亚细胞分辨率的各向同性光片显微镜及细胞自动动力学分析

在这里, 我们提出了一个组合方法, 使用高分辨率显微镜, 计算工具, 和单细胞标记在活的线虫胚胎, 以了解单个细胞动力学在神经发育过程中。

该协议能够有效地跟踪活胚胎中的细胞系系和身份，同时分析在开发C.elegans神经元时的详细细胞形态，如轴突和树突。与共体显微镜相比，双视图倒置选择性平面照明显微镜或二SPIM提供更高的噪声信号、更等向空间分辨率，更适合长期体内成像。首先将500微升1%甲基纤维素溶液加入凹凸显微镜幻灯片的凹陷中。

使用铂丝采摘，将成人从线虫生长介质板转移到M9甲基纤维素溶液中。使用18个量表皮下针的锐化尖端，将每个动物在中体横向切成至少一到四个细胞胚胎。用吸气器喉舌轻轻地在牙齿之间保持，用 10 到 15 微升的 M9 缓冲液预填充微胶囊移液器，然后轻轻地从滑入毛细管中吸出多个胚胎。

将胚胎分配到装满新鲜 M9 缓冲液的钢制成像室盖玻片的中心矩形中。垂直轻轻定向胚胎，使每个胚胎的长轴垂直于盖玻片的长轴。然后将钢成像室放入二期样品阶段的样品架中。

为准备胚胎成像，打开微管理器，将激光强度设置为 179 微瓦 0.5%等效 488 纳米和 79 微瓦 0.25% 等效 561 纳米。软件调整和真实激光输出之间的校准必须提前完成，以便设定特定微瓦的范围。在插件菜单中，选择设备控制和应用科学成像dSPIM打开应用科学成像双视图双视图选择性平面照明显微镜窗口。

在采集选项卡下，确认参数已设置为指示。在自动对焦选项卡下，设置指示参数。请注意，自动对焦通道应为计划的线对实验指定核荧光通道。

检查路径 A 或 B 的光束和纸张框，然后单击"实时"以开始图像采集。将打开实时视图窗口。然后围绕感兴趣的胚胎绘制一个框，选择胚胎的自动对焦分析区域，然后单击开始采集，以启动长期多维图像捕获。

对于图像查看、处理和细胞血统分析，下载并提取软件包后，双击 CytoSHOW_app. jnlp 文件即可开始运行 CytoSHOW。在文件菜单下，选择新的 diSPIM 监视器微管理器以查找保存原始微管理器映像的根数据集文件夹。

选择任何时间点文件夹，然后单击"打开"。对于 SPIM A 和 SPIM B，将自动打开多维导航窗口。对齐每个 SPIM 臂的绿色和红色通道，然后再次单击 diSPIM。

将在所有其他位置窗口中触发移位。接下来，单击 diSPIM 和保险丝打开去导引保险丝 diSPIM 原始数据卷对话框，并按指示设置参数。设置所有参数后，单击"是"并指定在其中保存已处理文件的输出目录，然后单击"确定"。在预览窗口中，将 t 滚动条移动到窗口的时间点 2，然后移动 z 滑块，直到直接沿胚胎的长轴显示视图。

将 t 滚动条移回预览窗口中的时间点 1，并使用线条选择工具通过 AB 细胞元相板的平面从腹体最圆核绘制一条线。单击 diSPIM 预览按钮，将微调保存到预览图像卷的方向。将 diSPIM 监视器窗口的 t 滚动条设置为要处理的完整图像跨度的起点和结束时间点。

然后单击"确定"。为了进行高效和准确的细胞系型分析，在星夜处理之前实现数据量的精确 ADL 方向至关重要。若要打开 AceTree 中的星夜血统跟踪系列，请打开提供的自定义 AceTree 文件，然后选择打开配置文件以查找以前指示的输出目录。打开感兴趣的胚胎的保险丝子文件夹并选择编辑的文件。

然后单击"打开"并继续进行前文所述的血统可视化和编辑。优化的协议不会诱导任何可检测的光毒性的胚胎，评估孵化的时间和时间相关的发育里程碑。使用这个协议，如证明，这种转基因绿色荧光蛋白表达线虫菌株的不明细胞被确定为对应于运动神经元，排泄管细胞和两个肌肉细胞。

已识别的神经元在受精后360分钟被斜形，更长的细胞轴代表神经外发育的后续轴。从受精后385分钟到410分钟，RMDD中性在细胞体前延伸约6微米。从415到445分钟后受精，两个中性都延伸到和周围的假定神经环。

平均而言，每个 RMDD neurite 从细胞体延伸约 11 微米，然后同步满足其在环顶点的反面对应物。综合起来，这些数据表明，单一可识别细胞的神经元发育特征能够使用这种集成协议进行检查、比较和量化。重要的是要记住垂直定向胚胎，使每个胚胎的长轴垂直于盖玻片的长轴。

利用这个协议，我们已经开始从各个角度探索新生的胚胎神经系统。例如，在细胞分娩、迁移和分化、神经石形成、生长和分膜。