Name: 体内 使用双光子荧光和受激拉曼散射显微镜对生物组织进行成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习双光子荧光与受激拉曼散射双模态显微成像技术，对小鼠脊髓进行活体无标记成像。该方法可获取生物组织的生化与生物物理信息，用于研究神经退行性疾病及脊髓损伤中的细胞动态与相互作用。

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本工作获得了香港研究资助局基金项目16103215、16148816、16102518、16102920、T13-607/12R、T13-706/11-1、T13-605/18W、C6002-17GF、C6001-19E、N_HKUST603/19，创新科技署（ITCPD/17-9），大学教育资助委员会卓越学科领域计划（AoE/M-604/16，AOE/M-09/12）以及香港科技大学的资助 &amp;#38; 科技大学（HKUST）通过资助项目 RPC10EG33 提供支持。

本研究中所有动物实验均按照香港科技大学（HKUST）实验动物中心的指南进行，并已获得HKUST动物伦理委员会的批准。搭建和操作双光子激发荧光-受激拉曼散射显微镜（TPEF-SRS）前，必须接受激光操作安全培训。在接触激光时，务必佩戴适用于相应波长范围的激光防护眼镜。
1. 双光子激发荧光-受激拉曼散射显微镜的搭建（显微镜搭建示意图见图1）
<ol>
	<li>使用一台集成的光学参量振荡器（OPO），并将其与锁模掺镱光纤激光器连接，作为SRS成像的皮秒&#160;激光光源。 
	注：OPO输出一束斯托克斯光（1031 nm）和一束泵浦光（波长可调，范围为780 nm至960 nm），脉冲持续时间为2 ps，重复频率为80 MHz。斯托克斯光束通过内置电光调制器（EOM）在20 MHz频率下进行调制，以实现兆赫级高频&#160;相敏&#160;SRS检测。</li>
	<li>使用飞秒钛（Ti）：蓝宝石激光器作为双光子激发荧光（TPEF）成像的激光光源。</li>
	<li>使用一对透镜（L1和L2）对飞秒激光束进行准直，并调节其光束直径至3 mm。</li>
	<li>使用另一对透镜（L3和L4）对皮秒激光束进行准直，并将其光束直径扩展至3 mm。</li>
	<li>使用半波片将飞秒激光束的偏振方向从p偏振转换为s偏振。</li>
	<li>利用偏振分束器（PBS）将两束激光合并。</li>
	<li>在PBS后方安装一对3 mm的XY扫描振镜，用于激光束的扫描。</li>
	<li>使用远心扫描透镜（L5）和无限远校正管镜（L6），将扫描镜与25倍物镜的后光瞳共轭。通过扫描透镜和管镜扩展激光束，使其充满物镜的后光阑。</li>
	<li>在管镜与物镜之间放置一个PBS或二向色镜（D2），用于SRS或荧光信号的收集。使用电动翻转镜在PBS和D2之间切换。 
	&#8203;注：由于后向散射的SRS信号在通过PBS时偏振方向随机偏移，部分信号会因此丢失。</li>
	<li>使用一对透镜（L7和L9）收窄检测光束，并将25倍物镜的后光瞳与光电二极管传感器共轭。</li>
	<li>使用另一对透镜（L8和L10）收窄检测光束，并将25倍物镜的后光瞳与光电倍增管（PMT）的检测面共轭。</li>
	<li>使用二向色镜（D3）分离荧光与SRS信号的检测光路。</li>
	<li>在光电二极管探测器前放置滤光片组（Fs1），以阻挡斯托克斯激光，仅允许泵浦光通过。</li>
	<li>在PMT探测器前放置滤光片组（Fs2），仅允许目标荧光信号通过。</li>
	<li>将PMT连接至电流放大器，以放大信号。</li>
	<li>将光电二极管连接至锁相放大器。</li>
	<li>将内置EOM输出的同步信号连接至锁相放大器的参考输入端，用于SRS信号的解调。</li>
	<li>将PMT放大器和锁相放大器的输出端连接至数据采集模块。</li>
</ol>
2. TPEF-SRS 显微镜系统校准
<ol>
	<li>激光器启动
	<ol>
		<li>将钥匙开关从待机位置切换至开启位置，以启动钛宝石激光器，并等待30分钟使激光器预热。</li>
		<li>通过点击OPO控制面板上的启动按钮开启OPO，并等待20分钟使激光器预热。</li>
		<li>皮秒激光器预热完成后，使用高速光电探测器检查斯托克斯光束的调制深度。打开斯托克斯光束的激光快门。点击设置OPO功率框&#160;并输入20。将高速光电探测器置于OPO输出端以检测光束。使用带有Bayonet Neill-Concelman（BNC）接头的同轴电缆将光电探测器的输出端连接至示波器的输入端，以监测激光脉冲。</li>
		<li>在OPO控制软件中打开EOM控制窗口。根据示波器上显示的脉冲强度图调整EOM的功率和相位，以在20 MHz下实现最大调制深度。 
		注意：EOM性能通常稳定，仅当发现SRS信号显著降低时才需要检查。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组合式双光子激发荧光-受激拉曼散射显微镜的光学对准
	<ol>
		<li>按照步骤2.2.2至2.2.13所述，对皮秒和飞秒光束进行共定位的光学对准。</li>
		<li>在OPO控制软件中打开泵浦激光快门，同时停止斯托克斯光束输出。使用OPO控制软件，点击设置信号框并输入波长值796，将泵浦光束波长设为796 nm。点击设置OPO功率&#160;框并输入20，将其功率设为最低值（约20 mW），用于光学对准。</li>
		<li>开启显微镜计算机及所有相关电子组件，包括扫描器、物镜驱动器、光电二极管、光电倍增管（PMT）、电流放大器、锁相放大器和电动翻转镜。启动显微镜控制软件。 
		注意：显微镜控制软件为自制界面。</li>
