基于刺激拉曼散射的非线性显微镜的实现

该协议可以帮助对非线性显微镜感兴趣的科学家了解基于刺激拉曼散射的显微镜的关键成分、设置和校准过程。SRS 显微镜的主要优点是能够根据振动对比度执行无标签成像，并在几秒钟内获得图像。SRS显微镜将无标签成像技术达到新的高度，特别是对复杂的生物结构（如脂质）的研究，这些生物结构对细胞和细胞结构至关重要。

SRS 信号被检测为探针光束强度的一个小变化，并且可能会被噪声损坏。因此，准确的迹象至关重要。首先，对齐 OPO 和钛蓝宝石激光束，以便它们都到达显微镜。

接下来，将激光束位置传感器的探测器放在双色镜一和镜六之间的两个位置。第一个位置靠近二色镜 1，第二个位置靠近镜六。对于每个位置，使用传感器检测 OPO 光束的 X 和 Y 坐标。

重要的是，验证钛蓝宝石激光束的 X 和 Y 坐标在传感器探测器的两个位置是否具有相同的 OPO。如果在某些位置坐标不重合，则调整相邻镜像的倾斜度以进行补偿。按照此相同的步骤，将钛蓝宝石光束位置与 OPO 对齐，以表示镜子的 6 和 7 之间的路径。

在镜子 6 和 7 之间的触发器安装上安装一个附加的镜像，然后翻转镜像的安装，将光束引导到自动关联器中。打开自动控制器电源，在控制它的计算机上启动软件应用程序，将自焦器的光束距离调整螺钉设置为 8.35 毫米的正常位置。然后，停止钛蓝宝石光束，释放和投射 OPO 光束从附加镜像到自自相对器的输入镜像。

尝试调整输入镜以最大化激光脉冲信号，如下所示。接下来，停止 OPO 光束并释放并投射钛蓝宝石光束从翻转式安装镜到输入镜并投射到自相关器中。重复最佳光束调整，直到获得此处所示的自相关信号。

现在，将光束距离调整螺钉设置为 7.30 毫米的交叉位置。释放两个光束并扫描延迟的线以重叠两个光束。获取生成的交叉关联器信号，如下所示。

然后，翻转拖鞋安装镜，使光束可以到达镜7和显微镜的扫描头。拆下冷凝器并使用逃生按钮暂时收回 60 倍主观镜头。然后旋转鼻片，将 60 倍主观透镜移离光路。

接下来，使用外部机械安装将探测器安装到显微镜的上部。通过 50 欧姆低通滤波器将探测器的输出连接到示波器。现在，打开控制扫描仪头的处理器，将 OPO 光束投射到显微镜的扫描仪头中。

使用 XY 转换器监控 OPO 信号并最大限度地提高探测器测量的功率。然后，将光束从 OPO 激光器切换到钛蓝宝石激光器，并验证是否也为钛蓝宝石激光器获得信号。这表示两个光束对齐良好。

通过旋转回鼻件完成光束对齐，引入 60 倍主观。然后，使用显微镜上的重新聚焦按钮将最终对焦重新获得到 60 倍显微镜客观透镜上。最后，将放大倍数为 40 倍的物体放在冷凝器上，而不会接触或干扰样品。

将显微镜前测量的钛蓝宝石和 OPO 激光器的功率设置为 30 毫瓦。对于两个光束。然后，将 OPO 激光器的波长设置为与上一个值不同的值，使泵和探头与磁珠的振动频率不共振。接下来，释放两个光束，使它们进入显微镜。

运行扫描延迟线计算机化转换器，并使用延迟线的每个位置的锁定放大器记录测量强度。等待延迟线路扫描完成。现在，将OPO的波长设置回1076纳米，使泵和探头与磁珠的振动频率发生共振。

运行扫描延迟线路计算机化转换器，并等待延迟线路扫描完成。最后，设置获得的重叠光束位置和延迟线，用于下一次采集刺激的拉曼散射图像。要优化光束的空间同步，首先停止钛蓝宝石光束，将 OPO 功率降低至 8 毫瓦。

接下来，将探测器读出连接到数据采集卡。与显微镜扫描控制台一起运行数据采集程序。完成后，保存文件并处理数据以获取如下所示的图像。

接下来，停止 OPO 光束，将钛蓝宝石功率降低至 2.5 至 4.5 毫瓦。将探测器与锁定放大器及其读数与数据采集卡连接。然后，与显微镜扫描控制台一起再次运行数据采集程序。

完成后，保存文件并处理数据以获取如下所示的图像。在 40 倍目标和光电二极管之间引入一叠滤波器，以去除泵脉冲并仅获取电火爆送信号。然后，将泵信号设置为 810 纳米，聚焦功率为 8 毫瓦。

将探测信号设置为 1076 纳米，其聚焦功率为 8 毫瓦，以调查聚苯乙烯的典型碳氢键，拉曼移位为 3054 反厘米。将探测器与锁定放大器和锁定放大器的读出连接到数据采集卡。最后，在显微镜程序中设置像素格式和采集时间，并运行它和数据采集系统，一旦完成保存矩阵文件。

此处显示了来自样本单点的示例测量值。当光束在时间或空间中不重叠时，获得的结果是非谐振，其中信号振幅（由锁定放大器测量）为零。但是，此信号的相位在负值和正值之间跳跃。

如果光束在空间中重叠，当光束在时间上完全重叠时，信号将增加并达到最大值，而相位在光束重叠期间开始达到固定值。在传输图像中，使用单个光束，通过光电二极管测量样品的传输光束强度。在左侧，传输图像是使用OPO获得的，而在右侧，传输图像是使用钛蓝宝石获得的。

此处显示了 SRS 图像的典型示例，其中报告了直径为 3 微米的聚苯乙烯珠的无标签图像。为了获得高质量的图像，基于SRS显微镜，显微镜的对齐至关重要。因此，必须认真执行协议中所有指示的步骤。