Name: 基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术。该方法利用免疫磁珠捕获CTC，实现85.6%的细胞占据率和81.9%的配对率，为精准肿瘤学研究提供高效液体活检方案。

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本研究由国家自然科学基金（项目编号：82227801）资助。

方法1：基于微流控的循环肿瘤细胞分离
<ol>
	<li>鲱鱼骨芯片（HB芯片）的制备
	<ol>
		<li>主模具制备
		<ol>
			<li>准备一块洁净的硅片，在135 °C下烘烤过夜以去除水分。冷却至室温后，使用氧气等离子体清洗仪在150&#8239;W 对应 1&#8239;分钟以活化表面。</li>
			<li>使用 SU-8 光刻胶在芯片上图形化第一层，形成支撑柱阵列（28 列 × 7 行，沿流动方向编号为 #1 至 #28）。将匀胶机设置为依次以 500 rpm 转速运行 10 s，2350 rpm 转速运行 55 s，再以 500 rpm 转速运行 10 s。确保该层高度为 50 µm。</li>
			<li>第一层在 65 °C 下软烘 1 分钟&#8239;分钟，随后 95 °C 20 秒&#8239;分钟以蒸发溶剂。冷却至室温。</li>
			<li>使用具有相应支撑柱设计的光掩模曝光第一层。设定曝光剂量为130&#8239;mJ/cm2.</li>
			<li>在65 °C下进行曝光后烘烤1分钟&#8239;分钟，随后 95 °C 6&#8239;最小</li>
			<li>冷却后，将SU-8显影液涂布于晶圆表面，以去除未交联的光刻胶，获得底层结构。静置显影30秒，随后用去离子水冲洗。</li>
			<li>使用与步骤1.1.1.2相同的旋涂参数，在第一层之上旋涂第二层SU-8。将第二层图形化，形成与微通道壁呈45°角的鱼骨结构，沟槽宽度为100 µm，节距为200 µm，每个周期包含六条脊线。确保该层高度也为50 µm。 
			注意：已提供示意图，展示了微结构特征（包括支撑柱阵列和人字形沟槽）的所有相关尺寸。 补充图1.</li>
			<li>第一层在 65 °C 下软烘 1 分钟&#8239;分钟，随后 95 °C 持续 20&#8239;min 以蒸发溶剂。冷却至室温。</li>
			<li>使用具有人字形设计的光掩模曝光第二层。设定曝光剂量为130&#8239;mJ/cm2.</li>
			<li>在65 °C下进行曝光后烘烤1分钟&#8239;分钟，随后 95 °C 6&#8239;最小</li>
			<li>冷却后，使用SU-8显影剂去除未交联区域，显现出完整的双层微结构。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PDMS 复制品制备
		<ol>
			<li>按10:1的质量比将预聚物与交联剂混合，配制PDMS混合物。准备10-15&#8239;单个芯片所需的混合液体积为 mL。</li>
			<li>将混合物倒入主模具中，并通过脱气去除滞留的气泡。将模具置于95 °C烘箱中加热30分钟，使PDMS固化。</li>
			<li>将固化后的PDMS复制品从模具中取出。使用1&#8239;直径为毫米的PDMS打孔器。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>HB芯片组装
		<ol>
			<li>将氧气等离子体清洗仪的功率设置为150 W，处理时间为3分钟。将PDMS复制件和已预键合的PDMS层置于洁净的玻璃载片上，共同进行表面活化处理。 
			注意：由于PDMS聚合物链中含有丰富的Si-O键，等离子体活化可实现PDMS与玻璃、硅等基底之间的共价键合，从而促进芯片的密封。</li>
			<li>将处理后的PDMS结构对齐并牢固键合。确认支撑柱阵列和人字形结构已与玻璃基底完全整合，以完成人字形芯片（HB-chip）的制备。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫磁珠（IMBs）的制备
	<ol>
		<li>将25 µL洗涤并重悬的链霉亲和素修饰磁珠（SA-MBs）（1 µm）（≈4 × 10⁷）于8 每毫升珠子加入1 µg生物素化EpCAM（上皮细胞黏附分子）抗体，室温下以20 rpm转速旋转孵育40分钟，制备免疫磁珠（IMBs）。</li>
		<li>在磁力架上进行磁性分离后，弃去上清液，将磁珠重悬于25 µL分离缓冲液（1% BSA，2 mM EDTA，D-PBS）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离芯片操作
	<ol>
		<li>在1-2秒内用移液器吸取20 µL磁珠悬液，确保不引入气泡。</li>
		<li>立即将芯片垂直放置于磁铁上，静置5分钟以使磁珠沉降，期间避免扰动。</li>
		<li>采集血液样本（外周血或实验用白细胞富集样本），立即吸取4 mL至注射器中，并确保排除气泡。用液体密封芯片的入口和出口，以去除空气泡。将样本的进样管和出样管插入芯片中。 
		注意：处理生物样本时，应确保采取基本的个人防护措施。</li>
		<li>使用注射泵以1.5 mL/h的流速注入样品。</li>
		<li>样品加载后，以0.2 mL/h的流速向HB芯片注入60 µL的D-PBS，以洗去未结合的细胞。</li>
		<li>移除磁铁，手动注入1.5 mL BSA（5% w/v，溶于D-PBS）以洗涤芯片，并从HB芯片上释放捕获的肿瘤细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 方法2：基于微流控的循环肿瘤细胞纯化
<ol>
	<li>HB芯片修饰
	<ol>
		<li>在乙醇中配制体积分数（v/v）为10%的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷（MPTS）溶液。立即向HB芯片中加入20 µL MPTS溶液，在室温下孵育1小时。</li>
		<li>用无水乙醇冲洗一次，然后在100 °C下干燥1小时。</li>
		<li>在乙醇中配制浓度为0.5 mg/mL的N-γ-马来酰亚胺丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS）溶液。将芯片冷却至37 °C，加入GMBS溶液，在室温下孵育30分钟。 
		注意：使用MPTS和GMBS时，务必佩戴手套、实验服和口罩。这些试剂具有毒性和黏膜刺激性，应在通风良好的环境中小心操作。</li>
		<li>用ddH2O冲洗两次，再用D-PBS冲洗两次。</li>
		<li>立即加入15 μg/mL链霉亲和素（SA），在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜孵育。</li>
		<li>用D-PBS冲洗两次。</li>
		<li>配制CD45抗体缓冲液：将0.2%（w/v）BSA和20 μg/mL生物素化CD45抗体用D-PBS稀释至所需体积。</li>
		<li>向HB芯片中注入20 μL CD45抗体缓冲液，用于白细胞的阴性筛选。在室温下孵育1小时，然后用D-PBS冲洗。</li>
		<li>加入含3%（w/v）BSA和0.05%（w/v）Tween-20的封闭溶液，在室温下孵育1小时。上样前用D-PBS冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品加载
	<ol>
		<li>用注射器吸取样品，确保排除气泡。用液体密封芯片的入口和出口以消除气泡。将样品进样管和出样管插入芯片中。</li>
		<li>通过注射泵注入样品，并将流速设定为0.6 mL/h。</li>
		<li>从出口收集纯化的肿瘤细胞，用于计数和单细胞测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 方法三：基于微孔的单细胞条形码标记与测序技术
<ol>
	<li>试剂和材料的准备
	<ol>
		<li>芯片预处理
		<ol>
			<li>向芯片入口加入 200 µL 的 1x D-PBS 和 0.5% F-68 溶液。</li>
			<li>手持芯片进行水浴超声。当整个微孔区域均可见气泡时，继续超声 30 秒，以去除双孔中的气泡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>条形码磁珠的制备
		<ol>
			<li>充分混匀条形码磁珠的储存液，转移 200 µL 至离心管中。施加磁力分离直至溶液澄清，弃去上清液。</li>
			<li>用 500 µL 的 TE-TW（10 mM Tris-HCl pH = 8.0，1 mM EDTA，0.01% Tween-20）洗涤条形码磁珠两次。</li>
