在体内病态的人类基因组建模使用斑马鱼
August 24th, 2013
在这里，我们提出了一个系统的方法来开发有关生理，敏感，特异在体内分析用于解释人类病理学变化。瞬态的遗传操作，通过微量注射野生型和突变型人mRNA和吗啉代（MO）的反义寡核苷酸利用显影斑马鱼胚胎的快速检测致病突变，特别是，但不完全是，在人类发育障碍的上下文中的易处理性。
- [旁白] 以下实验的总体目标是使用斑马鱼体内互补来测定临床上显着的非同义变化的致病性。这是通过首先生成突变的人类 mRNA 来概括人类遗传病变来实现的。接下来，将人类野生型和突变型mRNA和吗啉注射到斑马鱼胚胎中，分别翻译成功能蛋白或用于阻断翻译。然后，对胚胎进行表型分析，以评估突变蛋白对发育的影响。获得的结果表明突变对人类蛋白质序列的有害影响，可以根据突变人 mRNA 的拯救能力得到证实。
- 与小鼠模型等现有方法相比，该技术的主要优点是可以在中高通量水平上更快地测定潜在的破坏性等位基因，并且可以评估单个基因内的等位基因系列，以更好地了解细胞水平上的定向效应，例如功能丧失或功能获得。
- [旁白] 首先，确定感兴趣的人类基因是否有斑马鱼直系同源物，如果有，有多少拷贝。我们建议将人类蛋白质与斑马鱼基因组进行相互 BLAST，然后对斑马鱼进行针对人类基因组的 BLAST。真正的直系同源物在每种情况下都是最好的命中。使用人开放阅读框获取或生成长度小于 6 千碱基的所需基因以及 5' SP6 转录位点和 3' polyA 信号的构建体。接下来，设计一种吗啉来阻断目标斑马鱼基因的剪接或翻译。使用 zfin.org 确定斑马鱼直系同源物是否在与表型读数相关的时空上下文中表达。或者，使用来自整个斑马鱼胚胎的 cDNA 或原位杂交进行 RT-PCR。要进行定点诱变，首先设计长度为25至45个碱基的诱变引物，中心具有所需的突变，该突变将与质粒的相反链退火。底漆熔化温度应大于或等于78摄氏度。用高保真聚合酶组装诱变反应，并使用此处所示的程序进行循环。PCR反应完成后，每次反应加入1微升DpnI限制性核酸内切酶，以去除坝甲基化模板。在37摄氏度下孵育两个小时。根据标准方案将两微升诱变反应转化为20微升感受态细胞。一旦从过夜培养物中确认感兴趣的突变和整个ORF的序列，将pCS2 +模板线性化并生成加帽mRNA。在确定mRNA浓度并通过凝胶电泳验证其完整性后，将样品储存在负80摄氏度的三个或更多等分试样中，直到准备使用。对于变异功能丧失实验，从天然斑马鱼交配中获取胚胎，并将其在胚胎水中保持在 28 摄氏度，放入 6 或 10 厘米的培养皿中。通过每剂将至少三种不同浓度的 1 至 100 纳克注射到 50 至 100 个斑马鱼胚胎中来进行吗啉剂量反应曲线。有效的吗啉应该引起一批受影响胚胎比例的剂量依赖性增加。在进行定量或定性分析时，如果在受精后 24 小时或更晚对胚胎进行评分，请在受精后 24 小时用苯硫脲处理胚胎，以减少黑色素细胞的形成。对于剪接阻断吗啉，通过在表型评分时间点从整个胚胎裂解物中提取总 RNA 来测试吗啉缺乏症。生成 cDNA 并使用吗啉靶位点两侧的引物对靶基因进行 RT-PCR。为了验证翻译阻断吗啉或TBMO的抑制效率，如果有与斑马鱼蛋白交叉反应的抗体，收获整个胚胎蛋白裂解物，并进行免疫印迹以比较靶向蛋白与对照蛋白的水平。如果没有抗体，则将野生型 mRNA 与 TBMO 共注射，以表明它挽救了表型，或证明如前所述的剂量依赖性。如果观察到定性表型，则选择影响 50% 至 75% 胚胎的吗啉剂量。对于定量表型，选择表型测量与野生型显着不同的剂量。接下来，用含有吗啉测定剂量和人野生型mRNA剂量曲线的混合物注射新批次的胚胎。然后，对注射批次进行掩蔽评分，以确定与单独使用 MO 相比具有最显着拯救的野生型 mRNA 剂量。这将是 mRNA 的测定剂量。用吗啉和突变人mRNA的测定剂量注射新批次的胚胎。在适当的阶段对胚胎进行表型分析，并使用卡方或 t 检验，将结果与野生型人 mRNA 的抢救进行比较。如果吗啉注射没有观察到功能表型丧失，或者如果突变mRNA产生的表型与单独的MO没有显着差异，则将野生型人mRNA的剂量曲线注射到胚胎批次中。进行表型评分并确定与未注射的对照相比，死亡和/或受影响胚胎数量没有统计学意义的最高剂量。这是测定剂量。注射突变人mRNA的测定剂量，对胚胎进行表型分析，并将结果与注射野生型人mRNA的测定剂量或测定吗啉浓度的评分进行比较。如果结果与吗啉没有区别，则用野生型 mRNA 滴定突变 mRNA，并与人类野生型和突变型 mRNA 注射进行比较。突变体加野生型mRNA注射批次表型改善表明显性阴性。没有改善表明功能获得。最后，将斑马鱼体内致病性数据与其他证据相结合，将其与谱系、对照群体频率数据和基于体外细胞的蛋白质研究中的遗传数据进行比较。此处显示的是斑马鱼胚胎中模拟的人类 MKS1 突变的定量和定性评估。根据严重程度，表型分为 3 组：具有 I 类表型的吗啉注射胚胎具有总体正常的形态，但与对照注射胚胎相比，卵黄上胚胎组织过多，情况较短。II 类变形体变薄、短小、头部和尾部结构发育不良，此外，缺乏体节定义和对称性。III 类胚胎严重延迟，体节发育不良且畸形，脊索起伏，通常无法存活超过 10=体节阶段。人和KS1 mRNA的共注射挽救了这些缺陷中的每一个，证明了表型对MKS1抑制的特异性。通过测量在 11 体节阶段用 krox20、pax2 和 myoD 核糖探针染色的胚胎中从第一个可观的体节到最后一个可识别体节的距离来量化表型。