		<li>在光路中放置两块对准板（P1和P2，见图1）。将P1放置在偏振分束器（PBS）后约10 cm处，将P2放置在P1后约30 cm处。 
		注意：皮秒和飞秒光束通过PBS合并（图1）。这两块对准板用于检查光束的对准情况及其共定位。</li>
		<li>打开显微镜控制软件中皮秒激光光束的快门。</li>
		<li>调节反射镜M1，使皮秒激光光束中心对准P1上的通孔。调节M1时，使用红外（IR）观察仪观察P1处光斑的位置。</li>
		<li>调节反射镜M2，使皮秒激光光束中心对准P2上的通孔。调节M2时，使用IR观察仪观察P2处光斑的位置。</li>
		<li>重复步骤2.2.6和2.2.7，直至皮秒光束中心同时对准两块对准板的通孔。在显微镜控制软件中关闭皮秒光束的快门。</li>
		<li>将飞秒钛宝石激光器波长设为740 nm并打开激光快门。将激光功率设为5 mW（在显微系统输入端口测量），用于光学对准。</li>
		<li>打开显微镜中飞秒激光光束的快门。</li>
		<li>调节反射镜M3，使飞秒激光光斑中心对准P1上的通孔。</li>
		<li>调节反射镜M4，使激光光斑中心对准P2上的通孔。</li>
		<li>重复步骤2.2.11和2.2.12，直至飞秒激光光束中心同时对准两块对准板的通孔。关闭显微镜中飞秒光束的快门。</li>
		<li>按照步骤2.2.15至2.2.18所述，实现泵浦光束与斯托克斯光束的空间重叠。 
		&#8203;注意：尽管泵浦光束和斯托克斯光束在皮秒激光器内部已大致重叠，但仍需对两束激光的位置进行微调，以实现最佳SRS性能。由于泵浦光束已如前所述完成对准，接下来需调节斯托克斯光束，使其与泵浦光束共定位。</li>
		<li>在物镜位置放置一个相机，以可视化两个光斑的位置。在相机屏幕上标记泵浦光束的位置作为参考。</li>
		<li>在L3前放置对准板P0（图1）。使用六角扳手调节光学反射镜1（OM1），使斯托克斯光束中心穿过对准板的通孔，并在激光输出端口处与泵浦光束共定位。调节过程中使用IR观察仪确认P0处光斑的位置。 
		注意：OM1和OM2是OPO头内的两个反射镜，用于调节1031 nm斯托克斯光束的位置。</li>
		<li>移除对准板P0，并使用六角扳手调节OM2，使斯托克斯光束中心与相机上泵浦光束的参考标记重合。</li>
		<li>重复步骤2.2.16和2.2.17，直至斯托克斯光束在P0和相机平面均与泵浦光束严格重叠。 
		注意：在相机上观察光斑时，应从光路中移除所有对准板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化成像条件
	<ol>
		<li>按照步骤2.3.2至2.3.7所述，进行锁相放大器的相位调节。 
		注意：SRS检测基于高频相敏方案。在SRL检测中，斯托克斯光束强度在20 MHz下被调制，使用锁相放大器对信号进行解调。需调节锁相放大器的相位和偏移，以获得最佳图像对比度。</li>
		<li>打开锁相放大器控制软件。</li>
		<li>将泵浦激光波长设为796 nm，样品上的泵浦光束和斯托克斯光束功率分别设为15 mW和25 mW。 
		注意：此处使用橄榄油进行SRS成像优化和校准。橄榄油在碳氢区域的拉曼峰位于2863.5 cm-1，对应泵浦光束波长为796 nm。</li>
		<li>将橄榄油密封在载玻片上，并在载玻片底部贴附折叠的纸巾，以增强背向SRS检测的信号散射。将橄榄油样品置于载物台上，并调节25倍物镜的焦点至样品上。</li>
		<li>使用显微镜控制软件设置成像参数如下：512 × 512像素，视场（FOV）为500 μm × 500 μm，像素驻留时间为6.4 μs。使用锁相放大器控制软件将时间常数设为10 μs，接近像素驻留时间。</li>
		<li>扫描样品上的激光光束。使用锁相放大器控制软件以22.5°步长调节相位（0–180°），直至SRS信号强度达到最大。 
		注意：在此全模拟锁相放大器中，信号输出为同相分量，其值依赖于参考信号的相位。可通过锁相放大器控制软件以11°分辨率调节相位，使检测信号最大化至约2%以内12。一旦同步信号中断，锁相放大器将失相，每次重新建立同步信号后均需重新调节相位。</li>
		<li>在激光快门关闭的情况下扫描样品。使用锁相放大器控制软件以1 mV步长调节偏移值，直至平均SRS信号接近零。 
		注意：平均SRS信号由显微镜控制软件自动计算，定义为SRS图像中所有像素强度的平均值。偏移可用于消除不需要的相位相干信号。</li>
		<li>按照步骤2.3.9至2.3.14所述，进行时间同步优化。</li>
		<li>在OPO控制软件中打开延迟管理器对话框（图2）。</li>
		<li>扫描橄榄油样品并调节延迟阶段，直至橄榄油的SRS信号达到最大。 
		注意：首次进行SRS成像时，若锁相放大器相位尚未优化，应先粗略调节时间同步，以在优化锁相放大器相位前观察到样品的SRS信号。</li>
		<li>停止扫描，并在延迟管理器对话框中点击添加数据按钮，记录当前延迟数据。</li>
		<li>对不同波长下的不同化学样品重复步骤2.3.10和2.3.11。 
		注意：使用聚苯乙烯微球、重水、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷和甘油等样品，在不同振动谱带下测量延迟数据。</li>
		<li>在延迟管理器对话框中选择数据拟合和五阶，使用五阶多项式函数拟合当前数据点。点击用作自定义按钮并勾选复选框，应用拟合数据。延迟阶段将根据拟合的延迟曲线在不同波长下自动调节。</li>
		<li>将所有延迟数据保存为文本文件，以便将来调用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠手术准备 体内 荧光与受激拉曼散射成像
