评估原小鼠眼部表面细胞/干细胞对紫外线-C （UV-C） 损伤的反应

该协议演示了从小鼠眼部表面细胞同时检测活原培养物中的活性氧物种（ROS）、活细胞和死细胞。2'，7'-二氯氟乙酸酸酯，碘化钠和Hoechst染色分别用于评估ROS，死细胞和活细胞，然后成像和分析。

大家好，我叫比帕莎·博斯博士。我在印度曼加洛尔耶内波亚大学耶内波亚大学耶内波亚研究中心担任副教授，并负责干细胞和再生医学中心。现在，我们将演示如何检测ROS的存在，即活性氧物种"在小鼠眼表面已经暴露在各种剂量的紫外线-C辐射活培养物。

这项技术的优点是，在这里我们可以同时检测活性氧物种，活细胞和死细胞的存在，而无需有维斯特细胞。该技术的原理主要在于染料DCFDA的活细胞渗透性。DCFDA是一种活细胞渗透无色染料，在氧化应激期间由细胞内氧化剂作用，并转化为绿色荧光DCF。

因此，绿色荧光使我们能够检测活细胞中是否存在活性氧物种。另一方面，碘化丙二是一种纯死细胞渗透染料，荧光为红色。它是一种 rDNA 双链分式染色剂。

然而，染料霍赫斯特是渗透到活细胞和死细胞。它是一个蓝色的核污渍。因此，这是一个非常简单的方法，我们可以检测在长期培养中，随着对死细胞的评估，在长期培养中是否存在活性氧物种。

每35毫米培养皿的板点200万个细胞。我们应用的细胞是小鼠眼表面的细胞。从每个细胞培养盘上去除最大体积的培养素。

留下约500微升细胞培养培养素与细胞亲密接触。最少的介质会阻止细胞干燥。但是，最小介质量的目的是允许 UVC 曝光的最大穿透力。

以紫外源下的细胞，它可以是UV交联，也可以是任何其他紫外线-C源。将细胞暴露在不同剂量的 UVC 辐射下，例如每平方米 1、10、100、1000 和 1000 焦耳。当细胞暴露于紫外线-C辐射时，盖子应处于打开位置。

这将允许紫外线-C对细胞的最大穿透，从而显示细胞对紫外线-C辐射的最佳剂量反应。将细胞带到层气流罩中，用两毫升完整的介质补充每个盘子。这个完整的介质含有20%的胎儿牛血清在DMEM，辅以补充剂，如1%的最低非必需氨基酸，以及1%抗生素，即青霉素和链霉素。

之后，在补充最大体积后，即两毫升的完整介质，将板返回孵化器并孵育三个小时，以便看到紫外线-C辐射的早期影响。在 UVC 细胞孵育后三小时内的最后 15 分钟准备活细胞染色介质。染色介质以 10%FBS 为单位，含有 DMEM 预热至 37 度。

为了制造10毫升的染色介质，首先从10毫摩尔的库存中加入5微升DCFDA，以获得5微摩尔的最终浓度。通过上下移液，混合良好。其次，从每毫升10毫克的库存中加入5微升的 Hoechst 溶液，以获得每毫升5微克的最终浓度。

现在通过上下移液很好地混合。最后，从每毫升1毫克的库存中加入200微升碘化丙胺，获得每毫升20微克的最终浓度。通过上下移液，混合良好。

现在染色溶液已准备就绪。UVC 暴露后孵育三个小时后，从 CO2 培养箱中取出板。从每道菜中找出各种剂量的 UVC 的介质，例如每平方米 1，10，100，1，000 和 10，000 焦耳。

现在，从盘子两侧轻轻向每个菜肴中加入两毫升新鲜准备好的活细胞染色介质。将板再次返回到 CO2 培养箱，并孵育 15 分钟，进行活细胞染色。在活细胞染色介质中孵育15分钟后，从每个含有暴露于不同剂量紫外线-C辐射的细胞的培养皿中去除染色介质。

用两毫升的完整介质补充细胞。现在单元格已准备好查看。现在将控制细胞放在荧光成像器的亮场下。

细胞看起来显然正常，因为它们是控制细胞。在蓝色磁场下，我们可以荧光总细胞。绿色字段下显示 ROS 一代。

由于这些是控制单元，因此没有生成 ROS。在红场下，可见碘化染色的死细胞。然后在亮场下保持紫外线照射100焦耳/平方米。

在蓝色字段下，我们还可以看到蓝色字段下的总单元格数。然而，当我们暴露在绿色领域，DCFDA阳性细胞被看到，也PI阳性死细胞被看到。最后，将最大紫外线剂量，即每平方米暴露的细胞1万焦耳，放在亮场下。

