基于受激拉曼散射的非线性显微镜的实现

本方案可帮助对非线性显微技术感兴趣的研究人员了解基于受激拉曼散射的显微镜的关键组件、搭建方法及光路准直流程。SRS显微技术的主要优势在于能够利用振动对比实现无标记成像，并可在数秒内获取图像。SRS显微技术将无标记成像提升到了新的高度，尤其适用于脂质等复杂生物结构的研究，而脂质是细胞及其结构的基础组分。

SRS 信号表现为探测光束强度的微小变化，容易受到噪声干扰，因此准确的信号符号至关重要。首先，调整 OPO 和钛宝石激光器的光束，使二者均到达显微镜。

接下来，将激光束位置传感器的探测器放置在二向色镜一与镜六之间的两个位置。第一个位置靠近二向色镜一，第二个位置靠近镜六。在每个位置，使用传感器检测OPO光束的X和Y坐标。

重要的是，需验证钛宝石激光束在传感器探测器两个位置时，其X和Y坐标相对于同一OPO是否一致。如果在某些位置坐标不重合，则调节相邻镜片的倾斜角度以进行补偿。请遵循相同的步骤，对位于第六和第七面镜之间的光路中的钛宝石激光束位置相对于OPO进行准直校准。

在第六和第七个反射镜之间的一个翻转支架上安装一个附加反射镜，并翻转该反射镜的支架，以将光束导入自相关仪。打开自相关仪控制器的电源，启动控制计算机上的软件程序，并将自相关仪的光束距离调节螺钉设置为其正常位置，即 8.35 毫米。然后，停止钛宝石激光束，释放并从附加反射镜将OPO光束投射至自相关仪的输入反射镜。

尝试调节输入镜，以最大化此处所示的激光脉冲信号。接下来，停止OPO光束，释放并从翻转镜上反射钛宝石激光束，经输入镜导入自相关仪。重复进行最佳光束调节，直至获得此处所示的自相关仪信号。

现在，将光束距离调节螺钉设置为7.30毫米的十字位置。释放两束光束，并调节延迟线使两束光重叠。获取相应的交叉相关信号，如下图所示。

然后，翻转安装好的翻转镜，使光束能够到达第七面反射镜和显微镜的扫描头。取下聚光镜，并按下退出按钮，暂时收回60倍物镜。随后旋转物镜转盘，将60倍物镜移出光路。

接下来，使用外部机械支架将探测器安装到显微镜的上部。将探测器的输出端通过一个50欧姆低通滤波器连接至示波器。然后，打开控制扫描头的处理器，并将OPO光束导入显微镜的扫描头中。

使用XY平移台监测OPO信号，并通过探测器测量到的功率进行最大化调节。然后，将OPO激光的光束切换为钛宝石激光，并确认钛宝石激光同样能获得信号。这表明两束光均已良好准直。

通过旋转物镜转换器，重新装上60倍物镜以完成光路校准。然后，使用显微镜上的重新对焦按钮，将焦点最终调整至60倍物镜。最后，将40倍物镜放置在聚光镜位置，替换聚光镜，注意不得触碰或扰动样品。

将钛宝石激光器和OPO激光器在进入显微镜前的输出功率均设置为30毫瓦。然后，将OPO激光器的波长调节至与之前不同的数值，使得泵浦光和探测光均不与微珠的振动频率发生共振。接着，释放两束激光，使其进入显微镜系统。

运行扫描延迟线计算机化转换器，并使用锁相放大器记录延迟线每个位置测得的光强。等待延迟线扫描完成后，将OPO的波长重新设置为1076纳米，使泵浦光和探测光与微珠的振动频率共振。

运行扫描延迟线计算机化转换器，并等待延迟线扫描完成。最后，设置获得的重叠光束位置和延迟线，以进行下一次受激拉曼散射图像的采集。为优化光束的空间同步，首先停止钛宝石激光束，并将OPO功率降低至八毫瓦。

接下来，将探测器读出端连接到数据采集卡。运行数据采集程序以及显微镜扫描控制台。完成后，保存文件并处理数据，以获得如本图所示的图像。

接下来，停止OPO光束，并将钛宝石激光器的功率降低至2.5至4.5毫瓦。将探测器连接至锁相放大器，并将锁相放大器的输出信号连接至数据采集卡。然后，再次运行数据采集程序以及显微镜扫描控制台。

完成后，保存文件并处理数据，以获得如本图所示的图像。在40倍物镜和光电二极管之间插入一组滤光片，以去除泵浦脉冲，仅采集斯托克斯信号。然后，将泵浦光信号设置为810纳米，聚焦功率为8毫瓦。

将探针信号设置为1076纳米，聚焦功率与之前相同，为八毫瓦，以检测聚苯乙烯中拉曼位移为3054厘米⁻¹的典型碳-氢键。将探测器连接至锁相放大器，并将锁相放大器的输出连接至数据采集卡。最后，在显微镜程序中设置像素格式和采集时间，运行显微镜程序及数据采集系统，待采集完成后保存矩阵文件。

此处显示的是来自样品单一点位的一个测量示例。当光束在时间或空间上未重叠时，所得结果处于失谐状态，此时由锁相放大器测得的信号幅度为零。然而，该信号的相位在负值和正值之间跳跃。

当光束在空间上重叠时，信号增强，并在光束在时间上完全重叠时达到最大值，而相位在光束重叠的时间段内开始趋于一个固定值。在透射成像中，使用单束光，通过光电二极管测量样品透射光束的强度。左侧的透射图像使用OPO获得，而右侧的透射图像使用钛宝石激光器获得。

此处展示了一个典型的受激拉曼散射（SRS）图像实例，其中报道了直径为三微米的聚苯乙烯微珠的无标记成像结果。为了基于SRS显微技术获得高质量图像，显微镜的准直至关重要。因此，必须仔细执行本方案中所有标明的步骤。