<ol>
	<li>对所有所需工具进行灭菌，包括手术刀、弹簧剪、镊子、盖玻片和纱布垫。</li>
	<li>用70%乙醇消毒手术过程中可能接触的所有表面。用无菌铺巾覆盖实验台的工作区域，并在铺巾下放置加热垫。</li>
	<li>使用 Thy1-YFP-H（Tg(Thy1-YFP)HJrs/J）37 表达增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的背根神经节传入神经元的转基因小鼠 体内 脊髓成像。称量小鼠体重，并通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮-赛拉嗪混合物（87.5 mg/kg）进行麻醉-1 和 12.5 mg kg-1).</li>
	<li>捏住小鼠脚趾以确认处于深度麻醉状态。如有需要，补充原麻醉剂剂量的一半。在小鼠眼睛上涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>剃除胸椎上方背部的毛发，然后使用脱毛膏彻底清除残留毛发。用碘溶液对剃毛区域进行消毒。</li>
	<li>使用手术刀在T11-T13椎体对应的皮肤上做一长约1.5 cm的正中切口。</li>
	<li>切开&#160;使用弹簧剪和镊子分离T11-T13椎骨上方及两侧的肌肉和肌腱。暴露相邻的三节椎骨。用无菌纱布和无菌生理盐水控制出血&#160;清洁手术部位。</li>
	<li>借助定制设计的稳定平台上两个不锈钢侧栏来固定脊柱图2B).</li>
	<li>使用2号镊子在T12水平进行椎板切除术。小心使用镊子逐块折断椎板，直至完全移除T12椎骨的整个椎板。</li>
	<li>用无菌生理盐水冲洗覆盖在脊髓上的血液，并用纱布垫吸去多余液体。用一块纱布垫对出血部位施加压力以控制出血。</li>
	<li>将盖玻片（22 × 22 mm）置于夹紧杆上，并用生理盐水填充盖玻片与脊髓之间的间隙。</li>
</ol>
4. 体内 小鼠脊髓的TPEF-SRS成像
<ol>
	<li>将稳定平台安装在双光子激发-受激拉曼散射（TPEF-SRS）显微镜下方的五轴平台上。 
	注：五轴平台支持三轴平移以及±5°的俯仰和滚动柔性运动。</li>
	<li>使用两个头夹固定小鼠头部，并降低固定板，为呼吸过程中胸部的运动提供足够空间，以减轻运动伪影。</li>
	<li>在小鼠身下放置加热垫，以在成像过程中保持其体温。</li>
	<li>调节z轴平移平台，调整焦距，直至在10倍物镜下可观察到脊髓血管的明场图像。</li>
	<li>通过调节五轴平台的两轴平移装置，将脊髓背侧静脉置于视场（FOV）中心。</li>
	<li>根据明场图像，调节五轴平台的滚动和俯仰角度，使脊髓背侧表面与物镜轴线垂直。</li>
	<li>将10倍物镜更换为25倍水浸物镜，用于TPEF-SRS成像。</li>
	<li>将飞秒（fs）激光束的波长设置为920 nm，调节其在样品上的功率至10 mW。</li>
	<li>将泵浦光束的波长设置为796 nm，调节泵浦光束和斯托克斯光束在样品上的功率分别为60 mW和75 mW。 
	注：脊髓的SRS成像在波数2863.5 cm-1处进行，该波数对应于基于实测SRS光谱所得的髓鞘碳氢键区域的拉曼峰7,9。激光功率的选择旨在确保脊髓的高分辨率TPEF-SRS成像。在当前成像条件下未观察到组织损伤。</li>
	<li>进行SRS成像时，按下与电动翻转镜相连的切换按钮，通过电动翻转装置选择物镜上方的PBS光路。</li>
	<li>设置成像参数如下：512 × 512像素，对应150 μm × 150 μm视场（FOV），像素驻留时间为3.2 μs，时间常数为2 μs。</li>
	<li>开始扫描样品，并将焦点置于脊髓背侧表面。</li>
	<li>通过OPO控制软件精细调节延迟平台，直至获得最大的脊髓SRS信号。 
	注：生物样品可能引入额外的色散，因此可能需要调节延迟平台以优化两束激光脉冲之间的时间同步。然而，当SRS成像在组织表层附近进行时，生物组织和成像窗口引入的两束激光脉冲间的时间差通常较小（小于数百飞秒）。</li>
	<li>进行TPEF成像时，按下与电动翻转镜相连的切换按钮，通过电动翻转装置选择物镜上方的二向色镜D2。</li>
	<li>设置成像参数并开始扫描样品。为获取TPEF-SRS图像堆栈，应在同一深度依次采集TPEF和SRS图像，两次成像间隔1秒，然后进入下一深度。TPEF成像的参数为512 × 512像素，150 μm × 150 μm视场（FOV），像素驻留时间为3.2 μs。</li>
	<li>完成所有图像采集后，将动物从稳定平台上移除。</li>
	<li>用生理盐水冲洗暴露的组织，并用纱布吸除多余液体。在暴露的脊髓上涂抹硅胶凝胶，静置约5分钟直至其固化。</li>
	<li>使用#6-0外科缝线缝合皮肤以关闭切口。在手术部位皮肤上涂抹烧伤膏以预防感染。皮下注射镇痛药物（0.1 mg/kg布托啡诺）。</li>
	<li>将动物置于清洁的笼子中，并将笼子放在加热垫上，直至小鼠完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>术后每12小时重复给予镇痛药物，持续3天。</li>
	<li>关闭OPO和飞秒激光器的快门，将泵浦光束和斯托克斯光束的功率调至最大。 
	注：在关闭激光器前将功率调至最大有助于激光器的维护。</li>
	<li>将泵浦光束和飞秒激光器的波长均设置为800 nm。</li>
	<li>将两台激光器设为待机状态，关闭所有电子控制软件，并关闭所有相关设备。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露，且不存在竞争性经济利益。

