Name: 评估原小鼠眼部表面细胞/干细胞对紫外线-C （UV-C） 损伤的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 了解如何使用DCFDA、碘化丙啶和Hoechst染色法同时检测小鼠眼部表面活细胞中的活性氧、活细胞和死细胞，以评估紫外线C辐射诱导的氧化应激和细胞死亡。该方法适用于眼部生物学研究。

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作者感谢 Yenepoya 研究中心和 Yenepoya（ deemed to be University）提供的基础设施支持。

实验采用来自瑞士白化小鼠眼球的原代眼细胞/干细胞进行。本实验采集小鼠眼球所用的动物已获得叶内波亚（ deemed to be University）机构动物伦理委员会批准（IEAC 批准编号：6a/19.10.2016）。
1. 试剂的准备
注意：从小鼠眼表分离原代细胞/干细胞不在本实验方案的范围之内。因此，本文仅演示紫外线C（UV-C）照射剂量、用于检测活性氧（ROS）、活细胞与死细胞及其定量的试剂配制。有关配制终末染色液所需添加的试剂（10% 胎牛血清、DCFDA、Hoechst 和碘化丙啶储备液）相应体积，请参见表1。
<ol>
	<li>通过将25 mg DCFDA粉末溶解于5.13 mL DMSO中，配制10 mM DCFDA储备液。将溶液分装至棕色1.5 mL离心管中，每管250 µL，于-20 °C保存。</li>
	<li>通过将25 mg瓶装Hoechst 33342全部溶解于2.5 mL去离子水中，配制10 mg/mL（16.23 mM）Hoechst 33342储备液。将溶液分装至棕色微量离心管中，每管100 µL，于2–6 °C保存，可稳定保存长达6个月。如需长期保存，请置于-20 °C。</li>
	<li>用去离子水配制1 mg/mL的碘化丙啶储备液，每管1 mL分装至棕色1.5 mL离心管中，于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 细胞铺板与UV-C辐射处理
<ol>
	<li>接种前，使用温和的细胞解离试剂（材料表）解离本实验室分离的小鼠原代眼表细胞（未发表结果；此类细胞为角膜上皮细胞、基质细胞和角质细胞的混合物）。</li>
	<li>将 0.2 × 106 个小鼠原代眼表细胞接种于 35 mm 经 0.2% 基底膜基质包被的细胞培养皿中，加入 2.5 mL 完全培养基。于 37 °C、5% CO2 及湿润环境中孵育过夜。 
	注意：培养小鼠眼表原代细胞的完全培养基由含 20% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（Pen-strep）、1% Glutamax、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% 丙酮酸钠和 0.1% β-巯基乙醇的高糖 DMEM 组成。</li>
	<li>在将细胞暴露于不同剂量的 UV-C 之前，弃去尽可能多的培养基，仅保留一层薄薄的培养基（约 500 µL）与细胞接触，刚好覆盖细胞即可。</li>
	<li>将培养皿逐个转移至 UV-C 光源/照射室（杂交炉/紫外交联仪的下层腔室；材料表）。将培养皿放入腔室内并取下皿盖。保持皿盖敞开状态可确保细胞在 UV-C 照射期间接受最大剂量的辐射。</li>
	<li>将细胞暴露于不同等级/剂量的 UV-C：1 J/m2、100 J/m2、1,000 J/m2 和 10,000 J/m2。</li>
	<li>UV-C 照射后，立即重新盖上每个培养皿的皿盖，并将其从 UV-C 光源室中取出。</li>
	<li>将每个培养皿转移至超净工作台，向每个培养皿中补充 2 mL 新鲜完全培养基。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 3 小时。UV-C 照射后孵育 3 小时是观察和量化早期效应的最佳时间。</li>
</ol>
3. 活细胞染色培养基的制备
<ol>
	<li>在UV-C照射后3小时细胞孵育的最后15分钟内，新鲜配制染色液。</li>
	<li>将含10% FBS的DMEM培养基（添加1%青霉素-链霉素）预热至37 °C，取10 mL备用。</li>
	<li>加入5 μL 10 mM DCFDA、5 μL 10 mg/mL Hoechst溶液和200 μL 1 mg/mL碘化丙啶。最终在10 mL染色液中，DCFDA、Hoechst和PI的终浓度分别为5 μM、5 μg/mL和20 μg/mL。</li>
</ol>
4. 紫外线C照射后的小鼠原代眼细胞DCFDA染色
<ol>
	<li>将经不同剂量UV-C照射的小鼠原代眼细胞在孵育3小时后，吸去35 mm培养皿中的培养基。</li>
	<li>从培养皿侧边轻柔地向每个培养皿中加入2 mL freshly prepared DCFDA染色培养基。</li>
	<li>将细胞在37 °C CO2培养箱中避光孵育15分钟，以完成活细胞染色。</li>
</ol>
5. 观察经DCFDA（ROS）、Hoechst和PI染色的细胞
<ol>
	<li>孵育结束后，弃去染色液。</li>
	<li>向细胞中加入新鲜的完全培养基，并在倒置荧光显微镜/细胞成像仪（材料表）下观察细胞。拍摄所需视野的图像：明场、蓝色荧光、红色荧光、绿色荧光。 
	注意：蓝色荧光染色的细胞为细胞核，绿色荧光代表产生活性氧（ROS）的细胞，红色荧光表示碘化丙啶（PI）阳性的死亡细胞。</li>
</ol>
6. 使用成像技术对染色细胞（Hoechst-蓝色、PI-死亡细胞和Green-ROS）进行定量分析
<ol>
	<li>将倒置荧光显微镜/细胞成像仪下拍摄的图像导出至 ImageJ 进行定量分析。</li>
	<li>依次打开每张图像，并逐个使用各通道（即蓝色（细胞核/Hoechst）、绿色（ROS）、红色（死亡细胞/PI 阳性））进行计数。从未暴露的对照组开始，依次进行 1、100、1,000 和 10,000 J/m-2 的处理组。</li>
	<li>使用软件菜单中标记为十字形的细胞计数工具，在每张图像的各个视野中分别对各处理组对应的细胞进行计数（蓝色阳性（Hoechst 阳性；细胞核）、红色阳性（PI 阳性；死亡细胞）、绿色阳性（ROS））。</li>
	<li>通过点击每个视野中特定的信号来进行计数。例如，点击蓝色/Hoechst 染色的细胞核，可获得该视野中的细胞核总数。</li>
	<li>将结果计算为紫外线损伤导致的细胞死亡率（PI 阳性细胞数 × 100 ÷ Hoechst 阳性细胞数）和紫外线损伤诱导的 ROS 生成率（DCFDA 阳性细胞数 × 100 ÷ Hoechst 阳性细胞数）。</li>
</ol>