			<li>用 200 µL 的 20x TE（10 mM Tris-HCl pH = 7.5，1 mM EDTA）和 50 mM DTT 溶液洗涤并重悬条形码磁珠，然后置于冰上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>单细胞悬液的制备
		<ol>
			<li>将纯化的肿瘤细胞转移至 1.5 mL 离心管中，在室温下以 400 × g 离心 3 分钟。用 1 mL 的 1x D-PBS 洗涤并重悬细胞沉淀。</li>
			<li>进行细胞计数，并据此制备单细胞悬液。样品上样体积应为 200 µL，总细胞数为 80,000 个（400 个细胞/µL）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备细胞裂解缓冲液，包含 1x 柠檬酸钠盐水（SSC）、0.5 M LiCl、0.6% Triton X-100、10 mM EDTA、5 mM DTT 和 1 U/µL RNase 抑制剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微流控芯片操作
	<ol>
		<li>细胞捕获
		<ol>
			<li>将 200 µL 肿瘤细胞悬液注入芯片（60000 个双孔），然后在脱色摇床上以 10 rpm 振荡 5 分钟，使细胞依靠重力沉降至捕获孔中。</li>
			<li>轻柔地将芯片内的细胞悬液上下吹打两次。然后将芯片置于脱色摇床上以 10 rpm 振荡 5 分钟，使未被捕获的细胞重新悬浮并再次沉降。</li>
			<li>通过入口加入 200 µL 的 1x D-PBS 和 0.5% F-68 溶液，并从出口吸出液体。重复两次，共对芯片洗涤三次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>条形码磁珠捕获
		<ol>
			<li>重悬条形码磁珠悬液，立即通过入口注入 200 µL 至芯片中。以 10 rpm 振荡 20 秒。</li>
			<li>轻柔地将磁珠悬液上下吹打两次，然后以 10 rpm 振荡 20 秒。重复此步骤一次。</li>
			<li>从出口抽出条形码磁珠悬液，加入 200 µL 的 20x TE（pH = 7.5）和 50 mM DTT 溶液，再从出口吸出液体。重复此步骤两次，共洗涤三次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞裂解和 mRNA 捕获
		<ol>
			<li>通过入口缓慢加入 200 µL 细胞裂解缓冲液。立即随后缓慢加入 200 µL 矿物油以密封双孔。 
			注：必须立即密封，以防止污染。</li>
			<li>将从芯片出口流出的溶液移至废液储液池。将芯片水平放置，在室温下静置 5 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>条形码磁珠回收
		<ol>
			<li>裂解后，通过入口缓慢加入 200 µL 的 6x SSC，移除废液，并从芯片出口吸出剩余溶液。</li>
			<li>缓慢加入 200 µL 的 6x SSC 以充满芯片。将磁铁靠近芯片表面，并缓慢从入口移动至出口，以收集捕获孔中的条形码磁珠。然后迅速将溶液及条形码磁珠从芯片中吸出，转移至预先装有 6x SSC 的离心管中。</li>
			<li>用 200 µL 的 6x SSC 洗涤三次，随后用 1x RT 缓冲液（见材料表）洗涤一次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录（RT）、外切酶 I 处理和 PCR
	<ol>
		<li>逆转录（RT）
		<ol>
			<li>将条形码磁珠重悬于 100 µL 逆转录反应体系中，反应体系包含 1× RT 缓冲液、1 mM GTP、1 mM dNTP、5% PEG 8000、2.5 µM 模板转换寡核苷酸（见材料表）、1 U/µL RNase 抑制剂和 10 U/µL 逆转录酶。在 42 °C 下孵育 120 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>外切酶处理
		<ol>
			<li>逆转录完成后，依次用 200 µL 的 1x TE-SDS（10 mM Tris-HCl pH = 8.0，1 mM EDTA，0.5% SDS）、200 µL 的 1x TE-TW 和 200 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH = 8.0）各洗涤磁珠一次。</li>
			<li>将磁珠重悬于 100 µL 外切酶反应体系中，反应体系包含 1x 外切酶 I 缓冲液和 1 U/µL 外切酶 I，在 37 °C 下孵育 45 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第二链合成
		<ol>
			<li>用 200 µL 的 1x TE-SDS 洗涤磁珠一次。将磁珠重悬于 200 µL 的 0.1 M NaOH 中，在室温下以 30 rpm 旋转孵育 5 分钟，以变性 mRNA-cDNA 杂交产物。然后用 200 µL 的 1x TE-TW 洗涤一次，再用 200 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH = 8.0）洗涤一次。</li>
			<li>将磁珠重悬于 100 µL 反应体系中，反应体系包含 1x RT 缓冲液、1 mM dNTP、5% PEG 8000、0.5 µM 第二链合成引物（见材料表）和 0.125 U/μL Klenow 片段。在 37 °C 下孵育 60 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>cDNA 扩增
		<ol>
			<li>依次用 200 µL 的 1x TE-SDS、200 µL 的 1x TE-TW 和 200 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH = 8.0）各洗涤磁珠一次。</li>
			<li>将磁珠重悬于 150 μL PCR 反应体系中，反应体系包含 1x PCR 反应混合液和 0.8 μM ISPCR 寡核苷酸（见材料表）。设置 PCR 程序如下：95 °C 预变性 3 分钟；4 个循环：98 °C 变性 20 秒，65 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 3 分钟；8 个循环：98 °C 变性 20 秒，67 °C 退火 20 秒，72 °C 延伸 3 分钟；72 °C 延伸 5 分钟。</li>
			<li>根据制造商说明书，使用 0.6x 固相可逆固定化（SPRI）磁珠对 PCR 产物进行两次纯化，并用 20.5 µL H2O 洗脱。使用基于荧光的 DNA 定量检测法测定纯化后 PCR 产物的浓度。</li>
			<li>使用含 1x PCR 反应混合液和 0.8 μM ISPCR 寡核苷酸（见材料表）的 PCR 反应体系对纯化后的 PCR 产物进行第二次扩增。设置 PCR 程序如下：98 °C 预变性 3 分钟；5 个循环：98 °C 变性 20 秒，67 °C 退火 20 秒，72 °C 延伸 3 分钟；72 °C 延伸 5 分钟。</li>
			<li>根据制造商说明书，使用 0.6x SPRI 磁珠对 PCR 产物进行两次纯化，并用 20.5 µL H2O 洗脱。使用基于荧光的 DNA 定量检测法测定纯化后 PCR 产物的浓度23。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>cDNA 文库构建
		<ol>
			<li>根据制造商说明书，使用标准 DNA 文库构建试剂盒（见材料表）构建文库。</li>
			<li>使用引物对 N70X / P5（见补充表）通过 PCR 扩增文库。设置 PCR 程序如下：72 °C 延伸 3 分钟；98 °C 预变性 30 秒；12 个循环：98 °C 变性 15 秒，58 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 3 分钟；72 °C 延伸 5 分钟。</li>
			<li>根据制造商说明书，使用 0.6x SPRI 磁珠对文库进行纯化，并用 20 µL H2O 洗脱。使用基于荧光的 DNA 定量检测法测定纯化后文库的浓度。 
			注：通常认为最终 DNA 文库浓度 ≥ 2&#8239;ng/μL 且总量 ≥ 50&#8239;ng 为可接受24。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

