小鼠胚胎干细胞向皮质 Interneuron 前体细胞的分化
2017年12月3日
本议定书描述了一种方法, 产生皮层 interneuron 祖细胞和后有丝分裂 interneuron 前体从小鼠胚胎干细胞使用改良的胚体-单层法。这些祖/前体可用于体外或荧光分类和移植到新生儿大脑皮层研究命运确定, 或用于治疗应用。
该程序的总体目标是使用改良的胚状体到单层方法，在小鼠胚胎干细胞的有丝分裂后中间神经元前体中产生皮质中间神经元祖细胞。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如皮层中间神经元的亚型如何在发育过程中实现其各自的命运。该技术的主要优点是它能够有效产生表达 Nkx2.1 的中间神经元祖细胞，以及富集小清蛋白或生长抑素中间神经元亚群的方法。
要开始此过程，将 MEF 培养基中有丝分裂失活的 MEF 饲养层细胞接种到经组织培养处理的平板上。在铺板 mESC 之前，请至少等待 12 小时，让它们在 37 摄氏度的细胞培养箱中沉淀。如果未立即使用，请每三天更换一次 MEF 介质。
接下来，将含有小鼠白血病抑制因子的 mESC 添加到 MEF 板中。将细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育。培养皿汇合 70% 至 80% 后，使用胰蛋白酶-EDTA 传代 mESC，并将 mESC 保持在 mESC 培养基中的 MEF 饲养层上，以保持多能性。
在开始分化之前，将细胞至少传代一次到不含 MEF 的明胶包被板上以稀释它们。为此，将 0.1% 明胶和含钙和镁的 PBS 加入到经组织培养处理的培养皿中，并在 37 摄氏度下孵育至少 1 小时，以制备明胶包被板。将 1.5 至 2 乘以 10 至第 6 个细胞铺在每 10 厘米平板上，让它们在开始分化前扩增两天。
在 DD0 上，mESC 在明胶包被板上生长两天后，吸出培养基并用不含钙和镁的 PBS 洗涤细胞一次。然后，添加足够的胰蛋白酶-EDTA 以覆盖板的表面。并将细胞放回 37 摄氏度的培养箱中 4 分钟。
4 分钟后，使用两倍体积的 mESC 培养基淬灭胰蛋白酶-EDTA。将细胞转移至适当大小的离心管中，以 200 x g 离心细胞 5 分钟。接下来，取出试管并吸出培养基，而不会干扰沉淀。
将沉淀重悬于一毫升的 KSR-N2 培养基中。随后，使用血细胞计数器或自动细胞计数仪测量细胞浓度。通过在非贴壁组织培养皿中的 KSR-N2 培养基中每毫升添加 75， 000 个细胞，开始将细胞培养为胚状体。
并在 37 摄氏度下孵育它们。在 DD1 上，通过在组织培养处理的培养皿中涂上聚-L-赖氨酸至少 1 小时或在 37 摄氏度下过夜来准备细胞着陆。在 DD2 上，吸出聚-L-赖氨酸，并在 37 摄氏度下用层粘连蛋白包被板过夜。
在 DD3 上，在开始 EB 解离之前，吸出层粘连蛋白并让板在组织培养罩中完全干燥。然后，将 EB 与培养基一起转移到 15 mL 试管中，并以 15 g 离心 3 至 4 分钟，或直到 EB 沉淀。吸出培养基，并加入 3 毫升含有 DNase 的细胞分离溶液。
然后，将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。每 3 分钟轻轻弹动试管，以帮助 EB 解离。一旦 EB 不再可见或 15 分钟过去，加入 6 毫升含有 DNase 的 KSR-N2，并以 200 倍 g 离心 5 分钟。
然后，将细胞接种在含有 LDN193189、XAV939 和 ROCK 抑制剂 Y27632 的 KSR-N2 中，以每平方厘米 4.5 至 5 倍 10 至 4 个细胞的比例接种。在 DD5 上，使用包含 FGF2、IGF1 和 SSH 的 KSR-N2 更换介质。接下来，按照 DD1 和 DD2 程序中概述的说明，准备组织培养板，以便在第 8 天重新接种。
在 DD7 上，更换含有 FGF2、IGF1 和 SHH 的 KSR-N2 的培养基。在 DD8 上，用胰蛋白酶-EDTA 将细胞从板中取出，在 37 摄氏度下放置 5 分钟，以重新铺板。使用 KSR-N2 体积的两倍来淬灭胰蛋白酶-EDTA。
并以 200 倍 g 离心 5 分钟。通过 40 微米过滤管过滤细胞以去除任何团块。然后，以每平方厘米 250， 000 个细胞的比例重新接种在含有 FGF2、IGF1 和 Y27632 和 SHH 的 N2-KSR 中。
在 DD10 上，更换含有 SHH 的 KSR-N2 的介质。用不含钙和镁的 PBS 洗涤细胞一次，并向细胞中加入预热的、不含胰蛋白酶的细胞解离试剂，含有 DNase。将它们放入 37 摄氏度的培养箱中 10 到 30 分钟，或直到细胞分离。
然后，每 5 分钟轻轻敲击板以帮助解离。在 DD5 上，更换含有 FGF2 和 IGF1 的 KSR-N2 的介质。接下来，准备组织培养板以重新接种 DD8。
在 DD7 上，更换含有 FGF2 和 IGF1 的 KSR-N2 的介质。在 DD8 上，用平滑激动剂重新接种细胞并添加非典型 PKC 抑制剂。在 DD10 上，更换含有 aPKCi 的 KSR-N2 的培养基。
在 DD11 上，将细胞从 FACS 的板中分离。如果在 DD11 上没有分离细胞进行 FACS，则用含有 aPKCi 的 KSR-N2 更换 DD12 上的培养基。在 DD14 上，更换含有 aPKCi 的 KSR-N2 的培养基。
在 DD16 上，用含有 aPKCi 的 KSR-N2 更换培养基。然后，在 DD17 上，收集 Nkx-2.1：mCherry 阳性细胞。此处显示的是分化第 12 天培养物中 Nkx2.1、Nkx2.1：mCherry 和 Lhx6：GFP 免疫染色的代表性图像。
请注意，这些图像是来自同一视野的重叠通道。该图显示了培养物中在 DD12 位点表达 Nkx2.1 的 DAPI 阳性细胞核的平均百分比的定量。这是一个具有代表性的 FACS 图，展示了可以使用我们的双报告基因 mESC 系分离的四种不同的细胞群。
请注意，mCherry 位于 x 轴上，而 GFP 位于 y 轴上。因此，右上角的框表示 mCherry-GFP 双正的单元格。这是 Nkx2.1：mCherry 和 Lhx6：GFP 诱导从 DD6 到 16 的时间进程，表示为培养物中仅表达 mCherry、仅表达 GFP 或 mCherry-GFP 共表达的细胞的百分比。
一旦掌握，如果执行得当，该方案可以在从头到尾的 17 天内完成。在尝试此程序时，请务必记住始终从胸膜有能、未分化、外观健康的干细胞开始。在此程序之后，可以进行其他方法，例如移植到新生儿或成年小鼠新皮层中，以回答有关中间神经元命运决定或中间神经元移植对回路功能和动物行为的影响的其他问题。
开发后，这项技术为发育神经科学领域的研究人员铺平了道路，以探索驱动小鼠以及受中间神经元相关疾病影响的患者的中间神经元命运决定的因素。看完这个视频后，您应该对如何从小鼠胚胎干细胞中提取表达 Nkx2.1 的祖细胞及其有丝分裂后代有一个很好的了解。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本协议描述了一种从小鼠胚胎干细胞中使用改良的胚胎体到单层的方法生成皮层间神经元前体和有丝分裂后的间神经元前体的方法。该技术能够有效地生成Nkx2.1表达的间神经元前体，用于研究命运决定和治疗应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 干细胞研究
背景
- 皮层间神经元在大脑功能中扮演着至关重要的角色。
- 了解它们的发育可以为神经系统疾病提供见解。
- 该方法允许研究间神经元的命运决定。
- 它还可以促进特定间神经元亚型的富集。
研究目的
- 从小鼠胚胎干细胞中生成皮层间神经元前体。
- 研究皮层间神经元的发育途径。
- 探索这些前体的潜在治疗应用。
使用的方法
- 改良的胚胎体到单层的方法。
- 使用无丝分裂的MEF饲养层细胞。
- 在37摄氏度下进行细胞培养技术。
- 间神经元前体的荧光分选。
主要结果
- 成功生成皮层间神经元前体。
