Name: 在Vivo功能研究的疾病相关的稀有人类变异使用果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 了解利用果蝇体内实验系统快速分析人类疾病相关错义变异对蛋白质功能的影响。该方法为罕见疾病诊断和疾病机制研究提供重要依据，比脊椎动物模型更经济高效。

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我们感谢 Jose Salazar、Julia Wang 和 Karen Schulze 博士对本文稿的审阅。我们感谢 Ning Liu 博士和 Xi Luo 博士对本文讨论的 TBX2 变异体进行的功能表征研究。未确诊疾病网络模式生物筛选中心获得了美国国立卫生研究院（NIH）共同基金（U54 NS093793）的支持。H. T. C. 还获得了美国国立卫生研究院[CNCDP-K12 和 NINDS（1K12 NS098482）]、美国神经病学学会（神经科学研究基金）、Burroughs Wellcome 基金会（医学科学家职业奖）、儿童神经病学学会和儿童神经病学基金会（PERF Elterman 基金）以及 NIH 院长早期独立奖（DP5 OD026426）的支持。M. F. W. 还获得了 Simons 基金会（SFARI 奖：368479）的支持。S. Y. 还获得了美国国立卫生研究院（R01 DC014932）、Simons 基金会（SFARI 奖：368479）、阿尔茨海默病协会（新研究者研究基金：15-364099）、Naman 家族基础研究基金以及 Caroline Wiess Law 分子医学研究基金的支持。贝勒医学院（BCM）的共聚焦显微镜研究部分由 NIH 基金 U54HD083092 支持，该基金资助智力与发育障碍研究中心（IDDRC）神经可视化核心。

作者无任何利益冲突需要披露。

利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）开展的实验研究为评估与疾病相关的人类变异体的后果提供了一个强有力的检测体系。这得益于过去一个世纪以来，果蝇研究领域的众多研究人员所积累的丰富知识和多样的遗传工具89。然而，与其他任何实验体系一样，必须认识到其存在的局限性和注意事项。
数据挖掘的相关注意事项 
尽管本实验方案的第一步是挖掘数据库以获取与目标基因相关的信息，但应仅将其作为起点。例如，尽管通过计算机预测基因变异功能可提供有价值的参考信息，但这些数据的解读始终需谨慎。在某些情况下，所有主要算法均预测某一人源变异为良性，但果蝇（Drosophila）中的功能研究却明确证实该变异具有致病性24。同样，尽管蛋白质-蛋白质相互作用、共表达以及结构建模数据均为有益的信息来源，但这些大规模组学数据集中可能存在假阳性或假阴性结果。例如，部分先前鉴定或预测的蛋白质-蛋白质相互作用可能是人为假象，或仅在特定...