循环肿瘤细胞（CTCs）可作为癌症诊断、治疗指导以及肿瘤发生、进展和转移研究的重要生物标志物25。然而，现有的CTC分离方法难以同时实现高效率和高通量26。此外，CTC释放效率低常导致纯度不高和细胞损伤严重，限制了其在下游分析中的适用性27。本文提出了一种集成化的高通量CTC分选与单个CTC测序方案，包含CTC捕获、纯化和单细胞RNA测序（scRNA-seq）三个主要步骤。
这种基于微流控技术的平台具有灵活性和可扩展性。HB芯片中的平行通道数量以及条形码芯片中的捕获孔均可根据不同的样本需求进行调整，从而满足高通量的要求。在CTC捕获芯片中，磁性免疫微球（IMBs）可根据特定的癌症类型进行优化。例如，在前列腺癌患者样本中，可通过联合使用EpCAM和PSMA抗体对磁性免疫微球进行功能化修饰，以提高捕获效率。此外，仅依赖EpCAM进行捕获可能会导致经历上皮-间质转化（EMT）的间质型循环肿瘤细胞（CTCs）丢失。为解决这一问题，可引入针对热休克蛋白70（HSP-70）或细胞表面波形蛋白（CSV）的额外抗体，以捕获处于不同EMT阶段的CTCs。
由于用于循环肿瘤细胞（CTC）捕获和纯化的HB芯片基于微流控技术，实验过程中必须小心操作。在将试剂加入芯片入口之前，必须去除所有气泡，并可对入口和出口进行密封，以消除滞留的空气。此外，试剂应快速加入（1-2秒内），因为滞留的气泡可能阻碍磁性免疫微球（IMBs）和细胞的通过，显著降低捕获效率和纯度。另外，如前所述，IMBs的均匀分布对于成功捕获CTC至关重要。在加载IMBs后，必须将芯片垂直放置在磁铁上并固定至少五分钟，以防止磁场变化干扰IMBs的分布。值得注意的是，细胞加载流速应根据不同的样本类型进行优化。例如，白细胞富集样本（leukopak）中白细胞浓度和黏度较高。如果流速过快，可能会影响CTC与IMBs之间的有效相互作用，阻碍磁性捕获的累积，从而降低CTC纯度。为了评估本CTC分离与纯化平台在处理临床血液样本中的性能，我们采集了多名健康供体的外周血（PB），并向其中加入少量LNCaP细胞（约每毫升50-100个细胞）。值得注意的是，尽管该平台在外周血样本中对肿瘤细胞表现出较高的捕获效率和纯度，但其性能略低于基于PBS的细胞样本（图2D、图2E和图2G）。我们推测，这种差异是由于血液的黏度更高，并且与PBS相比含有大量红细胞和血小板所致。因此，在处理临床血液样本时，可考虑采用红细胞裂解或外周血单个核细胞（PBMC）提取等预处理步骤以提升性能。
与HB芯片类似，基于微流控的单细胞条形码芯片需要小心操作，以防止气泡形成。鉴于涉及多种试剂，部分试剂可在启动芯片操作前预先配制（表1）。在加载细胞和微珠时，需谨慎控制注射速度，以确保分布均匀，因为细胞密度较低，而带有条形码的微珠密度较高。通常，细胞悬液应在3~5秒内缓慢加入，随后在1~2秒内快速加入微珠悬液。加载细胞和微珠后，进行两次吸液和 dispense 操作，然后将芯片置于摇床上，完成累积捕获过程。此步骤对于提高捕获占有率和配对率至关重要。在细胞裂解过程中，采用油封法隔离微孔表面，防止孔间交叉污染。值得注意的是，裂解后应立即加入矿物油，不得延迟。裂解后，通过将磁铁从入口缓慢移至出口来回收条形码微珠，以确保较高的微珠回收率。如有必要，可重复此步骤多次。最后，收集至离心管中的磁珠依次进行逆转录（RT）、第二链合成、PCR扩增及文库构建，随后进行高通量测序（NGS）。
这种集成的微流控平台在临床应用方面具有重要意义。通过提高循环肿瘤细胞（CTC）分离的效率和通量，该平台能够在肿瘤负荷较低的阶段增强CTC的检出率，从而建立将CTC数量与肿瘤分期相关联的分类模型。这一进展为癌症的诊断、治疗监测、预后评估以及复发预测提供了新途径。此外，对单个CTC进行转录组学分析，可识别出关键的分子特征，包括重要的基因通路、相互作用网络以及生物标志物基因。该分析有助于揭示驱动早期癌症转移的关键因素，并阐明转移性病灶形成的分子机制，为复发性或转移性癌症患者提供潜在的治疗靶点。同时，该平台具有高度可扩展性，可根据特定的分析需求进行调整，并可拓展用于支持转录组学和基因组学等多组学分析。