- 高效富集小白蛋白和胃抑素间神经元亚群。
- 对皮层间神经元命运决定的见解。
- 在神经科学中的潜在治疗应用。
结论
- 该方法为生成间神经元前体提供了一种可靠的方法。
- 它增强了我们对皮层间神经元发育的理解。
- 未来的研究可以利用这些发现进行治疗进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient derivation of cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells enables systematic investigation of interneuron fate determination and supports scalable production of defined neuronal subtypes. This capability is critical for de-risking early neurodevelopmental targets and establishing robust in vitro models for disease-relevant mechanistic studies. The approach facilitates portfolio decisions by providing reproducible access to functionally distinct interneuron populations for downstream screening and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of interneuron lineage specification and fate determination mechanisms.
- Supports biological de-risking by generating Nkx2.1-expressing progenitors and post-mitotic interneuron subtypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental and neuropsychiatric disorder research.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of defined interneuron subgroups for assay standardization.
- Enables quantitative assessment of differentiation efficiency and marker expression via FACS and immunostaining.
- Supports scalable preparation of PV and SST interneuron-enriched populations for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling by generating interneuron populations implicated in neuropsychiatric disorders.
- Enables continuity from in vitro differentiation to in vivo transplantation studies for functional integration analysis.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic strategies targeting interneuron dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical model development, supporting both mechanistic studies and translational applications.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing on interneuron fate and molecular drivers of differentiation.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs for evaluating differentiation protocols and compound effects.
- Analytics: Enables robust measurement of marker expression and population purity using FACS and immunostaining.
- Translational Research: Bridges in vitro differentiation with in vivo transplantation for functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating interneuron subtypes across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in interneuron-targeted discovery and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes differentiation and enrichment protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for interneuron-focused programs and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neuronal differentiation, and FACS-based cell sorting.
- Demands access to specialized instrumentation for fluorescence imaging and flow cytometry.
- Necessitates cross-team standardization of differentiation and enrichment protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different stem cell lines or species-specific models.
- Dependent on maintenance of pluripotency and health of starting mESC populations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Culturing mESCs
2:14
Differentiation mESCs Toward MGE-like Telencephalic Progenitors
4:57
Somatostatin-enriching Protocol: "DD12 GFP High Sonic Hedgehog (SHH)"
6:36
PV-enriching Protocol: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi"
7:53
Generation of Nkx2.1::mCherry and Lhx6::GFP Interneuron Precursors
9:11
Conclusion