我们可以看到异常的细胞形态。然而，在蓝色磁场下，我们可以看到蓝色细胞总数。在绿色领域下，绿色荧光DCFDA阳性细胞显示ROS一代。

当细胞暴露在红场时，所有细胞都荧光红，表明当细胞以每平方米1万焦耳的紫外线剂量处理时，细胞大量死亡。现在，将各种通道中捕获的图像排列成一个与紫外线-C 剂量和未暴露的控件对应的合成图像面板。图像按组排列在单个面板中。

首先，光明场。第二，霍奇斯特蓝色核污渍。第三，碘化二丁二烯染色为死核。

第四，用于ROS阳性细胞的DCFDA。第五，合并图像。当我们查看第一排和第二排图像，即未暴露的对照组和暴露在 UVC 的细胞每米一个 joule 剂量时，我们观察到既没有 PI 或 ROS 正细胞已经点亮，从而表明未曝光的对照中完全不存在 ROS 和细胞死亡，而且每平方米一个焦耳的低 UVC 剂量。

现在来到第三排的复合图像的细胞，暴露在每平方米100焦耳。此剂量的细胞百分比非常低，大约 10% 对 PI 和 DCFDA 均呈阳性，从而表示 ROS 生成和细胞死亡量较低。现在，我们转到进一步更高剂量的 UVC 辐射暴露，即每平方米 1，000 焦耳/平方米，如合成图像的第四行所示。

在这里，大约70%的细胞对PI和DCFDA呈阳性反应。最后，我们转到最高剂量的 UVC 曝光量，即每平方米 10，000 焦耳，如合成图像第五行中所示。在这里发现，几乎100%的细胞对PI和DCFDA都是阳性的，从而表明在这个特定的 UVC 剂量下，100%细胞死亡和ROS生成。

将图像传输到成像软件。首先打开蓝色图像，指示霍施特染色核，即细胞总数。打开计数工具，一次单击每个单元格一个，以便获得数字。

现在打开在红色通道下捕获的图像，指示 PI 阳性死细胞。打开计数工具，然后单击每个红色点，指示 PI 阳性死细胞的计数。一旦死细胞的计数结束，单击捕获的绿色通道捕获的单元格并打开计数工具，然后单击指示显示 ROS 代的单元格的每个绿点。

完成绿通道下捕获的绿色细胞的计数，然后使用公式枚举按 UVC 损伤计算细胞死亡的百分比和按 UVC 损伤计算 ROS 生产的百分比。这是使用PI阳性细胞的简单公式数计算的，即红色荧光细胞，除以 Hoechst 阳性细胞数乘以100。按紫外线损伤计算的ROS生产百分比使用公式、DCFDA阳性或绿色荧光细胞数，除以 Hoechst 阳性细胞数乘以 100。

一旦同时具有百分比（即细胞死亡的百分比）和 ROS 生产的百分比，请使用这些值绘制条形图。X 轴表示 UV 的剂量，而 y 轴表示细胞的百分比。绿色条表示 ROS 代的百分比，而红色条表示细胞死亡的百分比。

经分析，很明显，在 UVC 剂量 100 焦耳有 10%ROS 生成细胞以及 10% 细胞死亡。而在 UVC 剂量 10 提高到每平方米三焦耳，70%的细胞表现出ROS生成以及细胞死亡。虽然在低剂量的 UVC， 即 10 提高到 4 焦耳每平方米， 约 100% 细胞表现出细胞死亡以及 ROS 生产.

因此，可以得出结论，ROS生成与细胞死亡之间有很强的正相关关系。总之，该技术对于同时评估活性氧物种、活体和死细胞的活体、正常事件培养能力非常方便。这项技术还可用于有限评估活性氧物种，活细胞和死细胞，在长期培养物已经暴露在各种细胞破坏剂，如紫外线辐射，或化学剂。

该技术还可以指导研究人员确定在 50%ROS、75%ROS 等细胞中采集细胞的最佳时间，例如，对于许多下游应用，如 QR 到 PCR 和西游布。