肿瘤转移是一个复杂且多阶段的过程，始于原发性肿瘤内肿瘤细胞的播散，随后经历休眠和定植阶段。这些细胞逐步侵入基底膜并深入周围组织，继而进入血管或淋巴管。一旦进入循环系统，这些细胞便成为循环肿瘤细胞（CTCs），可迁移至远端器官1。CTCs的出现是转移级联过程中的关键步骤，因其作为远端转移的“种子”发挥作用1。近年来，基于CTCs的液体活检技术因其诸多优势而受到广泛关注，包括操作无创、便捷，以及具备实时动态监测的能力。该技术有助于对肿瘤生物学特性进行精确、实时和全面的评估，在监测治疗效果、预测复发及指导治疗方面具有独特优势2,3,4。此外，研究显示，即使在肿瘤负荷较低的阶段（如早期癌症、早期转移或复发期），外周血中仍可检测到CTCs5,6。因此，CTC液体活检克服了传统组织活检仅能针对影像学可检测的实体瘤的局限性7，为癌症的早期诊断、复发与转移监测、治疗指导，以及阐明肿瘤发生、发展和转移机制提供了新的视角和技术支持。例如，外周血中CTCs的数量已被证实可作为癌症患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子，CTC数量越高，预后越差8。CTC数量的动态变化也与治疗后的疾病进展和肿瘤负荷密切相关9,10。
近期研究强调，基于微流控的技术已成为分离循环肿瘤细胞（CTC）的变革性工具。这些技术 broadly 可分为基于物理特性和基于生物特性的方法，每种方法各有优势，同时也面临特定挑战。基于物理特性的方法依赖于细胞大小和变形能力的差异来分离 CTC，能够实现无标记、高通量的分选。然而，由于 CTC 本身具有固有的异质性，这种非特异性分离策略可能在捕获效率和纯度方面存在不足。例如，Lu 等人报道了一种集成聚焦分离与减速设计并结合捕获阵列的微流控芯片，在 CTC 富集和纯化方面优于大多数传统的基于物理特性的技术11。尽管如此，该芯片对白细胞（WBCs）的去除仅达到 3–4 个数量级，仍不足以满足临床应用需求。另一方面，基于免疫亲和的 CTC 分离策略通常可提供更高的目标细胞回收率和纯度。然而，捕获分子与 CTC 之间的结合相互作用常常限制了此类方法的通量12,13。因此，开发一种能够在高富集效率与高通量之间取得平衡的分离方法，对于有效处理含有稀有 CTC 群体的临床样本至关重要。
此外，循环肿瘤细胞（CTCs）之间存在显著的异质性，这为后续分析带来了重大挑战10,14,15，因为传统的群体性CTC分析常常掩盖了单个细胞之间的差异。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够对CTC基因表达的异质性在分子水平上进行全面表征，有助于深入理解CTC的分类、状态及其功能。该技术为精准肿瘤学提供了新的研究路径，并推动了对肿瘤发生、进展及转移机制的探索16。例如，Fan等人构建了肝细胞癌患者不同血管部位来源的单个CTC转录组图谱，揭示了CTC之间的空间异质性，并鉴定了介导免疫逃逸的关键因子17。与此同时，Miyamoto等人在前列腺癌患者的CTCs中鉴定出雄激素受体基因的突变和剪接变异体，从而阐明了药物耐药性的潜在机制18。
然而，单个循环肿瘤细胞（CTC）转录组测序技术的发展进展较为缓慢。现有方法在自动化和集成化方面存在不足，导致CTC回收效率低、操作流程复杂以及实验成功率较低19。例如，当前的实验方案需要依次进行CTC富集、纯化、单细胞分离以及核酸扩增等步骤。这些步骤通常在不同的离心管中完成，需多次移液和转移操作。这种劳动密集型的操作不仅降低了实验效率，还增加了CTC丢失和污染的风险20。传统的操作方法，如基于毛细管的细胞挑选，进一步限制了单细胞分离过程中的通量和分析效率21。此外，传统方法还受到泊松分布的限制，这是一种描述细胞随机包封现象的统计规律，会导致大量空液滴或每个液滴中包含多个细胞的情况，从而限制了捕获效率。为应对这些挑战，研究人员开发了用于单细胞CTC转录组分析的集成化微流控芯片。这些平台将多个步骤整合到单一芯片的工作流程中，降低了污染风险并提高了分析效率。例如，Euisik Yoon 等人开发了Hydro-Seq方法，该方法利用基于流体动力学的尺寸筛选技术将CTC分离至微腔室中，并高效地将单个CTC与带有独特条形码的微珠配对22。该策略实现了对多个CTC的高通量、并行化的单细胞分析。然而，该方法依赖于基于尺寸的CTC分离，常常导致CTC纯度较低且通量有限（10 µL/min），难以适用于大体积临床样本的处理。因此，迫切需要开发一种集成化、高通量、低体积且抗污染的单细胞CTC分析系统。
本文介绍了一种高通量且高效的循环肿瘤细胞（CTC）富集与单细胞测序方案，包含三个主要组成部分：CTC分选、纯化以及单细胞测序芯片（图1）。CTC分选微流控芯片基于动态调控磁捕获力的原理设计（图2A）。该芯片利用鱼骨结构内的涡流混合以及免疫磁珠的累积捕获作用，实现高通量的CTC富集。随后通过精确调控磁场，实现CTC的非破坏性释放。接着使用纯化芯片，利用包被白细胞抗体的微通道进行阴性筛选，获得高度纯化的CTC（图2B）。最后采用一种基于差异流阻的高效单细胞操控平台，成功克服泊松分布的限制，实现高效的单细胞与编码微球的配对与捕获（图3A）。该方法显著提高了CTC的利用率，同时降低了微珠消耗和测序成本。
<img alt="利用免疫磁珠分离循环肿瘤细胞；示意图展示流程及分析过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68708/68708fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：基于微流控技术的循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术示意图。 该工作流程展示了肿瘤细胞从肿瘤病灶脱落、进入血液循环并形成循环肿瘤细胞（CTC）的过程。含有CTC的外周血或白细胞富集样本（leukopak）依次经过CTC捕获、纯化以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）芯片处理，最终实现对CTC的转录组测序与生物信息学分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68708/68708fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>(3-巯丙基)三甲氧基硅烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175617-100G</td><td>MPTS 溶液</td></tr><tr><td>20&amp;times; SSC 缓冲液</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548109-0200</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;times; RT 缓冲液</td><td>Sangon Biotech</td><td>B610020-0500</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的 CD45 单克隆抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0459-82</td><td>储存于 2&amp;deg;C 至 8&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物素标记的 EpCAM 单克隆抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-9326-82</td><td>储存于 2&amp;deg;C 至 8&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600332-0100</td><td>储存于 2&amp;deg;C 至 8&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DECODER 芯片盒</td><td>Dynamic Biosystems</td><td>2203106</td><td>储存于 2&amp;deg;C 至 8&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DECODER 芯片盒试剂盒</td><td>Dynamic Biosystems</td><td>2203206</td><td>储存于 2&amp;deg;C 至 8&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Sangon Biotech</td><td>B501005-0500</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607009-0500</td><td>成分：NaCl 136.89 mM；KCl 2.67 mM；Na₂HPO₄ 8.10 mM；KH₂PO₄ 1.47 mM；pH = 7.2–7.4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>储存于 2&amp;deg;C 至 8&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SA T1</td><td>Invitrogen</td><td>65602</td><td>SA-MBs，1 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>B540625-0500</td><td>0.5 M，pH = 8.0</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KK2601</td><td>2&amp;times; PCR 反应混合液</td></tr><tr><td>氯化锂沉淀溶液</td><td>Invitrogen</td><td>AM9480</td><td>0.2 &amp;micro;m 滤过</td></tr><tr><td>N-&amp;gamma;-马来酰亚胺丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯</td><td>Thermo Scientific</td><td>22309</td><td>GMBS 溶液</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600749-0025</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1&amp;times; dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>SDS 溶液</td><td>Sangon Biotech</td><td>B648118-0100</td><td>10% SDS</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>189730</td><td>储存于 2&amp;deg;C 至 8&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SU-8 光刻胶</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 3050</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7.5)</td><td>LEAGENE</td><td>NR0072</td><td>1 mol/L，pH = 7.5，无 RNase</td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>LEAGENE</td><td>NR0073</td><td>1 mol/L，pH = 8.0，无 RNase</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600198-0500</td><td></td></tr><tr><td>Trueprep DNA 文库构建试剂盒 V2（适用于 Illumina）&amp;nbsp;</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>DNA 文库构建试剂盒</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA 纯化磁珠</td><td>Vazyme</td><td>N411</td><td>用于 DNA 纯化的固相可逆固定化 (SPRI) 磁珠</td></tr></tbody></table>