<ol><li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+surface%3A+the+challenge+to+enable+and+protect+vision%3A+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li>
<li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Ophthalmoogy%22%5BJournal%5D)">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li>
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</ol>

作者获得了伯乐实验室印度私人有限公司对本文发表的资助支持。

本文所述的DCFDA染色方法可用于观察经UV-C辐射处理的小鼠原代眼组织活细胞中的活性氧（ROS）。该染色方法的一个优势在于，研究人员可同时研究UV-C照射后3小时的即时效应，并对活细胞中ROS阳性细胞及死细胞的比例进行同步计数。此外，由于该染色方法适用于活细胞，染色后的细胞可在相同培养基中继续孵育较长时间（数天），以便研究UV-C辐射的延迟效应。因此，该染色方法能够在倒置荧光显微镜下可视化ROS的产生（绿色荧光），并同时区分活细胞、凋亡细胞和死细胞群体。然而，在某些情况下，尽管预期可观察到ROS阳性及PI阳性细胞，但仍可能出现无法成功成像的情况。对此类情况，建议进行故障排查（表2）。
为获得最佳结果，必须准确执行本方案。最佳结果表明，绿色荧光信号的发射/活性氧的生成与特定UV-C剂量诱导的DNA损伤之间存在相关性，可作为准确的读数指标。换句话说，在执行此步骤时，细胞在UV-C照射期间所接触的培养基体积不应过多，以免UV-C剂量无法引发所需的损伤。因此，应保持最小量的培养基，例如每个35 mm培养皿中加入500 µL，仅需足以覆盖细胞即可，以确保在...