这里看到的是人类颅面畸形的斑马鱼模型。对照和突变mRNA注射胚胎在受精后5天用阿尔新蓝染色。突变胚胎的头部明显变小且畸形，软骨颅面骨骼普遍紊乱，包括张开的鳃弓和缺失或畸形的结构。受精后五天，注射大头畸形体的胚胎显示出头部变宽，如眼睛之间的空间所示。在这个受精后两天血管完整性降低的例子中，变形体表现出节间血管和其他血管结构的发芽受损。未注射野生型胚胎的原位杂交显示左侧板中胚层中的产卵表达，这是正确心脏环的对照。Ccdc39胚胎显示双侧或在大多数情况下检测不到的产卵表达。此处显示的是 Ift80 变形体的示例，该变形体会出现大肾囊肿、心包水肿和卷曲的尾巴。为了可视化肾小球滤过减少，将罗丹明葡聚糖注射到心脏中，并在 24 小时后观察荧光。对照胚胎中没有荧光，它分散在整个血管系统中，并且几乎完全被肾脏排出。Ift80胚胎显示持续的荧光葡聚糖信号，表明肾小球滤过减少。在这种肌营养不良症模型中，野生型注射胚胎显示出横跨相邻肌中隔体节的正常慢速肌纤维，这是通过使用抗慢速肌球蛋白抗体进行免疫染色确定的。突变体注射的胚胎显示一个或多个体节的肌纤维从肌中隔部分或完全脱离。此处显示的是受精后 30 小时未注射的对照和 Kif7 吗型体的实时侧视图。从体节角的比较可以看出，变形体表现出形状异常的体节，这归因于斑马鱼肌节中的异位刺猬信号传导。
- 观看此视频后，您应该对如何使用斑马鱼作为生物体模型来开发具有生理相关性、灵敏性和特异性的体内测定法，以解释人类病理学变异。
概览
本研究提出了一种系统方法，用于开发体内检测方法来评估人类基因中的致病突变，使用斑马鱼胚胎。通过操纵人类mRNA和吗啡寡核苷酸，研究人员可以评估遗传变异对发育的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 发育生物学
背景
- 致病突变可能显著影响人类发育。
- 斑马鱼作为研究遗传功能的模型生物。
- 现有方法，如小鼠模型，对于高通量分析来说较慢且效率较低。
- 了解突变的影响可以帮助开发遗传疾病的治疗方法。
研究目的
- 开发一种快速评估非同义突变致病性的检测方法。
- 利用斑马鱼作为高通量遗传分析的模型。
- 评估人类遗传变异对发育的功能影响。
使用的方法
- 向斑马鱼胚胎注射野生型和突变的人类mRNA。
- 使用吗啡寡核苷酸来阻断目标基因的翻译。
- 对胚胎进行表型分析以评估突变的发育影响。
- 进行统计分析以比较突变和野生型mRNA注射之间的表型结果。
主要结果
- 证明了能够快速检测斑马鱼中遗传突变的效果。
- 通过表型分析确认了突变的有害影响。
- 显示该技术允许评估单个基因内的等位基因系列。
- 为未来关于人类发育障碍的研究提供了框架。
结论
- 斑马鱼模型对于高通量遗传分析是有效的。
- 该方法可以增强我们对人类遗传疾病的理解。
- 未来的应用可能会导致遗传性疾病的改进治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
In vivo complementation in zebrafish enables rapid, physiologically relevant assessment of human genetic variants, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach increases predictive confidence for pathogenicity, facilitating risk-adjusted triage of genetic targets and allelic series in the biopharma pipeline. Its scalability and throughput offer strategic value for portfolio prioritization and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of human gene variants in a conserved vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing loss-of-function, gain-of-function, and dominant negative effects.
- Facilitates rapid assessment of allelic series to clarify target biology and disease relevance.
- Provides physiologically relevant evidence for pathogenicity, informing target selection.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative phenotypic assays for downstream compound screening.
- Standardizes phenotypic readouts for reproducibility and cross-study comparison.
- Enables medium- to high-throughput evaluation of genetic variants and rescue experiments.
