase 的 KSR-N2 培养基，并在 200 × g 条件下离心 5 分钟。随后，将细胞以每平方厘米4.5至5×10⁴个细胞的密度接种于含有LDN193189、XAV939和ROCK抑制剂Y27632的KSR-N2培养基中。在DD5时，更换为含有FGF2、IGF1和SSH的KSR-N2培养基。接着，按照DD1和DD2操作步骤中所述说明，准备组织培养板，用于第8天的传代培养。在第7天（DD7），更换含有FGF2、IGF1和SHH的KSR-N2培养基。在第8天（DD8），用胰蛋白酶-EDTA在37摄氏度下消化5分钟，使细胞从培养板上脱离，随后用两倍体积的KSR-N2培养基终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。以200 × g离心5分钟。通过40 µm滤管过滤细胞，以去除任何团块。然后，在含有FGF2、IGF1和Y27632以及SHH的N2-KSR培养基中，以每平方厘米250,000个细胞的密度重新接种细胞。在第10天，使用含有SHH的KSR-N2培养基更换培养液。用不含钙和镁的PBS洗涤细胞一次，向细胞中加入预热的、不含胰酶的细胞解离试剂（含DNase）。将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育10至30分钟，或直至细胞脱落。然后，每五分钟轻轻敲击培养板，以促进解离。在第5天（DD5），更换为含有FGF2和IGF1的KSR-N2培养基。接着，在第8天（DD8）之前准备好组织培养板用于传代培养。在第7天，更换含有FGF2和IGF1的KSR-N2培养基。在第8天，用平滑受体激动剂重铺细胞，并加入非典型PKC抑制剂。在第10天，更换含有aPKCi的KSR-N2培养基。在第11天（DD11），将细胞从培养板上解离用于FACS分析。如果在第11天（DD11）未进行细胞解离用于FACS，则在第12天（DD12）更换含aPKCi的KSR-N2培养基。在第14天（DD14），更换为含aPKCi的KSR-N2培养基。在第16天（DD16），更换含有aPKCi的KSR-N2培养基。然后在第17天（DD17），收集Nkx-2.1:mCherry阳性细胞。此处展示的是分化第12天（DD12）培养物中Nkx2.1、Nkx2.1:mCherry和Lhx6:GFP免疫染色的代表性图像。请注意，这些图像是同一视野下重叠的通道。该图表展示了在培养至 DD12 时，表达 Nkx2.1 的 DAPI 阳性细胞核的平均百分比的定量结果。这是一张具有代表性的流式细胞术分析图，展示了利用我们的双报告基因 mESC 细胞系可分离出的四种不同细胞群体。注意，mCherry 位于 x 轴，GFP 位于 y 轴。因此，右上象限表示 mCherry 和 GFP 双阳性细胞。此处显示了从 DD6 到 DD16 期间 Nkx2.1:mCherry 和 Lhx6:GFP 的诱导时间过程，以培养物中仅表达 mCherry、仅表达 GFP 或共表达 mCherry-GFP 的细胞百分比表示。一旦掌握，该实验方案若操作得当，可在17天内完成全部流程。在实施该操作过程中，务必始终记住：应从多能性、未分化且形态健康的干细胞开始。在完成本方案后，还可进一步采用其他方法，例如将细胞移植至新生或成年小鼠的新皮层，以探究关于中间神经元命运决定，或中间神经元移植对神经环路功能及动物行为影响的更多科学问题。该技术建立后，为发育神经科学领域的研究人员探索驱动小鼠中间神经元命运决定的因素铺平了道路，并进一步有助于研究受中间神经元相关疾病影响的患者。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从小鼠胚胎干细胞中获得表达 Nkx2.1 的前体细胞及其有丝分裂后的子代细胞。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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本视频展示了将人胚胎干细胞（hESCs）直接分化为神经前体细胞（NPCs）的方法，该过程无需使用饲养层细胞或任何中间步骤。通过选择性抑制骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，可诱导hESCs分化为神经前体细胞（NPCs）。...

将人类胚胎干细胞分化为神经前体细胞

本视频介绍了一种从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞的方法。该方案包括在含有特定小分子抑制剂的培养基中培养干细胞，以促进干细胞的增殖并聚集形成拟胚体（EB）。随后，使用酶消化法将拟胚体解离，并接种至包被有黏附蛋白的培养板孔中，以促进其向皮层中间神经元前体细胞分化。...

从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

该视频展示了一种将神经前体细胞分化为神经元的细胞培养方法。通过在添加了生长因子的富含营养的培养基中孵育细胞，前体细胞成熟为具有发育良好的轴突和树突的神经元。一种稳定剂可确保细胞在整个分化过程中的存活率，并防止氧化损伤。...

神经前体细胞向神经元的分化

本视频展示了一种将胚胎干细胞分化为具有功能性突触的神经元网络群体的技术。该方法概述了胚胎干细胞向神经元分化的步骤、神经元网络形成的诱导过程，以及培养物中网络化神经元的富集方法。...

将小鼠胚胎干细胞分化为神经元网络群体

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。...

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。...

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

学习利用改良的胚状体-单层培养法将小鼠胚胎干细胞分化为皮层中间神经元前体细胞。该方法可高效生成表达Nkx2.1的祖细胞，用于研究神经元命运决定及神经系统疾病治疗应用。

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

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