眼表（OS）是一个功能单位，主要由角膜的外层和腺体上皮、泪腺、睑板腺、结膜、部分眼睑边缘以及传递信号的神经支配共同构成1。透明的圆顶状角膜层可将光线聚焦到视网膜上。这一无血管组织由上皮细胞、角质形成细胞和内皮细胞等细胞成分以及胶原蛋白和糖胺聚糖等非细胞成分组成2。该区域通过泪液引流，同时泪液也提供大部分营养物质。由于眼表在解剖位置上直接暴露于外界环境，常接触到强光、微生物、灰尘颗粒和化学物质等多种严苛因素，因此易受物理性损伤，并易发生多种疾病。
氧化应激是由于活性氧（ROS）的生成与内源性抗氧化防御机制之间失衡所致3。ROS分为活性分子和自由基两类，均通过线粒体氧化磷酸化由分子氧（O2）衍生而来4。前者包括非自由基类物质，如过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）；后者则包括超氧阴离子（O2-）和羟基自由基（•OH）等。这些分子是正常细胞过程的副产物，参与多种重要生理功能，如信号转导、基因表达和宿主防御5。已知在病原体入侵、外源性化学物质以及紫外线（UV）辐射暴露等因素刺激下，ROS的生成会显著增加4。ROS的过度生成将导致氧化应激，进而引起核酸、蛋白质和脂质等分子的损伤6。
自然阳光是紫外线辐射最主要的来源，包含紫外线A（UV-A，400–320 nm）、紫外线B（UV-B，320–290 nm）和紫外线C（UV-C，290–200 nm）7。已有研究报道，波长与光谱能量之间存在反比关系。尽管自然环境中的UV-C辐射会被大气层吸收，但诸如汞灯和焊接设备等人工光源会发射UV-C，因而构成职业性危害。眼部暴露后的症状包括光性角膜炎和光性角结膜炎8。活性氧（ROS）的产生是紫外线诱导细胞损伤的主要机制之一9。在本研究中，我们采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色法检测暴露于UV-C的小鼠原代眼表细胞/干细胞中的ROS水平，并通过荧光显微镜捕捉绿色荧光信号。同时使用两种染料对细胞进行复染：Hoechst 33342标记活细胞，红色碘化丙啶标记死细胞。

<table><tbody><tr><td>2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>2',7'-二氯荧光素二乙酸酯是一种可产生荧光的探针，能够穿透细胞膜，用于活性氧物种的定量检测。</td></tr><tr><td>细胞培养皿（35 mm）</td><td>Eppendorf</td><td>SA 003700112</td><td>用于细胞培养的无菌培养皿。</td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>HiMedia</td><td>AT007</td><td>最常用的细胞培养基之一，含有4500 mg/L葡萄糖。</td></tr><tr><td>胎牛血清，欧盟来源</td><td>HiMedia</td><td>RM99955</td><td>细胞培养基中最重要的成分之一，提供生长因子、氨基酸、蛋白质、脂溶性维生素（如A、D、E和K）、碳水化合物、脂类、激素、矿物质及微量元素。</td></tr><tr><td>GlutMax</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>用作补充剂，是L-谷氨酰胺的替代物，有助于提高细胞活力和生长。</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td></td><td>杂交炉/紫外交联仪</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td>Hoechst染料可穿透活细胞和死细胞，能够结合双链DNA，不受细胞死活状态影响。</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td></td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸（100倍浓缩液）</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>作为补充剂使用，可促进细胞生长并提高细胞存活率。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen-Strep）</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>青霉素和链霉素用于防止细胞培养中的细菌污染。</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>一种荧光染料，仅能穿透死细胞，可与DNA结合，用于区分活细胞与死细胞。</td></tr><tr><td>TryplE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>温和的细胞解离试剂</td></tr><tr><td>ZOE荧光细胞成像仪</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠眼表原代细胞/干细胞对紫外-c（uv-c）损伤所致氧化损伤的评估