罕见病患者通常要经历一段艰难的求诊过程，被称为&#34;诊断性漫漫长路"，才能获得准确的诊断1。大多数罕见病被认为具有显著的遗传起源，因此基因组/基因分析成为临床诊疗中的关键环节。除了基于染色体微阵列的候选基因 panel 测序和拷贝数变异分析外，全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）技术在过去十年中已逐渐成为极具价值的工具2,3。目前，通过 WES 和 WGS 鉴定已知致病性变异的诊断率约为 25%（在儿科病例中更高）4,5。对于临床 WES/WGS 检测后仍未能确诊的大多数病例，一个常见问题是存在大量候选基因和变异。新一代测序技术常在多个基因中识别出新发或极罕见的变异，而判断这些变异是否与疾病表型相关具有挑战性。例如，尽管基因中的无义突变或移码突变通常因无义介导的转录本降解而被认为是功能丧失（LOF）等位基因，但位于最后几个外显子中的截短突变可逃避该过程，可能表现为良性或功能获得（GOF）等位基因6。
此外，预测错义等位基因的影响是一项艰巨的任务，因为它可能导致多种不同的遗传情况，这些情况最早由赫尔曼·穆勒（Herman Muller）在20世纪30年代提出（即：无功能型、低功能型、超功能型、反作用型、新功能型或同功能型）7。目前已有多种计算机预测程序和方法被开发出来，用于基于进化保守性、氨基酸改变类型、在功能结构域中的位置、在普通人群中的等位基因频率以及其他参数，来预测错义变异的致病性8。然而，这些程序并不能全面解决变异解读这一复杂问题。有趣的是，最近一项研究表明，五种广泛使用的变异致病性预测算法（Polyphen9、SIFT10、CADD11、PROVEAN12、Mutation Taster）在约80%的情况下对致病性的判断一致8。值得注意的是，即使所有算法判断一致时，仍有高达11%的情况下会给出错误的致病性预测结果。这不仅会导致临床解读出现偏差，还可能因错误地将新发现的变异归类为良性，从而阻碍研究人员对这些变异的进一步研究。弥补当前计算机建模局限性的一种方法是提供实验数据，以展示该变异在体外、离体（例如培养细胞、类器官）或体内条件下的功能影响。
在体内开展与罕见病相关变异的功能研究具有独特优势13，已被全球多个罕见病研究计划采纳，包括美国的未确诊疾病网络（Undiagnosed Diseases Network, UDN）以及加拿大、日本、欧洲和澳大利亚的罕见病模型与机制（Rare Diseases Models &amp;#38; Mechanisms, RDMM）网络14。除了这些将模式生物（MO）研究人员整合到国家级罕见病诊断与机制研究流程中的协调性努力外，众多临床研究人员与模式生物研究人员之间的独立合作研究也促成了大量新的人类致病基因和变异的发现与功能表征82,83,84。
在未确诊疾病网络（UDN）中，一个集中的模式生物筛选中心（Model Organisms Screening Center, MOSC）接收候选基因和变异的提交材料，材料包括患者病情描述，并利用生物信息学工具和体内实验评估该变异是否可能具有致病性。在UDN的第一阶段（2015–2018年），MOSC由一个 果蝇 核心（贝勒医学院，BCM）与斑马鱼核心（俄勒冈大学）合作评估病例，通过信息学分析及多种不同的实验策略 果蝇 以及斑马鱼，该MOSC迄今已助力132名患者的诊断，鉴定了31种新综合征55，发现多个新的与人类疾病相关的基因（例如， EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720）以及已知致病基因的表型扩展（例如， CACNA1A21ACOX122).
除了在未诊断疾病网络（UDN）内的项目外，模式生物筛选中心（MOSC）的果蝇（Drosophila）核心研究人员还利用为UDN开发的一套生物信息学与遗传学策略，与孟德尔基因组学中心及其他研究项目合作，推动了多个新致病基因的发现（例如 ANKLE223、TM2D324、NRD125、OGDHL25、ATAD3A26、ARIH127、MARK328、DNMBP29）。鉴于模式生物研究在罕见病诊断中的重要意义，MOSC在UDN第二阶段（2018–2022年）进行了扩展，新增了线虫（C. elegans）核心单元和第二个斑马鱼核心单元（均位于圣路易斯华盛顿大学）。
本文描述了一项目前正在UDN MOSC中应用的体内功能研究实验方案 果蝇 核心在于利用表达人类蛋白的转基因果蝇，确定错义变异是否对目标蛋白产生功能影响。本方案旨在帮助基础科研人员与临床研究团队协作，为感兴趣基因中的候选变异提供其具有功能影响的实验证据，从而促进临床诊断。该方案在以下情境中最为适用： 果蝇 研究人员被一位临床研究者联系，该临床研究者有一位罕见病患者，其在目标基因中存在一个特定的候选变异。
该方案可分为三个部分：（1）收集信息以评估目标变异导致患者表型的可能性，以及在黑腹果蝇（Drosophila）中开展功能研究的可行性；（2）收集现有的遗传工具并建立新的工具；（3）在体内开展功能研究。第三个部分可根据目标变异功能的评估方式进一步细分为两个子部分（即拯救实验或基于过表达的策略）。需要注意的是，该方案可针对罕见单基因病研究以外的多种情境进行调整和优化（例如常见疾病、基因-环境相互作用，以及用于发现治疗靶点的药理学/遗传学筛选）。确定变异的功能性与致病性，不仅可通过提供准确的分子诊断使目标患者受益，还将对转化医学和基础科学研究产生广泛影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; UAS-人cDNA转基因品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于转基因的注射品系（&lt;em&gt;D. melanogaster&lt;/em&gt;)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>特定试剂：VK33（第3染色体）注射品系</td></tr><tr><td>用于转基因的注射品系（&lt;em&gt;D. melanogaster&lt;/em&gt;)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>特定试剂：VK37（第二染色体）注射品系</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒DNA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>克隆载体</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>特定试剂：pDONR221</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 转基因载体</td><td>Johannes Bischof 博士和 Konrad Basler 博士惠赠（Bischof 等，2013 PNAS）</td><td></td><td>特定试剂：pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;分子生物学试剂盒和试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>特定试剂：琼脂糖（分子生物学级）</td></tr><tr><td>化学感受态细胞（&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>特定试剂：DH5&amp;alpha;</td></tr><tr><td>DNA凝胶回收试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>特定试剂：PureLink Gel Extraction Kit</td></tr><tr><td>DNA 提取与纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>特定试剂：QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>高保真聚合酶</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>特定试剂：Q5 DNA聚合酶试剂盒</td></tr><tr><td>重组酶介导的克隆系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>特定试剂：Gateway BP Clonase 试剂盒</td></tr><tr><td>重组酶介导的克隆系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>特定试剂：Gateway LR Clonase II 酶试剂盒</td></tr><tr><td>定点突变试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>#200523</td><td>特定试剂：Quick Change II 突变试剂盒</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;视网膜电图仪相关设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG 分析</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>特定试剂：Axon pCLAMP 10 数据软件包</td></tr><tr><td>ERG 数据采集</td><td>LabX</td><td>#R150358</td><td>特定试剂：ISO-DAM 隔离式生物信号放大器</td></tr><tr><td>ERG 刺激器</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>特定试剂：方波刺激器</td></tr></tbody></table>