- Supports assay scalability and platform reuse across multiple disease phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease models with human genetic variation for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by modeling pediatric and adult-onset disorders.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement decisions and reduce late-stage attrition.
- Enables integration of in vivo data with genetic, population, and in vitro evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish-based method bridges early discovery and preclinical research by providing a scalable, quantitative platform for functional genomics and target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of human gene variants.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative phenotypic assays for variant and rescue analysis.
- Analytics: Generates measurable outputs for statistical comparison of variant effects and rescue thresholds.
- Translational Research: Models disease-relevant phenotypes for biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, adaptable platform for diverse genetic targets and phenotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in variant interpretation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo assays for genetic analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling rapid, risk-adjusted prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and triage of genetic targets across therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish genetics, microinjection, and phenotypic analysis.
- Needs access to molecular biology infrastructure for mRNA synthesis and morpholino design.
- Demands cross-team standardization of phenotypic scoring and statistical analysis.
- Adaptation across disease models may require phenotype-specific assay development.
- Limitations include dependency on conserved gene function and availability of orthologs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Bioinformatics and Expressions Analysis in the Developing Zebrafish Embryo
2:27
Site-directed Mutagenesis and in vitro mRNA Transcription
3:54
In vivo Assay of Variant Loss of Function
6:40
In vivo Assay of Variant Dominant Negative or Gain of Function Effects
8:11
Representative MO Knockdown and Rescue Results
12:06
Conclusion