在本实验方案中，详细描述了双光子激发荧光-受激拉曼散射（TPEF-SRS）显微镜的基本配置。对于SRS成像，泵浦光束和斯托克斯光束在光学参量振荡器（OPO）内部实现时间和空间上的重叠&#160;。然而，这种重叠在通过显微镜系统后可能会被破坏。因此，对泵浦光束和斯托克斯光束在空间和时间上的共定位进行优化，是实现最佳SRS成像所必需且关键的步骤。泵浦光束与斯托克斯光束之间的时间延迟与两束光的光程差有关，而光程差由显微镜系统中光学元件的色散特性决定38。当调节泵浦光束的波长以在不同拉曼位移下进行SRS成像时，由于光学透镜的折射率依赖于波长，泵浦光束的光程长度会相应变化38。因此，泵浦光束与斯托克斯激光脉冲之间的时间延迟会随泵浦光束波长的改变而变化，必须进行校准。OPO配备有软件控制的延迟线，用于实现泵浦光束与斯托克斯光束的时间同步。对于相同的光学配置，延迟数据保持稳定，仅需校准一次即可。因此，可在首次测量时保存不同泵浦光束波长下的延迟数据，供后续使用。当泵浦光束波长改变时，OPO控制软件可自动应用已校准的延迟数据，便于在不同拉曼位移下或进行高光谱S...