基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

Microfluidics-based High-throughput Circulating Tumor Cell Sorting and Single-cell Sequencing Technology

循环肿瘤细胞（CTCs）作为监测癌症转移、进展和复发的有前景的生物标志物。以CTC检测为核心的液体活检技术因其无创性以及能够实时监测肿瘤动态而展现出巨大潜力。然而，传统的批量CTC分析无法捕捉CTC群体内部的固有异质性，从而掩盖了对肿瘤生物学的关键认知。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可实现对CTC异质性的高分辨率表征，为精准肿瘤学和肿瘤进展机制研究提供了新的机遇。尽管具有上述优势，现有的单CTC测序方法通常存在效率低下的问题，包括回收率低、操作流程劳动强度大，以及因多次人工操作步骤带来的污染风险。为克服这些局限，我们提出一种集成化的微流控方案，将CTC富集、纯化和单细胞测序整合到统一的工作流程中。该方法采用在鱼骨结构芯片内动态控制的磁捕获技术，通过涡流混合和累积性免疫磁珠结合，实现高效、高通量且对细胞损伤最小的CTC分离。随后使用包被白细胞抗体的微流控芯片进行进一步纯化，通过负向筛选有效去除非靶细胞，进一步提高CTC纯度。最后，基于差异流阻原理设计的高精度单细胞测序芯片，可实现高效的单细胞捕获，并与带有独特条形码的微珠配对。这一新型平台克服了基于泊松分布方法的局限性，在减少微珠消耗和测序成本的同时，提高了CTC的利用率。我们集成化的方案显著提升了CTC的捕获效率、纯度以及单细胞测序通量，适用于临床应用和大规模癌症研究。通过实现对CTC异质性更精确且可扩展的分析，该方法有望优化癌症早期诊断、治疗监测以及转移机制研究，从而推动精准肿瘤学领域的发展。

