亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育
2019年6月6日
本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C. elegans）胚胎中的单细胞标记，用于研究神经发育过程中单个细胞的动态行为。
本方案可实现对活体胚胎中细胞谱系和细胞身份的高效示踪，同时分析发育中的秀丽隐杆线虫（C.elegans）神经元的轴突和树突等精细细胞形态。与共聚焦显微镜相比，双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）具有更高的信噪比、更均一的空间分辨率，更适合长期的活体成像。首先，将500 µL的1%甲基纤维素溶液加入凹面载玻片的凹槽中。
使用铂金丝挑取线虫生长培养基平板上的成虫，转移至M9甲基纤维素溶液中。用磨尖的18号皮下注射针头在虫体中部进行横向切割，直至获得一个到四个细胞的胚胎。将微量移液毛细管预先吸入10至15微升M9缓冲液，用吸管嘴轻轻含在牙齿之间，从载玻片上轻柔吸取数个胚胎进入毛细管中。
将胚胎分配到装有新鲜M9缓冲液的钢制成像室盖玻片的中央矩形区域中。轻轻调整胚胎方向，使其长轴垂直于盖玻片的长轴。然后将钢制成像室放入双平面照明显微镜（diSPIM）载物台上的样品 holder 中。
为准备胚胎成像，打开 Micro-Manager 软件，将激光强度设置为 488 纳米波长下 179 微瓦（相当于 0.5%），561 纳米波长下 79 微瓦（相当于 0.25%）。必须提前完成软件调节与实际激光输出之间的校准，以便将显微镜设定至特定的微瓦数值。在插件菜单中，选择“设备控制”下的 Applied Scientific Imaging diSPIM，打开 Applied Scientific Imaging 双视角倒置选择性平面照明显微镜窗口。
在采集选项卡下，确认参数已按指示设置。在自动对焦选项卡下，将参数设置为如指示所示。注意，自动对焦通道应指定为计划进行谱系追踪实验的核荧光通道。
检查路径 A 或 B 的光束和片层盒子，然后点击“live”以开始图像采集。此时将打开一个实时视图窗口。随后在目标胚胎周围绘制一个方框，以选定胚胎的自动对焦分析区域，然后点击“start acquisition”以启动长期多维图像采集。
进行图像查看、处理和细胞谱系分析时，在下载并解压软件包后，双击 CytoSHOW_app.jnlp 文件以启动 CytoSHOW。在文件菜单下，选择“新建”和“diSPIM Monitor Micro Manager”，定位到原始 Micro Manager 图像所保存的根数据集文件夹。
选择任意时间点文件夹并点击打开。SPIM A 和 SPIM B 的多维导航窗口将自动打开。使用多边形选择工具，在目标胚胎的腹侧、背侧、前端和后端边缘外侧依次点击，从而在 SPIM A 和 SPIM B 的视图中均生成一个领结形状的选区，然后点击 diSPIM。对每个 SPIM 通道的绿色和红色通道进行对齐，然后再次点击 diSPIM。
所有其他位置窗口中的图像将被触发进行位移。接下来，点击 diSPIM 和融合（fuse）按钮，打开去卷积融合 diSPIM 原始数据体积的对话框，并按指示设置参数。当所有参数设置完成后，点击“是”，然后指定用于保存处理后文件的输出目录，再点击“确定”。在预览窗口中，将时间轴滚动条（t-scroll bar）移至该时间窗口的第二个时间点，并移动 z 轴滑块（z-slider），直到显示沿胚胎长轴方向的视图为止。
将预览窗口中的 t-滚动条移回时间点一，使用线条选择工具从腹侧最圆的细胞核穿过 AB 细胞中期板平面画一条线。点击 diSPIM 预览按钮，以保存对预览图像体积方向的精细调整。将 diSPIM 监视窗口的 t-滚动条设置为待处理图像全时程的起始和结束时间点。
然后单击“确定”。为了实现高效且准确的细胞谱系分析，在进行 Starry Night 处理之前，必须将数据体精确地对齐至 ADL 方向。要在 AceTree 中打开 Starry Night 谱系追踪序列，请打开提供的自定义 AceTree 文件，并选择“打开配置文件”以定位到先前指定的输出目录。打开目标胚胎的 fuse 子文件夹，然后选择已编辑的文件。
然后点击打开，按照之前所述进行谱系可视化和编辑。经优化的实验方案不会对胚胎产生可检测到的光毒性，这一点通过孵化时间及与发育里程碑相关的时间节点评估得到证实。按照本方案进行实验，确定了该表达绿色荧光蛋白的转基因线虫品系中原本未明确的细胞为运动神经元、排泄管细胞以及两个肌肉细胞。
早在受精后360分钟，已鉴定的神经元即呈现斜向形状，其较长的细胞轴代表了后续 neurite（神经突）生长的方向。在受精后385至410分钟期间，RMDD神经元的神经突向前延伸约六微米，超出细胞体。在受精后415至445分钟期间，两条神经突均向背侧延伸，进入并环绕假定的神经环区域。
平均而言，每个RMDD神经突从细胞体延伸约11微米后，会与对侧相应的神经突在环的顶端同步相遇。综上所述，这些数据表明，利用该整合方案可以对单个可识别细胞的神经发育特征进行观察、比较和定量分析。需要注意的是，应将胚胎垂直定向，使每个胚胎的长轴与盖玻片的长轴相互垂直。
通过该方案，我们已开始从各个角度探索早期胚胎神经系统，例如细胞生成、迁移与分化，以及神经突的形成、延伸和束化过程。
概述
本研究提出了一种组合方法，利用高分辨率显微镜和计算工具，在活体秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎中分析神经发育过程中的单细胞动态。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 显微技术
背景
- 在单细胞水平上理解神经发育对于深入了解神经元功能至关重要。
- 秀丽隐杆线虫（C. elegans）是研究发育过程中细胞动态的模式生物。
- 高分辨率成像技术增强了对细胞结构的可视化能力。
- 单细胞标记技术可实现对细胞谱系和细胞身份的精确追踪。
研究目的
- 在活体秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎中追踪细胞谱系和细胞身份。
- 分析发育中神经元的精细细胞形态，例如轴突和树突。