拉曼显微镜1,2 正作为一种强大的无标记方法崭露头角，该方法基于生物分子中各种化学键的特征频率对生物组织进行成像。由于其具有非侵入性和良好的成像适应性，拉曼显微技术已被广泛用于成像富含脂质的生物组织组分，如髓鞘3,4,5，脂肪细胞6,7和脂滴8,9,10受激拉曼散射（SRS）信号以受激拉曼增益（SRG）或受激拉曼损耗（SRL）形式获取时无背景干扰，其光谱与自发拉曼散射具有完美的相似性11,12此外，SRL和SRG与分析物浓度呈线性关系，可实现对生物化学成分的定量分析9,11,13双光子激发荧光显微镜技术（TPEF）已被广泛用于 体内 由于其固有的光学切片能力、深层穿透性以及低光毒性，生物成像14,15,16然而，双光子激发荧光成像的性能依赖于荧光标记物的特性，且由于荧光光谱较宽，可分辨的颜色数量受限。8,17,18,19无标记SRS成像与基于荧光的TPEF成像为两种互补的成像模式，二者结合可提供丰富的组织生物物理与生化信息。这两种成像模式均基于非线性光学（NLO）过程，因而可简便地集成于同一显微系统中。SRS与TPEF成像的结合，即所谓的双模态成像，能够实现对细胞和组织的高维成像与分析，有助于全面理解复杂的生物系统。具体而言，皮秒（ps）SRS显微技术相较于飞秒（fs）SRS技术，可实现更高光谱分辨率的化学键成像。11，能够区分生物组织中的多种生化成分，尤其是在拥挤的指纹区20,21此外，与另一种常用的结合了相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜的双模非线性光学显微系统相比，受激拉曼散射（SRS）在光谱和图像解析以及检测灵敏度方面均表现出优于CARS的性能。11SRS-TPEF 显微镜已被用作研究多种生物系统的有力工具，例如 秀丽隐杆线虫9,22, 非洲爪蟾 蝌蚪脑5，小鼠脑23,24脊髓25,26，外周神经27，以及脂肪组织7等。
脊髓与大脑共同构成中枢神经系统（CNS）。在生理和病理条件下，对活体（in vivo）中枢神经系统内细胞活动的可视化观察，对于理解中枢神经系统疾病机制28,29,30以及开发相应的治疗方法31,32,33至关重要。髓鞘包裹并绝缘轴突，以实现动作电位的高速传导，在中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用。脱髓鞘被认为是白质疾病（如多发性硬化症34）的标志性特征。此外，在脊髓损伤35后，髓鞘碎片可调节巨噬细胞的活化，从而导致慢性炎症和继发性损伤36。因此，对活体小鼠模型中髓鞘、神经元及胶质细胞进行in vivo成像，有助于深入理解中枢神经系统疾病中的动态过程。
在本方案中，描述了自行搭建的双光子激发荧光-受激拉曼散射（TPEF-SRS）显微镜的基本组装步骤，并介绍了双模态 体内 介绍小鼠脊髓的成像方法。