可通过显微镜评估CTC捕获界面的组装与释放情况。在磁场作用下，HB芯片底部磁珠（MBs）分布均匀表明组装成功，而磁珠残留极少或无残留则表明释放成功（图2C）。该步骤对于确定捕获CTC的得率和纯度至关重要。为验证CTC分离芯片的捕获效率，我们进行了加标实验。将少量高表达EpCAM的肿瘤细胞（PC3或LNCaP）加入含有大量低表达EpCAM的Jurkat细胞的PBS中，以模拟循环血液中大量血细胞存在的环境。CTC分离芯片能够高效捕获1 mL和10 mL样本中的肿瘤细胞，显示出其高通量且高效的CTC分选能力（图2D）。为评估基于免疫磁珠（IMB）捕获的特异性，我们使用了经SA-MBs修饰但未偶联EpCAM抗体的对照芯片。未观察到明显的肿瘤细胞捕获，证实了IMB介导的CTC分离具有特异性（图2D）。
除了捕获效率外，纯度是评估循环肿瘤细胞（CTC）分离平台的另一个关键参数。我们比较了仅使用捕获芯片或纯化芯片分离的肿瘤细胞纯度，以及通过连续正向和负向筛选所获得的纯度（图2E）。与对照组相比，两种芯片均显著提高了肿瘤细胞的纯度，表明其在分离CTC方面的有效性。更重要的是，相较于单一方法，联合使用正向和负向筛选进一步提高了肿瘤细胞的纯度和得率。
为了进一步评估循环肿瘤细胞（CTC）捕获与分选芯片在临床环境中的性能，我们采集了六名健康供体的外周血（PB）样本，并进行了加标实验。鉴于临床样本中CTC的丰度极低，我们在每10 mL外周血样本中加入了约500-1000个LNCaP细胞。所有采集的外周血样本中白细胞（WBC）计数均处于正常范围（4-10 × 106 个细胞/mL）。结果表明，即使在处理临床样本时，该CTC分选系统仍能保持对肿瘤细胞的高捕获效率和高纯度（图2F-G，以及补充图2）。
<img alt="使用磁珠捕获循环肿瘤细胞（CTCs）；示意图及实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68708/68708fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：鱼骨结构的CTC捕获与纯化平台。（A）CTC分离芯片的工作流程。首先，稳定的磁场与偶联EpCAM抗体的磁珠（IMBs）共同构建捕获界面。随后，HB芯片内的涡旋混合增强了CTC与IMB之间的传质效率，促进CTC的累积捕获。最后，通过撤除磁场实现CTC的温和释放。（B）CTC纯化芯片的工作流程。HB芯片上修饰有阴性选择抗体，涡旋混合进一步促进白细胞与抗体的相互作用，最终获得高纯度的CTC。比例尺：100 µm。（C）显微成像显示捕获芯片的成功组装与释放。（D）柱状图比较了不同样本体积下分离平台的CTC捕获效率，以未功能化的SA-MBs作为对照。误差线表示均值±标准差（SD），n = 3。（E）柱状图比较了仅使用单个HB芯片与经过连续捕获和纯化步骤所获得CTC的纯度。对照组代表未经处理的CTC纯度。误差线表示均值±标准差（SD），n = 3。（F）CTC分离芯片中的细胞鉴定。LNCaP细胞用Hoechst和Calcein AM染色，而血细胞仅用Hoechst染色。比例尺：100 µm。（G）在加标实验中，使用1 mL或10 mL外周血时的肿瘤细胞纯度与捕获效率。误差线表示均值±标准差（SD），n = 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68708/68708fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
分离的肿瘤细胞随后接受了高通量单细胞测序。我们的方案采用了一种包含60,000个嵌套微孔的单细胞条形码系统（图3A-B）。下方呈方形的微孔用于捕获单个细胞，而上方的微孔则用于加载微珠。每个下方微孔的长度、宽度和高度均为25 µm，适用于大多数细胞类型。上方六边形微孔的内切圆直径和高度均为50 µm，可容纳通常在30至50 µm范围内的微珠。该系统基于累积捕获效应提高了细胞捕获效率，并通过尺寸排阻微孔避免了细胞双联体的形成。为了优化细胞加样方案，我们在不同细胞输入条件下研究了细胞捕获效率和微孔占用率（图3C）。结果表明，增加细胞输入量并未降低捕获效率，反而显著提高了微孔占用率。对于60,000孔的捕获芯片，当细胞输入量达到80,000时，微孔占用率趋于稳定，进一步增加输入量不再提升占用率。为最大限度减少因细胞过量加载导致的双联体发生，我们选择80,000个细胞作为最佳输入量。如图3D所示，单细胞条形码芯片实现了85.6%的细胞占用率和95.7%的条形码微珠占用率，最终配对率达到81.9%。此外，根据方案进行了多次沉降操作，通过累积捕获效应显著提高了捕获效率和配对率（图3D）。值得注意的是，细胞与微珠之间观察到的占用率差异归因于微珠的密度和质量大于细胞，使其在重力作用下更有效地沉降至微孔中。因此，在优化的加载条件下，约80%的配对占用率通常被认为是理想的。
<img alt="示意图展示细胞捕获过程，包含逆转录（RT）和PCR步骤；结果包括捕获效率和占据率的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68708/68708fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：基于微孔的高通量单细胞条形码标记与测序技术。（A）单个循环肿瘤细胞（CTC）测序方案的工作流程。（B）显微图像展示微流控单细胞/条形码磁珠捕获微孔结构。从左至右依次显示细胞捕获、磁珠捕获和磁珠回收过程。比例尺为30 µm。（C）折线图展示了在不同细胞输入条件下，单细胞条形码芯片（60000个双孔）的细胞捕获效率和微孔占据率。（D）在优化的细胞输入条件下，细胞与条形码磁珠的占据率以及相应的细胞-磁珠配对比例。左图和右图分别显示采用多次沉降和单次沉降的捕获策略。误差条表示均值±标准差，n = 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68708/68708fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，为了验证循环肿瘤细胞（CTC）分选与单细胞RNA测序（scRNA-seq）整合方案的有效性，我们将PC3、LNCaP和Jurkat细胞以大约1:3:4000的比例混合，并加载到微流控芯片上，用于肿瘤细胞的捕获、纯化及单细胞测序。