基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

我们专注于开发高性能CTC分离和分析方法，通过液体活检推进精准肿瘤学。目前商用CTC隔离平台的吞吐量和效率都较低。它们也与下游分析平台不兼容，这限制了生物信息的恢复。

本研究采用微流控CTC隔离平台，大幅提升检测率。我们还应用了稀有细胞单细胞测序芯片，进行更深入的液体活检分析。首先，将25微升洗涤并重新悬浮的链亲亲和素修饰磁珠移液器移入装有一微克生物素化EpCAM抗体的管子中。

在室温下培养混合物，旋转速度为每分钟20转，持续40分钟，以制备免疫磁珠。使用磁性架，将珠子与上清液分离。去除上清液后，将微珠重新置于25微升的隔离缓冲液中。

移液器在1到2秒内吸取20微升磁珠悬浮液，确保无气泡进入。立即将芯片垂直放置在磁铁上，让珠子静置五分钟，不受干扰。将四毫升血样收集到注射器中，确保气泡被清除。

用液体封住芯片的进出口以消除气泡，然后将样品的进出口管插入芯片内。使用注射器泵，以每小时1.5毫升的流量注入样品。装填样品后，以每小时0.2毫升流量注入60微升DPBS到氢细胞芯片中，以冲洗未结合的细胞。

取下磁铁，手动注射1.5毫升5%BSA以清洗芯片并释放捕获的肿瘤细胞。准备10%的MPTS乙醇溶液。立即将20微升溶液注入氢钾芯片，并在室温下培养一小时。

用无水乙醇冲洗一次HB芯片，然后在100摄氏度下干燥一小时。接着，以0.5毫克每毫升浓度的乙醇制备GMBS溶液。冷却至37摄氏度后，引入GMBS溶液并孵育。

用双倍蒸馏水冲洗HB芯片两次，然后用DPBS冲洗两次。立即将每毫升15微克的链亲和素加入HB芯片，并在室温下孵育一小时或在四摄氏度下过夜。孵育后，用DPBS生理盐水冲洗HB芯片两次。

现在将0.2%BSA和20微克每毫升生物素化CD45抗体加入DPBS中，准备CD45抗体缓冲液，并调整至最终体积。将20微升CD45抗体缓冲液注入HB芯片，以检测白细胞的负向选择。在室温下孵化一小时后，用DPBS冲洗芯片。

在HB芯片中加入含有3%BSA和0.05%Tween 20的阻断溶液。将准备好的样本吸入注射器中，确保没有气泡。然后用液体封住芯片的进出口，并将进出口管连接到芯片上。

使用注射器泵，以每小时0.6毫升的流量注入样品。从芯片出口收集纯化的肿瘤细胞进行计数和单细胞测序。移液器将200微升0.5%F-68溶液在DPBS中制备至芯片入口。

手持芯片进行水浴超声波。当气泡在微孔区域可见时，继续超声波30秒以去除双孔孔中的气泡。接着，将200微升肿瘤细胞悬浮液注入含有6万个双孔的芯片中。

轻轻地用移液器上下移液器两次。然后再次放入去色摇罐上，浸泡五分钟，重新休眠未捕获的细胞，让它们重新沉淀。现在通过入口加入200微升DPBS和0.5%F-68溶液，并从出口吸入。

重新悬挂带条形珠悬挂后，立即向芯片入口注入200微升悬挂液，并以每分钟10转的速度震动20秒。轻轻吸液器吸珠两遍后再放回摇床。现在将条形珠悬浮液从出口取出，然后移液器注入200微升20X Tris-EDTA和50毫莫拉二硫糖醇溶液。

从出口抽出液体。为了细胞裂解和MRNA捕获，缓慢向芯片入口注入200微升细胞裂解缓冲液。立即加入200微升矿物油以封闭双井。

清除从碎屑出口流入废水储的溶液。然后将木屑横放，置于室温下静置五分钟。缓慢地向入口中加入200微升6X盐水柠檬酸钠溶液。

去除废液，并从芯片出口吸入剩余溶液。慢慢加入200微升6X盐水柠檬酸钠来填充芯片。将磁铁放在芯片表面附近，缓慢地从入口移动到出口，收集带条形码的珠子。

快速抽取溶液和珠子，放入含有6倍盐水柠檬酸钠的离心管中。用200微升6X盐酸钠清洗条形微粒三次，然后用逆转录缓冲液清洗一次。在磁场下观察到免疫磁珠分布均匀，磁性去除后残留珠子极少，确认成功释放。

CTC分离芯片高效捕获了1毫升和10毫升样本中的肿瘤细胞。添加纯化芯片进一步提升了肿瘤细胞的纯度。在外周血样本中，LNCaP细胞含量极低，CTC分选系统保持了高捕获效率和高纯度。

单单元条码芯片实现了85.6%单元和95.7%条码珠占用率，配对率达到81.9%。增加加载单元数量提升了微井占用率，同时不降低捕获效率。集成的CTC分离和单细胞测序工作流程产生了高度纯度的肿瘤细胞，并准确保留了原始肿瘤细胞比例。TSNE分析明确将PC3、LNCaP和Jurkat细胞分为三个簇，每个簇具有独特的标记表达。

通过TRBC1、IGLL1、CD1E和CD3D的强表达，通过通路富集确认了Jurkat细胞簇的激活。PC3和LNCaP簇通过基因表达差异区分，其中PC3表现出高微量精清蛋白表达，LNCaP表达NEDD4。