<table><tbody><tr><td>#2 镊子</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td>用于椎板切除术</td></tr><tr><td>10X 物镜</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td><td></td></tr><tr><td>25X 物镜</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP2</td><td></td></tr><tr><td>烧伤膏</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Sony</td><td>&amp;alpha;6300</td><td></td></tr><tr><td>电流放大器</td><td>Stanford research</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>电流光电倍增模块</td><td>Hamamatsu</td><td>H11461-01</td><td></td></tr><tr><td>D2 665 nm 长通二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF665-Di02-25x36</td><td>用于将落射荧光信号引导至检测模块</td></tr><tr><td>D3 700 nm 短通二向色镜</td><td>Edmund</td><td>69-206</td><td>用于分离SRS与TPEF检测光路</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FS1 975 nm 短通滤光片</td><td>Edmund</td><td>86-108</td><td>用于阻断斯托克斯光束</td></tr><tr><td>FS1 带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310</td><td>用于阻断斯托克斯光束</td></tr><tr><td>Fs2 带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/50</td><td>用于选择YFP信号</td></tr><tr><td>Fs2 短通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-715/SP-25</td><td>用于阻断飞秒激发激光束</td></tr><tr><td>半波片</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td></td></tr><tr><td>高速光电探测器</td><td>MenloSystems</td><td>FPD 310-F</td><td>用于检测斯托克斯光束调制情况</td></tr><tr><td>碘</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红外观察仪</td><td>FJW</td><td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td><td></td></tr><tr><td>光圈</td><td>Thorlabs</td><td>CPA1</td><td></td></tr><tr><td>L1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L10</td><td>Thorlabs</td><td>LA4052-A</td><td></td></tr><tr><td>L2</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-B</td><td></td></tr><tr><td>L3</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B</td><td></td></tr><tr><td>L4</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L7</td><td></td><td></td><td>f=100 mm，AB镀膜</td></tr><tr><td>L8</td><td>Thorlabs</td><td>LA4874-A</td><td></td></tr><tr><td>L9</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>APE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反射镜</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>电动翻转镜</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td><td></td></tr><tr><td>多功能采集卡</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>TDS2012C</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>APE</td><td></td><td>用于检测SRS信号</td></tr><tr><td>皮秒激光源</td><td>APE</td><td>picoEmerald</td><td></td></tr><tr><td>偏振分束器</td><td>Thorlabs</td><td>CCM1-PBS252/M</td><td></td></tr><tr><td>功率计</td><td>Newport</td><td>843-R</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扫描透镜 L5</td><td>Thorlabs</td><td>SL50-CLS2</td><td></td></tr><tr><td>扫描镜</td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td></td></tr><tr><td>硅凝胶</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>钛：蓝宝石飞秒激光器</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Ultra II</td><td></td></tr><tr><td>管镜 L6</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200-S8</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于分子固有的振动特性，对生物组织在其天然微环境中的状态进行无标记成像，从而为在亚细胞分辨率下开展生物过程的体内研究提供了理想工具。通过将双光子激发荧光（TPEF）成像整合到SRS显微系统中，这种双模态体内组织成像技术可以从多个角度获取关键的生化与生物物理信息，有助于理解细胞代谢、免疫反应及组织重塑等过程中的动态变化。本视频方案介绍了TPEF-SRS显微系统的搭建方法以及动物脊髓的体内成像技术。脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分，在大脑与周围神经系统之间的信息传递中发挥着关键作用。富含磷脂的髓鞘包裹并绝缘轴突，以实现动作电位的跳跃式传导。体内对脊髓中髓鞘进行成像，对于研究神经退行性疾病及脊髓损伤的进展具有重要意义。本方案还详细描述了动物准备以及体内TPEF-SRS成像方法，以获取高分辨率的生物图像。