利用drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

测序技术的进步使得全基因组和全外显子组数据集在临床诊断及前沿人类遗传学研究中变得更加可及。尽管已有多种计算机算法被开发用于预测这些数据集中所发现变异的致病性，但功能研究对于确定特定基因组变异如何影响蛋白质功能至关重要，尤其是对于错义变异。在未确诊疾病网络（Undiagnosed Diseases Network, UDN）及其他罕见病研究联盟中，模式生物（model organisms, MO），包括 果蝇, 秀丽隐杆线虫斑马鱼和小鼠被广泛用于评估假定的人类致病性变异的功能。本方案描述了在模式生物筛选中心用于罕见人类变异体功能评估的一种方法 果蝇 UDN的核心。该工作流程首先从多个公共数据库收集人类和模式生物（MO）的信息，利用MARRVEL网络资源评估变异是否可能与患者的病情相关，并基于现有知识和资源设计有效的实验。接下来，构建遗传工具（例如T2A-GAL4和UAS-人cDNA品系），用于在体内评估目标变异的功能 果蝇. 这些试剂开发完成后，可开展基于拯救和过表达实验的双路径功能检测，以评估变异体功能。在拯救路径中，内源性果蝇基因被 &#34;人源化，即通过替换同源的 果蝇 参考或变异的人类转基因基因。在过表达分支中，参考型和变异型人类蛋白在多种组织中被外源性驱动表达。在这两种情况下，任何可评分的表型（如致死性、眼形态、电生理学）均可作为读出指标，而不限于特定疾病。参考等位基因与变异等位基因之间观察到的差异提示存在变异特异性效应，因而可能具有致病性。该方案可对功能已知或未知基因的潜在致病性人类变异进行快速的体内评估。

