利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

本方案使我们能够确定与疾病相关的人类基因错义变异是否影响蛋白质功能。即使使用最先进的算法，通过计算方法也难以实现这一目标。该技术利用体内系统黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），可快速分析人类蛋白质中的错义变异，相较于脊椎动物模型生物，此方法更快且更具成本效益。

证明特定变异直接影响蛋白质功能，可直接为罕见病的诊断提供依据，并为疾病机制分析和潜在治疗策略的开发提供起点。该方案在研究与罕见病相关的变异时尤为有用，但也可应用于自闭症和癌症等更常见的疾病。在果蝇中识别出能够反映蛋白质功能的可重复表型可能具有挑战性。

表型可能因基因而异，且可能较为细微。可以基于拯救实验或过表达研究，利用果蝇对人类蛋白质中的变异进行功能研究。在开始实验之前，需收集有关目标人类基因及其模式生物直系同源基因的信息。

为了通过在果蝇视觉系统中过表达参考序列和变异的人源蛋白来检测变异功能，需构建转基因果蝇品系，使其在Gal4上游激活序列（UAS）系统的调控下表达目标参考或变异人源cDNA。为选择特定的Gal4品系以在特定果蝇组织中表达人源蛋白，可将3至5只来自Gal4品系的处女雌蝇与每种UAS人源cDNA转基因品系的3至5只雄蝇在单个或重复的培养瓶中进行杂交。每隔两到三天更换培养基，以尽可能获得来自同一次杂交的更多羽化个体，并在解剖显微镜下观察羽化后的果蝇，识别参考株系与变异株系之间的任何差异。

如果存在可见的缺陷，应对果蝇进行成像以记录表型。为了获得可用于检测视觉系统功能缺陷的果蝇，将视紫红质1 Gal4品系的处女雌蝇与携带参考序列或变异序列UAS人源cDNA转基因的雄蝇杂交，从而在果蝇视网膜的R1至R6光感受器细胞中表达目标人源蛋白。当果蝇开始羽化后，将后代收集至新的培养瓶中，并将培养瓶放回设定为适当实验温度的培养箱中继续培养三天，以使视觉系统充分发育成熟。

孵育结束后，使用适当的麻醉方法使果蝇固定，然后将每只果蝇的一侧轻轻粘附在玻璃显微镜载片上。设置好电视网膜图（ERG）记录装置后，将一根1.2毫米的玻璃毛细管放入拉针仪中，折断毛细管以获得两根尖端中空、锥形且直径小于0.5毫米的电极。用100毫摩尔的生理盐水溶液填充毛细管，注意避免产生气泡，并将玻璃毛细管套在银丝电极上。

将毛细管固定到位，并在室温下使果蝇在完全黑暗环境中适应至少10分钟。适应结束后，将载有果蝇的载玻片置于记录装置上，移动携带参考电极和记录电极的显微操作器，使其靠近目标果蝇。观察电极尖端，小心地将参考电极插入果蝇胸部，穿透体壁，再将记录电极放置于复眼表面。

为获得成功的视网膜电图记录，需注意对记录电极施加适当压力，使其在眼球表面形成轻微凹陷，但不得刺穿眼球。电极放置完毕后，关闭主光源3分钟，使果蝇重新适应黑暗环境。在重新适应期结束后，以每秒开闭快门一次的频率持续20秒，使用同一电极记录每种基因型在每种条件下每张载玻片至少15只果蝇的视网膜电图。

当参考品系和变异品系果蝇的记录完成后，比较参考品系、变异品系及对照组的视网膜电图记录，以评估其差异。随后分析视网膜电图数据中开瞬变、去极化、关瞬变和复极化的变化情况。在此项代表性实验中，由于人类参考基因TBX2无法在功能上替代果蝇中同源的基因，导致基于挽救的策略无法实现，因此针对TBX2开展了过表达研究。

当使用 eyeless Gal4 在发育中的眼睛和部分脑区过表达参考人源 TBX2 时，过表达导致约 85% 的致死率，并显著减小眼睛尺寸。相比之下，在相同实验条件下，使用相同的驱动子，变异型转基因在导致致死性方面较弱，并仅诱导出小眼表型，提示该变异影响了蛋白功能。此外，当使用视紫红质 Gal4 在感光细胞中过表达参考人源 TBX2 时，过表达会引起视网膜电图波形的显著改变。

当表达该变异蛋白时，这种表型较轻，这进一步证明了所关注的变异在体内影响了蛋白质功能。需要注意的是，每个基因都是独特的，因此不存在一种能够评估所有疾病相关变异影响的单一实验。除了使用人类cDNA外，还可以通过在直系同源果蝇基因的进化保守位点引入类似的变异，来确定该变异是否具有功能后果。

通过该方法，我们与未确诊疾病网络及其他研究团队合作，推动了多项人类疾病致病基因的发现研究。