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

由于各种环境因素的影响，眼表经常受到磨损。暴露于紫外-C（UV-C）辐射是职业健康危害之一。本文中，我们演示了小鼠眼表来源的原代干细胞暴露于UV-C辐射的实验方法。活性氧（ROS）的生成量用于反映氧化应激/损伤的程度。在体外实验条件下，评估由氧化应激导致的死亡细胞百分比也至关重要。本文将演示经UV-C照射的小鼠眼表原代干细胞的2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色，以及基于DCFDA荧光图像的定量分析。DCFDA染色直接反映ROS的生成水平。我们还通过同时使用碘化丙啶（PI）和Hoechst 33342分别对死细胞和活细胞进行染色，演示了活细胞与死细胞的定量分析，并计算DCFDA（ROS阳性）细胞和PI阳性细胞的百分比。

DCFDA 是一种无色染料，为荧光素的化学还原形式，用作检测细胞内活性氧（ROS）的指示剂。该染料可被细胞截留，并易于氧化为具有荧光的二氯二氢荧光素（DCF），后者发出绿色荧光。该荧光可通过荧光显微镜进行检测。细胞的状态可依据荧光特征与 ROS 的积累情况进行如下判读：（i）无 ROS 的活细胞发出强烈的蓝色荧光；（ii）有 ROS 积累的活细胞发出强烈的蓝色荧光和微弱的绿色荧光；（iii）有 ROS 积累的死细胞发出微弱的蓝色荧光，同时伴有强烈的红色和绿色荧光。
对照细胞和暴露于1 J/m2 UV-C的细胞均未出现DCFDA/ROS和PI阳性细胞。未暴露于UV-C的对照组仅显示Hoechst染色指示的细胞核染色（图1）。然而，在未暴露于UV-C的对照细胞中未观察到PI或DCFDA阳性细胞（图1）。
暴露于100 J/m2 UV-C的细胞表现出较低的活性氧（ROS）...

本方案展示了在小鼠眼表细胞的原代活体培养物中，同时检测活性氧（ROS）、活细胞和死细胞的方法。分别使用2',7'-二氯荧光素双乙酸酯、碘化丙啶和Hoechst染色来评估活性氧、死细胞和活细胞，随后进行成像与分析。