与神经发育表型相关的EBF3基因新生错义变异体的功能研究 
一名7岁男性患儿表现出包括肌张力低下、共济失调、全面性发育迟缓以及表达性语言障碍在内的神经发育表型，美国国立卫生研究院未确诊疾病项目（UDP）的临床医生和人类遗传学家在该患儿中鉴定出EBF3（早期B细胞因子3）基因的一个新生错义变异体（p.R163Q）15。该基因编码COE（Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor）家族的转录因子。此病例于2016年3月提交至UDN MOSC进行功能研究。为评估该基因是否为该病例的致病候选基因，MOSC从OMIM、ClinVar、ExAC（现已扩展至gnomAD）、Geno2MP、DGV和DECIPHER等数据库收集了人类遗传学与基因组学信息。此外，利用DIOPT工具鉴定了关键模式生物（MO）中的同源基因。随后，从各个MO数据库（如Wormbase、FlyBase、ZFIN、MGI）获取了基因表达和表型信息。针对EBF3及其他U...

本实验方案的目的是概述在Drosophila melanogaster中进行体内实验的设计与操作，以评估与人类疾病相关的稀有基因变异的功能性后果。

利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

测序技术的进步使得全基因组和全外显子组数据集在临床诊断和前沿人类研究中变得更加可及。

本方案使我们能够确定与疾病相关的人类基因错义变异是否影响蛋白质功能。即使使用最先进的算法，通过计算方法也难以实现这一目标。该技术利用体内系统黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），可快速分析人类蛋白质中的错义变异，相较于脊椎动物模型生物，此方法更快且更具成本效益。证明特定变异直接影响蛋白质功能，可直接为罕见病的诊断提供依据，并为疾病机制分析和潜在治疗策略的开发提供起点。该方案在研究与罕见病相关的变异时尤为有用，但也可应用于自闭症和癌症等更常见的疾病。在果蝇中识别出能够反映蛋白质功能的可重复表型可能具有挑战性。表型可能因基因而异，且可能较为细微。可以基于拯救实验或过表达研究，利用果蝇对人类蛋白质中的变异进行功能研究。在开始实验之前，需收集有关目标人类基因及其模式生物直系同源基因的信息。为了通过在果蝇视觉系统中过表达参考序列和变异的人源蛋白来检测变异功能，需构建转基因果蝇品系，使其在Gal4上游激活序列（UAS）系统的调控下表达目标参考或变异人源cDNA。为选择特定的Gal4品系以在特定果蝇组织中表达人源蛋白，可将3至5只来自Gal4品系的处女雌蝇与每种UAS人源cDNA转基因品系的3至5只雄蝇在单个或重复的培养瓶中进行杂交。每隔两到三天更换培养基，以尽可能获得来自同一次杂交的更多羽化个体，并在解剖显微镜下观察羽化后的果蝇，识别参考株系与变异株系之间的任何差异。如果存在可见的缺陷，应对果蝇进行成像以记录表型。为了获得可用于检测视觉系统功能缺陷的果蝇，将视紫红质1 Gal4品系的处女雌蝇与携带参考序列或变异序列UAS人源cDNA转基因的雄蝇杂交，从而在果蝇视网膜的R1至R6光感受器细胞中表达目标人源蛋白。当果蝇开始羽化后，将后代收集至新的培养瓶中，并将培养瓶放回设定为适当实验温度的培养箱中继续培养三天，以使视觉系统充分发育成熟。孵育结束后，使用适当的麻醉方法使果蝇固定，然后将每只果蝇的一侧轻轻粘附在玻璃显微镜载片上。设置好电视网膜图（ERG）记录装置后，将一根1.2毫米的玻璃毛细管放入拉针仪中，折断毛细管以获得两根尖端中空、锥形且直径小于0.5毫米的电极。用100毫摩尔的生理盐水溶液填充毛细管，注意避免产生气泡，并将玻璃毛细管套在银丝电极上。将毛细管固定到位，并在室温下使果蝇在完全黑暗环境中适应至少10分钟。适应结束后，将载有果蝇的载玻片置于记录装置上，移动携带参考电极和记录电极的显微操作器，使其靠近目标果蝇。观察电极尖端，小心地将参考电极插入果蝇胸部，穿透体壁，再将记录电极放置于复眼表面。为获得成功的视网膜电图记录，需注意对记录电极施加适当压力，使其在眼球表面形成轻微凹陷，但不得刺穿眼球。电极放置完毕后，关闭主光源3分钟，使果蝇重新适应黑暗环境。在重新适应期结束后，以每秒开闭快门一次的频率持续20秒，使用同一电极记录每种基因型在每种条件下每张载玻片至少15只果蝇的视网膜电图。当参考品系和变异品系果蝇的记录完成后，比较参考品系、变异品系及对照组的视网膜电图记录，以评估其差异。随后分析视网膜电图数据中开瞬变、去极化、关瞬变和复极化的变化情况。在此项代表性实验中，由于人类参考基因TBX2无法在功能上替代果蝇中同源的基因，导致基于挽救的策略无法实现，因此针对TBX2开展了过表达研究。当使用 eyeless Gal4 在发育中的眼睛和部分脑区过表达参考人源 TBX2 时，过表达导致约 85% 的致死率，并显著减小眼睛尺寸。相比之下，在相同实验条件下，使用相同的驱动子，变异型转基因在导致致死性方面较弱，并仅诱导出小眼表型，提示该变异影响了蛋白功能。此外，当使用视紫红质 Gal4 在感光细胞中过表达参考人源 TBX2 时，过表达会引起视网膜电图波形的显著改变。当表达该变异蛋白时，这种表型较轻，这进一步证明了所关注的变异在体内影响了蛋白质功能。需要注意的是，每个基因都是独特的，因此不存在一种能够评估所有疾病相关变异影响的单一实验。除了使用人类cDNA外，还可以通过在直系同源果蝇基因的进化保守位点引入类似的变异，来确定该变异是否具有功能后果。通过该方法，我们与未确诊疾病网络及其他研究团队合作，推动了多项人类疾病致病基因的发现研究。