通过高效的肿瘤细胞分离平台，我们获得了高纯度的EpCAM阳性肿瘤细胞（图4B）。同时，基于微流控的单细胞RNA测序芯片展现出精确的细胞类型图谱分析能力，结果通过t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）分析可视化呈现（图4A）。我们成功识别出三个不同的细胞群体，每个群体均可通过其特异性标志物加以区分（图4C）。此外，最终输出细胞的比例与纯化输入细胞的比例高度一致，证实单细胞条形码过程无偏倚且无污染（图4B）。其中一个细胞簇根据TRBC1、IGLL1、CD1E和CD3D的特异性表达被鉴定为Jurkat细胞（图4D）。通路富集分析进一步验证了该分类的稳健性（图4E）。此外，两种前列腺癌细胞系根据差异表达基因（DEGs）被清晰地划分为独立的细胞簇（图4F-G）。PC3细胞簇的特征是微小精蛋白（MSMP，又称PC3分泌微蛋白）的高表达；而LNCaP细胞簇则特异性表达与细胞黏附、增殖和多能性相关的标志物，如NEDD4、CTNNA1（α-连环蛋白1）和RBBP7。
<img alt="T细胞活化分析；示意图；PCA图、表达热图、t-SNE图、倍数变化图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68708/68708fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 4"> 
图4：通过加标实验验证CTC分选和单细胞测序结果。（A）t-SNE图显示捕获并纯化细胞的细胞类型图谱。（B）柱状图展示三种细胞类型在三个阶段中的比例：初始输入、纯化后和最终测序输出。（C）点图展示不同细胞簇中特异性标记基因的表达情况。（D）TRBC1、IGLL1、CD1E和CD3D在所有细胞中的表达水平。（E）Jurkat细胞簇中差异表达基因（DEGs）的GO和KEGG通路富集分析。（F）NEDD4和MSMP在所有细胞中的表达模式。（G）PC3与LNCaP细胞簇之间差异表达基因的火山图。红色圆点代表在PC3中上调的基因；蓝色圆点代表在LNCaP中上调的基因。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68708/68708fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>主混合液</td>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>缓冲液类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.5% F-68</td>
			<td>F-68</td>
			<td>0.50%</td>
			<td rowspan="2">DEPC 处理水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">TE-TW</td>
			<td>Tris-HCl (pH=8.0)</td>
			<td>10 mM</td>
			<td rowspan="3">DEPC 处理水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">20× TE (pH=7.5)</td>
			<td>Tris-HCl (pH=7.5)</td>
			<td>200 mM</td>
			<td rowspan="2">DEPC 处理水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">TE-SDS</td>
			<td>Tris-HCl (pH=8.0)</td>
			<td>10 mM</td>
			<td rowspan="3">DEPC 处理水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：单个循环肿瘤细胞测序制备所需试剂混合液的组成。 显示的是单细胞RNA测序（scRNA-seq）所需试剂的组分，可在芯片操作前预先配制，以确保实验流程快速且顺利进行。
补充图1：HB芯片的设计。（A）双层微流控结构的示意图。上层：具有人字形结构的上层。放大插图显示了人字形结构的详细几何形状，其相对于通道壁呈45°角排列，凹槽宽度为100 µm，间距为200 µm。下层：由支撑柱阵列（28列 × 7行）组成的底层，沿流动方向从#1到#28编号。（B）人字形芯片的侧视图。人字形凹槽的宽度为100 µm。人字形结构和支撑柱的高度均为50 µm。（C）人字形芯片的俯视图。每个支撑柱的宽度为500 µm，长度为1150 µm，相邻支柱之间的间隙为550 µm。（D）制备完成的HB芯片照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68708/Supplementary%20Fig%201.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：代表性图像，显示从CTC分离芯片出口收集的废液中存在的经荧光染色的肿瘤细胞和血细胞。LNCaP细胞用Hoechst和Calcein AM染色，而血细胞仅用Hoechst染色。比例尺为100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68708/Supplementary%20Fig%202.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表格：逆转录和文库构建中使用的寡核苷酸序列 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68708/Supplementary%20table.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