体内对脊髓轴突及髓鞘的双模态成像在 Thy1-YFPH 转基因小鼠中进行，该小鼠在背根神经节传入神经元中表达 EYFP（图 3）。这些标记的传入神经元将感觉信息从外周神经传递至脊髓，其中央支位于脊髓背柱。利用双光子激发荧光-受激拉曼散射（TPEF-SRS）显微镜，可通过无标记 SRS 成像清晰地观察到密集分布的髓鞘，同时通过 TPEF 成像可观测到稀疏标记的 YFP 轴突。双模态成像结果显示，轴突被一层厚实的髓鞘紧密包裹（图 3C）。郎飞结（NR）是轴膜裸露于髓鞘之外的区域，在动作电位的快速跳跃式传导中发挥关键作用。从 TPEF-SRS 脊髓图像（图 3C）中可见，郎飞结处轴突直径减小，轴膜直接暴露于细胞外基质中。为确认郎飞结的存在及其位置，必须同时对轴突及其周围髓鞘进行成像。因此，TPEF-SRS 显微技术使我们能够在脊髓疾病发展过程中观察轴突与髓鞘的动态变化，这对于理解细胞动态机制具有重要意义。
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受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于内在特性，在天然微环境中对生物组织进行无标记成像。

利用亚细胞分辨率和化学特异性对生物组织进行活体成像，是研究细胞代谢、免疫反应和组织重塑过程中动态变化的有力工具。结合双光子荧光和受激拉曼散射显微技术，可从多个角度获取具有亚细胞分辨率的生物组织关键生物化学与生物物理信息。具体而言，这种双模态显微技术可用于成像小鼠脊髓中的细胞动态行为与相互作用，以研究神经退行性疾病及脊髓损伤的进展过程。首先，将钛蓝宝石激光器的钥匙开关从待机位置转至开启位置以启动激光器，并等待30分钟使激光器预热。随后，点击OPO控制面板上的启动按钮以开启OPO，并等待20分钟使激光器预热。皮秒激光器预热完成后，通过将斯托克斯光束的功率降低至约20毫瓦，打开斯托克斯光束的激光快门，并在OPO输出端放置一个高速光电探测器来检测光束，以检查斯托克斯光束的调制深度。接下来，使用带BNC接头的同轴电缆将光电探测器的输出端口连接到示波器的输入端口，以监测激光脉冲。然后在OPO控制软件中打开EOM控制窗口，根据示波器上显示的脉冲强度图调整EOM的功率和相位，以在20兆赫兹下实现最大的调制深度。在OPO控制软件中，打开泵浦激光快门，同时停止斯托克斯（Stokes）输出。接下来，单击设置信号框，将泵浦光束的波长设置为 796 纳米，然后单击设置 OPO 功率框并输入 20，将其功率设置为光学准直所需的最小值。随后，将准直板 P1 放置在偏振分束器后方约 10 厘米处，并在光路中将准直板 P2 放置在 P1 后方约 30 厘米处。打开飞秒激光束的显微镜快门后，调节反射镜 M1，使飞秒激光束中心对准 P1 上的通孔。调节反射镜 M1 时，使用红外观察仪观察光斑在 P1 上的位置。类似地，调节反射镜 M2，使飞秒激光束中心对准 P2 上的通孔。调节反射镜 M2 时，使用红外观察仪观察光斑在 P2 上的位置。当调节反射镜使飞秒激光束中心同时对准两块准直板的通孔后，在显微镜控制软件中关闭飞秒激光束的快门。接下来，打开飞秒激光束的显微镜快门。调节反射镜 M3，使飞秒激光束光斑中心位于 P1 通孔的中心，然后调节反射镜 M4，使飞秒激光束光斑中心位于 P2 通孔的中心。反复调节反射镜，直至飞秒激光束中心准确对准两个对准板的通孔后，关闭飞秒激光束的显微镜快门。随后，在物镜位置放置一台相机，以观察两个光斑的位置，并在相机屏幕上标记泵浦光束的位置作为参考。然后在透镜 L3 前放置校准板 P0，使用六角扳手调节光学反射镜一，使斯托克斯光束中心穿过激光输出端校准板上的通孔。调节过程中使用红外观察仪确认 P0 处光斑的位置。接着，移除校准板 P0，使用六角扳手调节光学反射镜二，使斯托克斯光束中心与相机上泵浦光束的参考标记重合。持续调节镜片，直至拉曼光束在 P0 和相机平面处均与泵浦光束完全重合。打开锁相放大器控制软件，将泵浦激光器的波长设为 796 纳米，泵浦光束和拉曼光束的功率分别设为 50 和 70 毫瓦，对应样品上的功率分别为 15 和 25 毫瓦。随后使用橄榄油进行锁相放大器的相位优化。将橄榄油样品置于载玻片中，并在底部附上滤纸，以增强信号的背向散射或EPI-SRS检测效果。将橄榄油样品放置在载物台上，调节25倍物镜的焦距至样品处。使用显微镜控制软件，按照文本稿件中所述设置成像参数。然后使用锁相放大器控制软件，将时间常数设置为10微秒。接着，将激光束扫描样品，以22.5度为步长调节相位，直至SRS信号强度达到最大值。然后在激光快门关闭的情况下扫描样品，以1毫伏为步长调节偏移值，直至平均SRS信号接近零。接下来，在OPO控制软件中打开延迟管理器对话框，扫描橄榄油，并调节延迟阶段，直至橄榄油的SRS信号达到最大值。然后停止扫描，并在延迟管理器对话框中点击“添加数据”按钮，以记录当前的延迟数据。在通过成像不同化学样品获得多个拉曼位移下的延迟数据后，在延迟管理器对话框中选择五阶数据拟合，以五阶多项式函数拟合当前数据点。然后点击“用作自定义”按钮并勾选复选框，应用拟合后的数据。延迟阶段将根据拟合的延迟曲线在不同波长下自动调整。对于活体成像，将小鼠固定在稳定平台上，暴露其脊髓并浸入生理盐水中。现在将稳定平台安装在TPEF-SRS显微镜下方的五轴平台上。然后使用两个头夹固定小鼠头部，并降低固定板，为呼吸过程中胸部的运动提供足够的空间，以减轻运动伪影。接下来，调节Z轴平移平台以调整焦距，直至在10X物镜下可观察到脊髓血管的明场图像。通过调节五轴载物台的两轴平移装置，将视野中心对准脊髓背侧静脉。接着，根据明场图像调节五轴载物台的滚动角和俯仰角，使脊髓背侧表面与物镜轴线垂直。然后将10X物镜更换为25X水浸物镜，用于双光子激发荧光-受激拉曼散射（TPEF-SRS）成像。进行受激拉曼散射（SRS）成像时，按下与电动翻转器相连的开关按钮，选择物镜上方的偏振分光棱镜。进行双光子激发荧光（TPEF）成像时，按下与电动翻转器相连的开关按钮，选择物镜上方的二向色镜D2。最后，按照文本稿件中所述设置成像参数，并开始扫描样品。活体双模成像显示，小鼠脊髓中稀疏标记的YFP轴突被一层厚厚的髓鞘紧密包裹。从TPEF-SRS脊髓图像中可见，郎飞结处轴突直径减小，轴膜直接暴露于细胞外基质中。结合新型荧光和SRS成像探针，双光子激发荧光-SRS显微技术可实现多种生物分子的同步结构与功能成像，有助于深入理解复杂的生物过程。