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在Vivo功能研究的疾病相关的稀有人类变异使用果蝇

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在体 突触小泡的可视化 果蝇 幼虫节段性轴突

本文介绍了从黑腹果蝇（Drosophila）头部提取和纯化mRNA及代谢物的操作步骤。我们正在应用这些技术以更深入地理解神经元变性过程中潜在的细胞紊乱机制。这些方法可轻松进行规模调整，并适用于其他“组学”研究项目。...

转录本和代谢物的纯化 果蝇 头部

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体内 建模：利用Danio rerio模拟人类疾病基因组

我们提出了一种用于识别影响转录因子（TF）DNA结合的非编码遗传变异的策略性方案和实验流程。本文提供了针对基因型依赖性转录因子DNA结合的电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）的详细实验方案。...

利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）筛选功能性非编码遗传变异

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇...

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

本文介绍了一种高效访问和分析多种人类及模式生物数据库的实验方案。该方案演示了如何利用MARRVEL工具分析通过下一代测序技术鉴定出的候选致病性变异位点。...

导航MARRVEL：一种整合人类基因组学与模式生物遗传学信息的基于网络的工具

我们介绍一种利用正向遗传学方法筛选表现出神经退行性变的黑腹果蝇（Drosophila...

体内正向遗传筛选以鉴定新型神经保护基因 黑腹果蝇

的 果蝇 眼睛系统是研究多种生物过程（尤其是人类神经退行性疾病）的有用工具。然而，人工量化粗糙的眼表型可能存在偏差且不可靠。本文介绍一种利用ilastik和Flynotyper无偏量化眼表型的方法。...

量化 Drosophila melanogaster 眼部表型：整合 ilastik 与 Flynotyper 的计算方法

本方案描述了如何在克隆水平上评估大量基因的表达。单细胞逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）可对数百个样本和基因产生高度可靠且灵敏度强的结果。...

利用多重RT-qPCR进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

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利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

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