循环肿瘤细胞（CTCs）对于癌症进展和转移的研究至关重要。本文介绍了一种高通量、一体化的CTC富集与单个CTC测序方案，在提高捕获效率和CTC纯度的同时，降低了污染风险和测序成本，从而推动了精准肿瘤学研究及临床应用的发展。

循环肿瘤细胞（CTCs）作为追踪癌症转移、进展和复发的潜在生物标志物具有重要意义。液体活检技术……

我们致力于开发高性能的循环肿瘤细胞（CTC）分离与分析方法，通过液体活检推动精准肿瘤学的发展。目前市面上的CTC分离平台通量低、效率差，且与下游分析平台不兼容，限制了生物学信息的获取。本研究采用微流控CTC分离平台，显著提高了检测率。我们还应用了稀有细胞单细胞测序芯片，以进行更深入的液体活检分析。首先，将25 µL洗涤后重悬的链霉亲和素修饰磁珠加入含有1 µg生物素化EpCAM抗体的离心管中。将混合物在室温下孵育，同时以每分钟20转的速度旋转40分钟，以制备免疫磁珠。使用磁力架将磁珠与上清液分离。去除上清液后，将磁珠重悬于25 µL分离缓冲液中。在一到两秒内用移液器吸取20微升磁珠悬浮液，确保不引入气泡。立即将芯片垂直放置在磁铁上，静置五分钟使磁珠沉降，期间避免扰动。用注射器收集四毫升血液样本，确保排除气泡。用液体密封芯片的进样口和出样口以去除气泡，然后将样品进样管和出样管插入芯片。使用注射泵以每小时1.5毫升的流速注入样品。加载样品后，以每小时0.2毫升的流速向HB芯片注入60微升DPBS，以洗去未结合的细胞。移除磁铁，并手动注入1.5毫升5% BSA以洗涤芯片并释放捕获的肿瘤细胞。在乙醇中配制10% MPTS溶液。立即将20微升该溶液注入HB芯片中，并在室温下孵育一小时。用无水乙醇冲洗HB芯片一次，然后在100摄氏度下干燥一小时。接着，用乙醇配制浓度为0.5毫克/毫升的GMBS溶液。将芯片冷却至37摄氏度后，加入GMBS溶液并进行孵育。用双蒸水冲洗HB芯片两次，随后用DPBS冲洗两次。立即向HB芯片中加入15微克/毫升的链霉亲和素，室温孵育一小时，或在4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，用DPBS缓冲液冲洗HB芯片两次。通过向 DPBS 中加入 0.2% BSA 和 20 微克/毫升生物素标记的 CD45 抗体，配制 CD45 抗体缓冲液，并调整至最终体积。取 20 微升 CD45 抗体缓冲液注入 HB 芯片，用于白细胞的阴性筛选。室温孵育 1 小时后，用 DPBS 冲洗芯片。向HB芯片中加入含有3% BSA和0.05% Tween 20的封闭液。将制备好的样品吸入注射器中，确保无气泡存在。然后用液体密封芯片的进样口和出样口，并将进样管和出样管连接至芯片。使用注射泵以每小时0.6毫升的流速注入样品。从芯片出口收集纯化的肿瘤细胞，用于计数和单细胞测序。将200微升用DPBS配制的0.5% F-68溶液移入芯片入口。手持芯片进行水浴超声。当微孔区域可见气泡时，继续超声30秒，以去除双孔中的气泡。随后，将200 µL肿瘤细胞悬液注入含有60,000个双孔的芯片中。轻轻吹打芯片中的细胞悬液，上下吹打两次。然后再次置于脱色摇床中，振荡五分钟，以重悬未被捕获的细胞，并使其再次沉降。现在通过入口加入200微升DPBS和0.5% F-68溶液，并从出口吸出。重悬条形码磁珠悬液后，立即向芯片入口注入 200 微升悬液，并以每分钟 10 转的速度振荡 20 秒。将磁珠悬液轻轻吹打混匀两次，然后放回振荡器。接着从出口端吸出条形码磁珠悬液，再用移液器加入 200 微升 20 倍浓度的 Tris-EDTA 和 50 毫摩尔二硫苏糖醇溶液。从出口处吸出液体。进行细胞裂解和mRNA捕获时，缓慢加入200 µL细胞裂解缓冲液至芯片入口。立即加入200 µL矿物油以密封双孔。将芯片出口流出的溶液移除至废液储液池中。然后将芯片水平放置，在室温下静置五分钟。缓慢向入口加入200微升6X盐溶液柠檬酸钠溶液。移除废液，并从芯片出口抽吸残留溶液。缓慢加入 200 µL 的 6X 柠檬酸钠盐水溶液以充满芯片。将磁铁靠近芯片表面，并缓慢从入口向出口移动，以聚集带有条形码的微珠。迅速将溶液和磁珠吸入含有6X SSC的离心管中。用200微升6X SSC洗涤条形码磁珠三次，随后用逆转录缓冲液洗涤一次。在磁场作用下观察到免疫磁珠分布均匀，而磁力去除后残留磁珠极少，表明释放成功。CTC 分离芯片能够高效地从 1 毫升和 10 毫升样本中捕获肿瘤细胞。加入纯化芯片后，肿瘤细胞纯度进一步提高。在掺入极少量 LNCaP 细胞的外周血样本中，CTC 分选系统仍保持较高的捕获效率和纯度。单细胞条形码芯片实现了85.6%的细胞 occupancy 比率和95.7%的条形码微珠 occupancy 比率，配对率达到81.9%。增加加载细胞数量可提高微孔的 occupancy 比率，同时不降低捕获效率。整合的循环肿瘤细胞（CTC）分离与单细胞测序工作流程获得了高纯度的肿瘤细胞，并准确保留了原始肿瘤细胞的比例。tSNE 分析将 PC3、LNCaP 和 Jurkat 细胞清晰地分为三个簇，每个簇均具有独特的标志物表达特征。Jurkat细胞簇通过TRBC1、IGLL1、CD1E和CD3D的强表达来鉴定，并经T细胞活化通路富集分析确认。PC3和LNCaP细胞簇通过差异表达基因进行区分，其中PC3表现出高水平的微精蛋白表达，而LNCaP表达NEDD4。

microfluidics-based-high-throughput-circulating-tumor-cell-sorting

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

从癌症患者血液中分离循环肿瘤细胞，且不造成细胞损伤。通过使用E-选择素的双分子层表面以及针对上皮标志物的抗体，实现肿瘤细胞的分离。纳米管涂层可特异性促进癌细胞黏附，从而获得较高的捕获纯度。...

快速分离患者血液样本中具有活性的循环肿瘤细胞

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

本方案描述了去硫代生物素、链霉亲和素和APTES系统的可定制化表面功能化方法，以分离特定的目标细胞类型。此外，本文还涵盖了该方法的应用、优化及验证过程。...

一种通过玻璃表面功能化实现靶向细胞分离的方法

本文介绍了一种利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）包被的微滤膜有效捕获活体循环肿瘤细胞（CTC）并实现温度响应性释放的实验方案。该方法可从患者血液中捕获CTC，并随后释放具有活性的CTC，用于后续的芯片外培养、分析与表征。...

从血液中捕获并释放可存活的循环肿瘤细胞

单细胞测序可揭示生物系统中的基因型异质性，但现有技术缺乏对群落组成和功能进行深度分析所需的通量。本文介绍了一种微流控工作流程，可用于对来自不同细胞群体的超过&gt;50,000个单细胞基因组进行测序。...

一种用于单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。...

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

循环肿瘤细胞（CTC）的表征是转化研究中的一个热门课题。本方案描述了一种半自动免疫荧光（IF）检测方法，用于对非小细胞肺癌（NSCLC）患者样本中的CTC进行PD-L1表征及计数。...

通过免疫荧光法对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞进行半自动PD-L1表征与计数

培养循环肿瘤细胞（CTCs）可通过检测特定标志物表达、评估耐药性以及定植肝脏等能力，从而对癌症进行更深入的功能学表征。总体而言，CTCs培养有望成为一种有前景的临床工具，用于个体化医疗，以改善患者的治疗预后。...

循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

乳腺癌细胞与非肿瘤性乳腺上皮细胞具有不同的介电特性。人们推测，基于这种介电特性的差异，可将这两类细胞分离开来，用于免疫治疗。为验证这一设想，我们对一种用于分选 MCF-7 和 MCF-10A...

利用交流介电泳分离非转移性（MCF-7）与非肿瘤性（MCF-10A）乳腺癌细胞的微流控芯片装置

临床微流控芯片是一种重要的生物医学分析技术，可简化临床患者血液样本的预处理，并对循环肿瘤细胞（CTCs）进行免疫荧光染色 原位...

用于分离多种循环肿瘤细胞的临床微流控芯片平台

学习基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术。该方法利用免疫磁珠捕获CTC，实现85.6%的细胞占据率和81.9%的配对率，为精准肿瘤学研究提供高效液体活检方案。

基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

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