- 比较双平面照明显微镜（diSPIM）与传统共聚焦显微镜的成像效果。
使用的方法
- 使用甲基纤维素溶液制备胚胎以进行成像。
- 利用双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）实现增强成像。
- 使用专用软件进行图像采集与处理。
- 通过定制化方案进行细胞谱系分析，以最大限度减少光毒性。
主要结果
- 在转基因秀丽隐杆线虫品系中鉴定了运动神经元及其他细胞类型。
- 随时间记录了发育中神经元的详细形态。
- 对神经突生长模式进行了量化，揭示了显著的发育特征。
- 优化后的实验方案显示对胚胎无明显光毒性。
结论
- 该整合方案可实现对神经元发育的全面研究。
- 可有效分析和比较单个可识别的细胞。
- 这些发现有助于深入理解秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的神经发育过程。
常见问题
行业应用价值
本方案可实现对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎神经发育的高分辨率、长期成像，能够以亚细胞分辨率观察神经元形态及细胞谱系动态。通过将双平面光片显微镜（diSPIM）与自动谱系分析相结合，可在单细胞水平上将基因扰动与表型结果关联，从而在靶点验证中支持机制性风险排除。这种预测性信心有助于优先筛选治疗假设，并降低早期发现流程中的不确定性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在亚细胞分辨率下关联细胞谱系身份与基因表达及形态动力学，实现对治疗假设的深入探究。
- 操作价值：通过精确追踪活体胚胎中神经元发育和神经突生长模式，支持生物学风险降低。
- 预测可信度：通过随时间量化可识别单个细胞的神经发育特征，助力项目组合的筛选与决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：通过在所有维度上生成分辨率为约330 nm的各向同性4D数据集，为下游工作流程准备经过验证的生物系统。
- 可重复性：实现标准化的成像和处理流程，最大限度减少光毒性，并确保发育阶段的一致性。
- 定量输出：提供神经突延伸的测量结果（例如，RMDD神经突延伸约11微米），以支持在表型筛选中对化合物进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：提供一种与疾病相关的系统，用于研究神经发育过程，直接关联神经元连接性和神经环路形成。
- 转化连续性：通过在遗传可操控的模型中实现细胞谱系与功能形态学的关联，连接从发现到临床前验证的转化路径。
- 风险调控的进展：通过详细描绘神经元亚型的形态动力学特征，提供可预测性的去风险化支持，助力推进或终止决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期生物学中的假设验证到先导化合物鉴定的发现连续过程，其中定量的表型读数为化合物筛选和作用机制研究提供依据。
- 发现生物学：通过将特定细胞谱系（例如运动神经元、排泄管）与结构性和功能性神经发育表型相关联，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：通过标准化、可重复的成像提供即用型检测支持，实现对基因或化学扰动在神经元形态上影响的规模化评估。
- 分析：生成 neurite 长度、出芽时间及束化模式等定量因变量测量结果，从而实现不同实验条件间的客观比较。
- 转化研究：通过建立正常神经发育的基准，为疾病模型提供比较依据，连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像与分析平台，适用于胚胎发生、基因表达及神经发育研究等多个领域。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低神经发育通路中的机制不确定性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：实现高分辨率四维成像在纵向研究中的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过早期表型去风险化，实现更优的立项/终止决策、资本利用效率提升以及后期生物风险的降低。
- 项目组合影响：基于定量的亚细胞水平神经发育指标，进行经风险调整的优先排序和推进决策。
实施注意事项
- 需要具备活体样本制备、双视角选择性平面照明显微镜（diSPIM）光路校准以及多视角图像融合以实现各向同性分辨率的专业技术。
- 需要配备双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）硬件系统，并对激光进行校准，以确保488 nm和561 nm激发光的稳定性。
- 要求在胚胎取向、延时成像参数及图像后处理流程（如CytoSHOW、Starry Night、AceTree）方面实现跨团队标准化。
- 在将实验方案应用于不同遗传背景或荧光报告基因品系时，需考虑相应的适应性调整。
- 存在若干实际限制因素，例如需要精确判定胚胎发育阶段，并确保胚胎相对于盖玻片轴向的垂直取向，以保证谱系追踪的准确性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
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Title
0:34
C. elegans Embryo Sample Mounting Preparation
1:48
Dual-View Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM) Embryonic Imaging
3:12
Isotropic High-Resolution Volumetric Data: Cell Lineage Analysis
6:06
Results: Representative Cellular Identification and Single Cell Characterization of Neurite Outgrowth Dynamics
7:43
Conclusion