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科研

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Bioengineering

生物工程

体内 使用双光子荧光和受激拉曼散射显微镜对生物组织进行成像

来源： Espinoza, R., et al．利用实时双色受激拉曼散射成像技术对小鼠脑组织进行组织学诊断． J. Vis. Exp. (2022)．...

双色受激拉曼散射成像小鼠脑组织

基于分子键固有振动的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术，能够实现无需标记的化学选择性活细胞成像。本文介绍了在基于飞秒钛宝石激光器和OPO激光器的标准多光子激光扫描显微镜上，实现一种互补显微技术的方法。...

在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统

本文描述了一种通过将受激拉曼散射（SRS）实验装置与激光扫描显微镜集成而实现的受激拉曼散射显微镜。该SRS显微镜基于两束飞秒（fs）激光光源，分别为钛宝石（Ti:Sa）激光器和同步的光学参量振荡器（OPO）。...

基于受激拉曼散射的非线性显微镜的实现

免疫反应性成纤维细胞在活化后会发生形态学改变，并促进细胞募集的变化。通过结合双光子成像技术与基因工程改造的成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）-cre；tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB)...

活体双色双光子成像技术用于皮肤中遗传标记报告细胞的观察

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。...

小鼠脑组织诊断的实时双色受激拉曼散射成像

基于电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）的彩虹样拉曼染料成像，是一种用于高重数基于表位的蛋白质成像的新平台。本文中，我们提供了一份实用指南，包括抗体准备、组织样本染色、SRS显微镜组装以及epr-SRS组织成像。...

使用拉曼染料进行高重组织成像

本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS...

高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。...

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

学习双光子荧光与受激拉曼散射双模态显微成像技术，对小鼠脊髓进行活体无标记成像。该方法可获取生物组织的生化与生物物理信息，用于研究神经退行性疾病及脊髓损伤中的细胞动态与相互作用。

体内生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

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