体内 使用双光子荧光和受激拉曼散射显微镜对生物组织进行成像

受激拉曼散射（SRS）显微镜允许根据特定化学键的固有振动对生物分子进行无标记成像。在该协议中，描述了集成SRS和双光子荧光显微镜的仪器设置，以可视化活小鼠脊髓中的细胞结构。

具有亚细胞分辨率和化学特异性的生物组织的体内成像是了解细胞代谢，免疫反应和组织重塑中涉及的动态过程的有力工具。结合双光子荧光和受激拉曼散射显微镜，可以从多个角度以亚细胞分辨率获取生物组织的关键生化和生物物理信息。具体而言，这种双模态显微镜可用于成像小鼠脊髓中的细胞动力学和相互作用，以研究神经退行性疾病和脊髓损伤的进展。

首先，将钥匙开关从待机位置切换到打开位置，然后等待 30 分钟让激光器预热，从而打开钛蓝宝石激光器。然后通过单击 OPO 控制面板上的开始按钮打开 OPO，并等待 20 分钟让激光预热。皮秒激光预热后，通过将斯托克斯光束的功率降低到约20毫瓦，打开斯托克斯光束的激光快门并在OPO输出端放置高速光电探测器来检测光束，从而检查斯托克斯光束的调制深度。

接下来，使用带有BNC连接器的同轴电缆将光电探测器的输出端口连接到示波器的输入端口，以监视激光脉冲。然后打开OPO控制软件中的EOM控制窗口，根据示波器上显示的脉冲强度图调整EOM功率和相位，以达到20兆赫兹的最大调制深度。在 OPO 控制软件中，打开泵浦激光快门，同时停止 Stokes 输出。

接下来，单击设置信号框以将泵浦光束的波长设置为796纳米，然后单击设置的OPO电源盒并输入20以将其功率设置为最小值以进行光学对准。接下来，将对准板P1放在偏振分束器后面约10厘米处，并将板P2放在P1后面的光路上约30厘米处。打开皮秒激光束的显微镜快门后，调整反射镜M1，将皮秒激光束中心定位在P1的通孔处。使用红外示波器观察在调整反射镜M1时P1处的光束点的位置。同样，调整反射镜M2以将皮秒激光束中心定位在P2的通孔处。使用红外示波器观察光束点在调整反射镜M2时在P2的位置。调整反射镜直到皮秒光束中心位于两个对准板的通孔处后，在显微镜控制软件中关闭皮秒光束的快门。

接下来，打开飞秒激光束的显微镜快门。调整反射镜M3，将飞秒激光束光斑中心定位在P1的通孔处，然后调整反射镜M4，将飞秒激光束光斑中心定位在P2的通孔处。调整反射镜后，直到飞秒激光束中心位于两个对准板的通孔处，关闭飞秒光束的显微镜快门。接下来，将相机放置在物镜的位置以可视化两个光束点的位置，并在相机屏幕上标记泵浦光束的位置作为参考。

然后将对准板P0放在透镜L3之前，并使用六角键调整光学反射镜，以便斯托克斯光束中心通过激光输出端口处对准板的通孔。在调整过程中，使用红外示波器确认光束点在P0的位置。接下来，取下对齐板P0并使用十六进制键调整光学反射镜二，以便斯托克斯光束的中心与相机上泵浦光束的参考标记共同定位。

继续调整反射镜，直到斯托克斯光束在P0和相机平面上与泵浦光束严格重叠。打开锁相放大器控制软件，将泵浦激光器的波长设置为796纳米，将泵浦和斯托克斯光束的功率设置为50和70毫瓦，分别对应于样品上的15和25毫瓦。然后使用橄榄油进行锁相放大器相位优化。

将橄榄油密封在载玻片中，底部附有薄纸，以增强信号回散射或EPI-SRS检测。将橄榄油样品放在载物台上，并将25X物镜的焦点调整到样品上。使用显微镜控制软件，设置文本手稿中提到的成像参数。

然后使用锁相放大器控制软件，将时间常数值设置为10微秒。接下来，扫描样品上的激光束，以22.5度的步长调整相位，直到SRS信号强度达到最大值。然后在关闭激光快门的情况下扫描样品，以1毫伏的步长调整偏移值，直到平均SRS信号接近零。

接下来，在OPO控制软件中打开延迟管理器对话框并扫描橄榄油，调整延迟阶段，直到橄榄油SRS信号达到最大值。然后停止扫描并单击延迟管理器对话框中的添加数据按钮以记录当前的延迟数据。通过对各种化学样品进行成像来获取不同拉曼位移的延迟数据后，在延迟管理器对话框中按第五顺序选择数据拟合，以拟合具有五阶多项函数的当前数据点。

然后，通过单击"用作自定义"按钮并选中复选框来应用适合的数据。延迟级根据拟合的延迟曲线在不同波长下自动调整。对于体内成像，将小鼠固定在稳定阶段，其脊髓暴露并浸入盐水中。

现在，将稳定级安装在TPEF-SRS显微镜下方的五轴载物台上。然后用两个头杆固定鼠标头，并降低固定板，以便在呼吸过程中为胸部运动提供足够的空间，从而减轻运动伪影。接下来，调整Z平移阶段以调整焦点，直到可以在10X物镜下观察到脊髓脉管系统的明场图像。

通过调整五轴阶段的两轴平移阶段，将脊髓背静脉定位在视野的中心。接下来，调整五轴载物台的滚动和俯仰角度，以根据明场图像调整垂直于物镜轴的脊髓背表面。然后用25X水浸物镜替换10X，用于TPEF-SRS成像。

对于SRS成像，通过按下连接到电动脚蹼的开关按钮，选择物镜上方的偏振分束器。对于TPEF成像，通过按下连接到电动脚蹼的开关按钮，选择物镜上方的二向色镜D2。最后，按照文本手稿中所述设置成像参数，并开始扫描样品。

小鼠脊髓中稀疏标记的YFP轴突和髓鞘的体内双模态成像显示，轴突被一层厚厚的髓鞘紧密包裹。从TPEF-SRS脊髓图像中可以看出，Ranvier的节点轴突直径减小，腋窝直接暴露于细胞外基质。结合新的荧光探针和SRS成像双光子激发荧光SRS显微镜可以实现各种生物分子的同步结构和功能成像，便于我们理解复杂的生物过程。