小鼠眼表原代细胞/干细胞对紫外-C（UV-C）损伤所致氧化损伤的评估

眼表因各种环境因素而经常受到磨损。暴露于紫外-C辐射是某些职业环境中的一种危害……

大家好，我是Bipasha Bose博士。我在印度芒加罗的Yenepoya大学Yenepoya研究中心干细胞与再生医学中心担任副教授兼负责人。接下来，我们将演示如何检测经不同剂量紫外-C辐射处理后的小鼠眼表活体培养物中活性氧（ROS）的存在。该技术的优势在于，可同时检测活性氧物质以及活细胞和死细胞的存在，而无需使用Vester细胞。该技术的原理主要基于染料DCFDA对活细胞的通透性。DCFDA是一种可穿透活细胞的无色染料，在发生氧化应激时，会被细胞内的氧化酶作用，转化为发出绿色荧光的DCF。因此，绿色荧光使我们能够检测活细胞中活性氧的存在。另一方面，碘化丙啶是一种仅能穿透死细胞的染料，可发出红色荧光，它是一种作用于双链rDNA的嵌入性染料。然而，Hoechst 染料可穿透活细胞和死细胞，是一种蓝色细胞核染色剂。因此，这是一种非常简单的方法，可随着时间推移检测长期培养物中活性氧的存在情况，同时评估死细胞数量。每35毫米培养皿接种两百万个细胞。所使用的细胞为小鼠眼表来源的细胞。从每块细胞培养皿中尽可能吸除培养基液体。在细胞附近保留约 500 微升的细胞培养基。少量培养基可防止细胞干燥。然而，保留少量培养基的主要目的是使 UVC 照射达到最大穿透效果。将细胞置于紫外光源下，可以使用紫外交联仪，也可以使用其他任何紫外-C（UVC）光源。使细胞暴露于不同剂量的UVC辐射，例如每平方米1、10、100、1,000和10,000焦耳。当细胞暴露于紫外-C辐射时，培养皿盖应处于打开状态。这将使短波紫外线最大程度地穿透到细胞中，从而显示细胞对短波紫外线辐射的最佳剂量-反应关系。将细胞移至超净工作台，并为每个培养皿补充两毫升完全培养基。该完全培养基含有20%胎牛血清的DMEM，添加物包括1%最低必需非必需氨基酸以及1%抗生素（青霉素和链霉素）。随后，补充最大体积的完全培养基，即两毫升，将培养板放回培养箱中，在紫外-C辐射后孵育三小时，以观察其早期效应。在UVC照射后细胞孵育的最后15分钟内，准备活细胞染色液。染色液使用含有10%FBS的DMEM配制，并预先加热至37摄氏度。配制 10 毫升染色液时，首先从 10 毫摩尔的储备液中加入 5 微升 DCFDA，以获得 5 微摩尔的终浓度。通过上下吹打充分混匀。其次，从 10 毫克/毫升的储备液中加入 5 微升 Hoechst 溶液，以获得 5 微克/毫升的终浓度。用移液器上下吹打充分混匀。最后，从浓度为1毫克/毫升的储备液中加入200微升碘化丙啶，使终浓度为20微克/毫升。再次用移液器上下吹打充分混匀。现在染色液已准备好可供使用。在UVC照射后孵育三小时，将培养板从CO2培养箱中取出。吸去已暴露于不同剂量UVC（如每平方米1、10、100、1,000和10,000焦耳）的各培养皿中的培养基。现在，从培养皿的侧边轻轻向每个培养皿中加入 2 毫升新配制的活细胞染色液。将培养皿重新放回 CO2 培养箱中，孵育 15 分钟以进行活细胞染色。在活细胞染色液中孵育 15 分钟后，移除含有经不同剂量紫外线-C 辐射处理细胞的各培养皿中的染色液。向细胞中加入两毫升完全培养基。此时细胞已准备好用于观察。现在将对照细胞置于荧光成像仪的明场下。这些细胞看起来明显正常，因为它们是对照细胞。在蓝光视野下，我们可以看到荧光标记的全部细胞；在绿光视野下，则显示活性氧（ROS）的产生。由于这些是对照细胞，因此没有活性氧产生。在红光视野下，可见经碘化丙啶染色的死亡细胞。随后在明场下，将经紫外线照射（100 焦耳/平方米）的样本继续培养。在蓝光视野下，我们还可以看到蓝光视野下的总细胞数量。然而，当我们切换到绿光视野时，可观察到DCFDA阳性的细胞，同时也能看到PI阳性的死亡细胞。最后，将接受最大紫外线剂量（即10,000焦耳/平方米）照射的细胞置于明场下观察。我们可以观察到细胞形态异常。然而，在蓝光视野下可见全部为蓝色的细胞。在绿光视野下，可见发出绿色荧光的DCFDA阳性细胞，表明有活性氧（ROS）的产生。当细胞暴露于红色视野时，所有细胞均发出红色荧光，表明在以 10,000 焦耳每平方米的紫外线剂量处理后，细胞死亡数量显著增加。现在将不同通道拍摄的图像按组排列，整合为单个复合图像面板，对应不同的紫外-C 剂量组及未暴露的对照组。图像以分组形式排列在同一个面板中。首先，明场图像；其次，Hoechst 蓝色核染色；第三，碘化丙啶染色，用于标记死亡细胞核。第四，DCFDA用于检测ROS阳性细胞；第五，合并图像。当我们观察第一行和第二行图像时，即未暴露的对照组以及暴露于1焦耳/平方米UVC剂量的细胞，我们发现无论是PI染色还是ROS阳性细胞均未出现荧光信号，这表明在未暴露的对照组以及如此低剂量的1焦耳/平方米UVC照射下，细胞内完全不存在活性氧（ROS）生成和细胞死亡现象。接下来观察暴露于100焦耳每平方米剂量下的细胞复合图像第三行。在此剂量下，仅有极低比例的细胞（约10%）同时对PI和DCFDA呈阳性，表明活性氧（ROS）生成量和细胞死亡均处于较低水平。接下来，我们继续观察更高剂量的UVC辐射暴露，即复合图像第四行所示的1,000焦耳每平方米。在此，约 70% 的细胞对 PI 和 DCFDA 呈阳性。最后，我们进入最高剂量的 UVC 照射，即每平方米 10,000 焦耳，如组合图像第五行所示。在此条件下，几乎所有细胞对 PI 和 DCFDA 均呈阳性，表明在此特定 UVC 剂量下细胞死亡率达到 100%，同时活性氧（ROS）生成也达到 100%。将图像导入成像软件中。首先打开显示Hoescht染色细胞核的蓝色图像，该图像代表细胞总数。打开计数工具，依次单击每个细胞，以获得细胞数量。现在打开在红色通道下拍摄的图像，该图像显示 PI 染色阳性的死亡细胞。打开计数工具，依次点击每个红色斑点，以记录 PI 染色阳性死亡细胞的数量。完成死亡细胞计数后，切换至绿色通道下拍摄的细胞图像，打开计数工具，依次点击每个绿色斑点，以标记显示活性氧（ROS）生成的细胞。完成在绿色通道下捕获的绿色细胞计数后，利用公式计算UVC损伤导致的细胞死亡百分比以及UVC损伤引起的活性氧（ROS）产生百分比。细胞死亡百分比的计算公式为：碘化丙啶（PI）阳性细胞（即发红色荧光的细胞）数量除以Hoechst阳性细胞数量，再乘以100。UVC损伤引起的ROS产生百分比的计算公式为：DCFDA阳性（即发绿色荧光）细胞数量除以Hoechst阳性细胞数量，再乘以100。获得细胞死亡百分比和活性氧（ROS）生成百分比后，使用这些数值绘制柱状图。X 轴表示紫外线（UV）剂量，Y 轴表示细胞百分比。绿色柱代表活性氧生成百分比，红色柱代表细胞死亡百分比。分析结果显示，在100焦耳的UVC剂量下，有10%的细胞产生活性氧（ROS），同时出现10%的细胞死亡。而在10³焦耳/平方米的UVC剂量下，70%的细胞表现出活性氧生成及细胞死亡。当UVC剂量达到最高水平，即10⁴焦耳/平方米时，几乎所有细胞（约100%）均出现细胞死亡以及活性氧的产生。因此，可以得出结论：活性氧的生成与细胞死亡之间存在强烈的正相关关系。总之，该技术非常适用于在活体正常细胞培养中同时评估活性氧、活细胞和死细胞。该技术也可用于长期培养中活性氧、活细胞和死细胞的有限评估，例如暴露于紫外线辐射或化学试剂等各种细胞损伤因子的情况。该技术还可指导研究人员确定收获细胞的最佳时间，例如在50%ROS、75%ROS等条件下，以便用于多种后续实验，如qRT-PCR和蛋白质印迹（Western blotting）。

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